CC BY
46
Химия растительного сырья. 2005. №1. С. 37-40.
УДК 615.322
РАЗРАБОТКА МЕТОДИК СТАНДАРТИЗАЦИИ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТОГО СБОРА «КАРДИЗИД»
© А.А. Марьин, Г.И. Калинкина
Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634004 (Россия) E-mail: mfandr@mail.ru
Оценку качества нового сердечно-сосудистого сбора «Кардизид» предложено проводить по флавоноидам. Разработаны методики качественного обнаружения флавоноидов в сборе методом тонкослойной хроматографии, количественного определения - методом дифференциальной спектрофотометрии. Экспериментально обоснованы условия извлечения и определения флавоноидов: экстрагент - 40% этанол, соотношение сырья и экстрагента - 1:50, время извлечения на кипящей водяной бане 45 мин. В качестве комплексообразователя использовали 2% раствор алюминия хлорида. Расчет суммы флавоноидов проводили в пересчете на рутин. Содержание суммы флавоноидов в образцах сбора составляет 1,93-2,03%.
Введение
На основании данных литературы и собственных исследований нами обоснована наиболее рациональная пропись нового лекарственного сердечно-сосудистого сбора «Кардизид», в состав которого вошли трава манжетки обыкновенной, корневища с корнями левзеи сафлоровидной, плоды боярышника, трава зизифоры клиноподиевидной, плоды аронии черноплодной. В предложенном сборе нами обнаружен комплекс биологически активных веществ, среди которых преобладают фенольные соединения. Особую значимость в формировании фармакологических эффектов (гипотензивного, гемореологического, капилляропротекторного, гиполипидемического, кардиотонического) сбора «Кардизид» имеют флавоноиды [1]. Кроме того, оценка качества основных компонентов сбора (трава манжетки обыкновенной, плоды боярышника, плоды аронии черноплодной) проводится по содержанию флавоноидов. Поэтому стандартизацию сердечно-сосудистого сбора нами предложено проводить именно по этой группе биологически активных веществ.
Целью настоящего исследования является разработка методик стандартизации сердечно-сосудистого сбора «Кардизид».
Экспериментальная часть
Материалы исследования: для разработки методик стандартизации использовали 5 образцов сбора «Кар-дизид», приготовленного из различных партий стандартизованного лекарственного растительного сырья, собранного в фазу цветения и плодоношения в 2002 г. в различных районах Сибири. Сырье упаковывали и хранили в соответствии с требованиями нормативной документации (ОСТ 43-3-84, ГОСТ 6077-80 и ГФ XI).
Методики качественного обнаружения флавоноидов в сборе «Кардизид». Для качественного обнаружения флавоноидов 1,0 г сбора «Кардизид» помещали в широкогорлую колбу, заливали 30 мл 40% этанола и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 10 минут. Извлечение охлаждали, фильтровали через вату и хроматографировали.
0,02 мл спиртового извлечения сбора микропипеткой или микрокапилляром наносили на линию старта пластинки Merck Kieselgel 60 F254 размером 7x15 см в виде точки, рядом наносили в виде точек 0,005 мл
* Автор, с которым следует вести переписку.
раствора достоверного образца рутина, 0,005 мл кверцетина и 0,005 мл раствора гиперозида. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 5 мин, затем помещали в камеру (предварительное насыщение камеры не менее 1 ч), с системой растворителей хлороформ - метанол (3 : 1) и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей проходил 12 см, пластинку вынимали из камеры, высушивали в вытяжном шкафу в течение 10 мин и просматривали в УФ-свете при длине волны 360 нм [2]. На уровне пятен достоверных образцов кверцетина (Я^ » 0,03), гиперозида ^ » 0,35) и рутина (Я^ »
0,47) обнаруживали пятна желто-зеленого, коричнево-бурого и коричневого цвета соответственно. Затем пластинку опрыскивали 5% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревали ее в течение 2-3 мин в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С. При этом все пятна приобретали бледно-желтую окраску в видимом и яркую лимонно-желтую окраску в УФ-свете. На хроматограмме присутствовали пятна и других фенольных соединений.
Для количественного определения флавоноидов в сборе нами предлагается методика, основанная на их способности образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором алюминия хлорида, который вызывает батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения и при этом дает основной максимум поглощения при длине волны 410 нм [3]. Аналогичный максимум поглощения при длине волны 410 нм отмечен для комплекса государственного стандартного образца (ГСО) рутина, использованного нами в методике в качестве стандартного образца (рис.).
При разработке методики анализа отрабатывали степень измельчения сырья, условия экстракции, время комплексообразования, в качестве экстрагента использовали воду очищенную и этанол различной концентрации (табл. 1).
В результате проведенных исследований было установлено, что наиболее полное извлечение целевых веществ достигается при соотношении сырья и экстрагента 1: 50 (дальнейшее увеличение этого соотношения не приводит к повышению выхода флавоноидов из сырья). Для экстракции использовался 40% этанол, который позволяет наиболее полно извлечь флавоноиды из сырья.
Максимальное извлечение флавоноидов из сырья происходило при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин.
