Исследование бесклеточных фракций Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп на наличие гидролаз разных подклассов методом радиальной энзимодиффузии в агаровом геле Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

MIRJournal

MicrobioLogy Independent Research JournaL

DOI: 10.18527/2500-2236-2023-10-1-100-109.RU ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ СТАТЬЯ

Исследование бесклеточных фракций Vibrio cholerae Ol и O139 серогрупп на наличие гидролаз разных подклассов методом радиальной энзимодиффузии в агаровом геле

С. Н. Козлов* , Е. Ю. Марков , В. Б. Николаев , Л. Я. Урбанович , Л. В. Миронова

Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора, ул. Трилиссера, 78, г. Иркутск, 664047 Россия

АННОТАЦИЯ

Проведено исследование препаратов бесклеточных фракций, полученных из 58 генетически гетерогенных штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп разной эпидемической значимости и происхождения на наличие гидролаз разных подклассов в реакции энзимодиффузии в агарозных гелях с различными субстратами. По результатам анализа выявлены статистически достоверные различия в активности ферментов в зависимости от происхождения и эпидзначимости исходных штаммов. Установлено, что препараты, полученные из нетоксигенных штаммов, отличаются повышенной активностью протеаз и хитинолитических ферментов, а у препаратов из токсигенных штаммов отмечена высокая активность муциназ, липолитических ферментов и нуклеаз. Эти данные могут найти применение в микробиологической диагностике холеры в рамках дополнительной биохимической характеристики штаммов холерных вибрионов и могут внести вклад в понимание роли ферментов в процессах патогенеза и адаптации возбудителя холеры.

Ключевые слова: гидролазы, реакция радиальной энзимодиффузии (РЭД), Vibrio cholerae, агарозный гель # Автор, ответственный за переписку: Козлов Станислав Николаевич, научный сотрудник биохимического отдела Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора, ул. Трилиссера, 78, г. Иркутск, 664047 Россия, e-mail: ejimei@mail.ru

Цитирование: Козлов СН, Марков ЕЮ, Николаев ВБ, Урбанович ЛЯ, Миронова ЛВ. Исследование бесклеточных фракций Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп на наличие гидролаз разных подклассов методом радиальной энзимодиффузии в агаровом геле. MIR J 2023; 10(1), 100-109. doi: 10.18527/2500-2236-2023-10-1-100-109.RU. Получена: 7 августа 2023 Принята к печати: 31 октября 2023 Опубликована: 24 ноября 2023

Авторские права: © 2023 Козлов и др. Эта статья публикуется в свободном доступе в соответствии с лицензией Creative Commons AttributionNonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BY-NC-SA), которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любых носителях при условии, что указываются автор и источник публикации, а материал не используется в коммерческих целях.

Финансирование: Исследование выполнено в рамках бюджетного финансирования. Конфликт интересов: Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

Detection of hydrolases of different subclasses in cell-free fractions of Vibrio cholerae Ol and O139 serogroups using radial enzymatic diffusion in agar gel

Stanislav N. Kozlov* , Evgeny Yu. Markov , Valery B. Nikolaev , Lyudmila Ya. Urbanovich Lylia V. Mironova

Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and the Far East, 78 Trilissera str., Irkutsk, 664047 Russia

ABSTRACT

The presence of hydrolases of different subclasses was determined in preparations of cell-free fractions obtained from 58 genetically heterogeneous strains of Vibrio cholerae O1 and O139 serogroups of different epidemic significance and origin using enzyme diffusion reaction in agarose gels with various substrates. The results of the analysis revealed statistically significant differences in enzyme activity depending on the origin and epidemiological significance of the original strains. We found that preparations obtained from non-toxigenic strains have increased activity of proteases and chitinolytic enzymes, while those from toxigenic strains show high activity of mucinases, lipolytic enzymes and nucleases. These data can find application in the microbiological diagnosis of cholera as additional biochemical characterization of Vibrio cholerae strains as well as contribute to understanding the role of enzymes in the processes of pathogenesis and adaptation of the cholera pathogen.