Оптимальный размер частиц сбора, обеспечивающий максимальный выход флавоноидов, составляет 1 мм.
Спектры комплексов флавоноидов сбора и раствора рутина с алюминия хлоридом
Таблица 1. Определение оптимальных условий извлечения суммы флавоноидов из сбора «Кардизид»
Условия экстракции № образца
1 2 3 4 5
Измельченность сырья, мм 1 2,08 2,12 2,06 1,98 1,88
6 1,15 1,64 1,28 1,87 1,72
Экстрагент Вода 1,39 1,48 1,51 1,32 1,20
40% этанол 2,15 1,97 2,02 2,62 2,17
50% этанол 2,07 1,95 1,99 2,13 1,46
70% этанол 1,91 1,84 1,98 1,92 1,74
Соотношение сырья и экст- 1:30 1,98 1,94 2,06 2,02 2,12
рагента 1:100 1,92 1,83 1,90 1,62 1,80
1:200 1,87 1,85 1,94 1,84 1,97
Температурный режим, во- 30 1,71 1,66 1,58 1,52 1,70
дяная баня, °С 60 1,88 2,09 1,97 2,00 1,73
90 1,93 2,16 2,04 2,14 2,17
Время экстрагирования, мин 30 1,84 1,79 1,95 1,97 1,73
45 1,89 2,01 2,11 2,12 2,24
60 1,97 2,09 1,89 2,05 1,86
90 2,02 1,82 1,98 2,14 2,07
Время комплексообразова- 10 1,69 1,52 1,63 1,60 1,54
ния, мин 20 1,81 1,76 1,86 1,80 1,79
40 2,06 1,89 1,99 2,02 2,07
60 1,94 1,89 1,90 2,01 2,04
При определении оптимального количества 2% раствора алюминия хлорида, используемого в качестве комплексообразующего реагента, установлено, что наиболее стабильные результаты получаются при соотношении экстракта и раствора комплексообразователя 1 : 1.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в сборе «Кардизид». Аналитическую пробу сбора измельчали до размера частиц, проходящих через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1,0 (т. н.) измельченного сбора помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 30 мл 40% этанола. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сбора со стенок. Горячее извлечение профильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу на 50 мл так, чтобы частицы сбора не попадали на фильтр. Затем сырье ополаскивали 20 мл 40% этанола и извлечение фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу. После охлаждения объем доводили 40% этанолом до метки и перемешивали (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещали 2 мл раствора алюминия хлорида в 95% спирте, 2 мл раствора А и доводили объем раствора 40% спиртом до метки. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2 мл раствора А, доведенного 40% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряли оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухой сбор в % (Х) вычисляли по формуле
В ■ т 0 • 2 • 100 • 100
Х =-----------------------,
В 0 ■ т ■ (100 - Ж)
где Б - оптическая плотность испытуемого раствора; Б0 - оптическая плотность ГСО рутина; т - масса сбора, г; то- масса ГСО рутина, г; W - влажность сбора, %.
Приготовление раствора ГСО рутина: около 0,0125 (т.н.) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 часов, растворяли в 95% спирте в мерной колбе на 25 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали, доводили объем раствора до метки 95% спиртом и перемешивали.
Приготовление 1% раствора алюминия хлорида в 95% этаноле. 1,0 г хлорида алюминия (ГОСТ 375975, ЧДА) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 95% этаноле и доводили объем раствора тем же растворителем до метки. Срок хранения реактива - 3 месяца.
Содержание суммы флавоноидов в образцах сбора колебалось от 1,93 до 2,03% (табл. 2). Для нормативной документации норма содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин может составлять не менее 1,5%. Результаты статистической обработки полученных данных показали, что относительная ошибка определения при доверительной вероятности 95% находится в пределах ± 0,31. Ошибка методики составляет 4,52% (табл. 3).
Таблица 2. Содержание флавоноидов
в образцах сбора «Кардизид»
№ образца Содержание, %
1 1,93
2 1,98
3 2,03
4 1,97
5 2,02
Таблица 3. Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы флавоноидов в сборе «Кардизид»
f X S2 S P,% Vf) ±ДХ E,%
5 1,98 0,12 0,32 95,00 2,57 0,31 4,52
Заключение
Таким образом, разработанные методики качественного обнаружения и количественного определения суммы флавоноидов могут быть использованы для оценки качества предложенного нами сердечнососудистого сбора «Кардизид» и включены в соответствующую нормативную документацию.
Список литературы
1. Марьин А.А., Калинкина Г.И., Плотников М.Б., Алиев О.И., Васильев А.С. Возможности создания новых фитосредств для терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Сборник трудов по материалам 59-й науч. конф. по фармакологии и фармации. Пятигорск, 2004.С. 293.
2. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Раститительные ресурсы. 1965. Т. 1. Вып. 4. С. 591-596.
3. Компанцева Е.В. Идентификация и количественное определение флавоноидов в многокомпонентном лекарственном средстве кардиотонического действия // Фармация. 2000. №1. С. 40-41.
Поступило в редакцию 25 марта 2005 г.