Keywords: hydrolase, radial enzyme diffusion reaction, Vibrio cholerae, agarose gel

"For correspondence: Stanislav Nikolaevich Kozlov, researcher, biochemical Department, Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and the Far East, 78 Trilissera str., Irkutsk, 664047 Russia, e-mail: ejimei@mail.ru

Citation: Kozlov SN, Markov EYu, Nikolaev VB, Urbanovich LYa, Mironova LV. Detection of hydrolases of different subclasses in cell-free fractions of Vibrio cholerae O1 and O139 serogroups using radial enzymatic diffusion in agar gel. MIR J 2023; 10(1), 100109. doi: 10.18527/2500-2236-2023-10-1-100-109.RU. Received: August 7, 2023 Accepted: October 31, 2023 Published: November 24, 2023

Copyright: © 2023 Kozlov et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International Public License (CC BYNC-SA), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, as long as the material is not used for commercial purposes, provided that the original author and source are cited. Funding: The study was carried out within the framework of budgetary funding. Conflict of interests: The authors are declaring no conflicts of interest.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема холеры остается актуальной на мировом уровне в связи с продолжающимся пандемическим распространением этой инфекции в большинстве стран мира. Это обстоятельство диктует необходимость всестороннего изучения возбудителя холеры, в частности гидролитических ферментов его поверхностных структур, поскольку они первоначально взаимодействуют с клетками макроорганизма. Гидролазы Vibrio cholerae остаются недостаточно изученными и охарактеризованными, кроме того, в литературе отсутствуют сведения о преобладании активности тех или иных

гидролитических ферментов в зависимости от эпидзначимости и происхождения штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп. Известно, что наличие некоторых гидролитических ферментов может обеспечивать их персистенцию в объектах окружающей среды [1, 2, 3]. В настоящее время велик спрос на надёжные, быстрые и недорогие методы обнаружения гидролитических ферментов, пригодные для обследования разных биологических образцов, включая патогенные бактерии. Одним из таких экспрессных и наглядных методов, не требующих предварительного препаративного

выделения ферментов, является реакция радиальной энзимодиффузии (РЭД) [4], которая представляет собой неэлектрофоретический вариант зимографических методов, и поэтому широко используется для определения наличия и количественной оценки суммарной активности гидролитических ферментов в анализируемых биопрепаратах. В основном реакция РЭД выполняется путём помещения образца, содержащего фермент, в прямой контакт с субстратом, растворенным или суспендированным в агаровом или агарозном гелях. При диффузии фермента из лунок в гель по прошествии определённого времени происходит ферментативная реакция, об интенсивности которой судят по наличию зон гидролиза (в виде просветления, или помутнения, окрашивания и т. п.), указывающих на потерю субстрата или появление продуктов ферментативной реакции. В ряде случаев (при использовании суспензий) агарозный гель с субстратом относительно непрозрачен, поэтому зону просветления можно наблюдать без окрашивания. В качестве альтернативы об активности можно судить после кислотного осаждения или после добавления красителя, специфичного для данного субстрата. Образовавшиеся таким образом после инкубации зоны просветления, помутнения или окрашивания и их размер можно использовать как для подтверждения действия определённого фермента, так и для оценки его активности. Теоретически реакцию РЭД можно использовать для определения активности любого фермента при условии, что реакцию «фермент-субстрат» можно визуально контролировать. Однако на практике метод в основном используется для анализа гидролитических ферментов [1]. РЭД - это удобный полуколичественный метод, который не требует дорогостоящего оборудования и пригоден для исследования как разбавленных, так и концентрированных растворов ферментов в малых объёмах. Его можно использовать для анализа образцов неочищенных ферментов, причём на него не влияют ни мутность, ни вязкость растворов последних [1]. В доступной литературе сведений об активности гидролаз разных подклассов методом РЭД у штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп разной эпидзначимости недостаточно, что обуславливает исследование по данной проблеме.

Цель работы состояла в исследовании препаратов бесклеточных фракций штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп разной эпидемической значимости и происхождения на наличие гидролаз, относящихся к разным подклассам в реакции энзимодиффузии

в агарозных гелях, содержащих соответствующие субстраты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали бесклеточные фракции (препараты мочевинных экстрактов, препараты наружных мембран, препараты супернатантов культуральной жидкости), полученные из клеток 58 генетически гетерогенных штаммов холерных вибрионов, из которых 23 - токсигенных, изолированных от больных холерой и объектов окружающей среды (ООС) во время вспышек холеры, и 35 нетоксигенных штаммов, выделенных из поверхностных водоёмов в период эпидемиологического благополучия по холере. Из них 11 клинических токсигенных штаммов 01 серогруппы (от больных), 1 штамм классического биовара, 12 нетоксигенных штаммов. Из штаммов 0139 серогруппы исследовано 5 штаммов, из которых 3 - клинические токсигенные и 2 - водные нетоксигенные. Бактерии культивировали на агаре Хоттингера (рН 7.6). Суточную культуру каждого штамма вибриона, выращенного при 37°С, смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР). С целью одновременного лизиса и обеззараживания бактериальную массу (в концентрации 109 микробных клеток (м. к.) в 1.0 мл) обрабатывали стерильным 9 М раствором мочевины в соотношении 1:1 в течение одних суток при комнатной температуре и проводили бактериологический контроль специфической стерильности полученного материала в соответствии с «Инструкцией по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов» (Саратов, 1982). Полученные лизаты подвергали дифференциальному центрифугированию с выделением мочевинных экстрактов (МЭ) и наружных мембран (НМ) с последующим диализом и лиофильным высушиванием [5]. Для получения препаратов супернатантов культуральной жидкости (СКЖ) холерные вибрионы первоначально выращивали на щелочном мясопептонном агаре (рН 7.6) при 37°С в течение 24 ч. Суточную культуру смывали физиологическим раствором и засевали во флаконы с мясопептонным бульоном (рН 7.6) в концентрации 108 м.к./мл. После двухчасовой инкубации при комнатной температуре во флаконы для стерилизации засеянной культуры добавляли мертиолят натрия в концентрации 0.01% и бактериальную суспензию выдерживали на холоде в течение двух суток. После контроля

и подтверждения специфической стерильности суспензию центрифугировали при 10000 об/мин. Получившийся супернатант бесклеточной жидкости подвергали диализу и лиофильному высушиванию. Образцы для зимографического исследования получали суспендированием лиофилизированных препаратов субклеточных фракций и СКЖ в ЗФР в концентрации 4 мг/мл по белку.

Выявление гидролаз осуществляли с помощью реакции РЭД в 1-1.5% агарозном геле, содержащем для выявления протеаз - желатин, бычий сывороточный альбумин (БСА), иммуноглобулины человека класса G; для выявления липолитических ферментов - Tween-20, Triton X-305 (Sigma-Aldrich, США); для выявления хитинолитических ферментов - гликольхитозан, коллоидный хитин и пептидогликан; для выявления нуклеаз применяли дрожжевую РНК; для выявления муциназ использовали коммерческий препарат муцина; для выявления лецитиназ использовали яичный лецитин; для выявления сульфатаз использовали альгинат натрия и додецилсульфат натрия в 0.5%-й конечной концентрации, взятых в качестве субстратов для обнаружения соответствующих ферментов.

Агарозные гели после суточной инкубации обрабатывали 10%-м раствором трихлоруксусной кислоты (в случае использования белковых субстратов), в случае использования небелковых субстратов окрашивали водным раствором Люголя, содержащим 1% йода и 2% йодида калия, 5%-м раствором серной кислоты, 5%-м раствором хлористого кальция в 70%-м этаноле и 0.02%-м метиленовым синим. О наличии гидролитической активности судили по образованию зон просветления вокруг лунок в агарозных гелях с использованием опытных и контрольных образцов. В качестве положительных контролей применяли разбавленные растворы ферментов, а в качестве отрицательных - дистиллированную воду, физиологический раствор, растворы инертных белков (бычий сывороточный и яичный альбумины, протаминсульфат). Липолитическую активность оценивали по появлению матовых ореолов - зон липолиза субстрата в виде «колец Сатурна», так называемым «гало» вокруг лунок. Степень гидролиза (зоны просветления, помутнения) определяли по размеру зоны гидролиза от наружного края лунки до окружности зоны просветления (помутнения) в миллиметрах.

Степень активности препаратов оценивали по четырёхкрестной системе, где за + условно принимали размер зоны гидролиза 1-2 мм, ++ - 3-4 мм,

+++ - 5-6 мм, ++++ соответствовало размеру зоны гидролиза 7-8 мм и выше. Статистическую обработку данных осуществляли с определением средних величин, их квадратичных отклонений, стандартной ошибки средних показателей в программе Statistica 7.0 для Windows 10. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0.05 (p<0.05) по отношению к контролю (положительный и отрицательный контроли).

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЭД-тесты в агарозных гелях, содержащих желатин, БСА и человеческий иммуноглобулин G, показали, что все бесклеточные фракции взятых в работу штаммов холерного вибриона обладают протеазной активностью разной степени интенсивности. Статистически достоверно установлено, что препараты, полученные из нетоксигенных штаммов отличаются большей протеолитической активностью, чем токсигенные: средний размер зон гидролиза у них составляет 7.50±0.02 мм (p<0.05), а у препаратов из токсигенных штаммов - 2.60±0.03 мм (рис. 1А), то есть все препараты из нетоксигенных штаммов отличались большей протеолитической активностью, чем токсигенные.

При использовании в РЭД в качестве субстрата иммуноглобулинов человека класса G установлено, что все препараты МЭ обладают IgG-деградирующей активностью разной степени интенсивности, что выражается в неодинаковых размерах зон гидролиза: у токсигенных он составляет 3.00±0.03 мм, а у нетоксигенных - 1.00±0.03 мм (p<0.05) (Рис. 1Б). Отсутствие зоны гидролиза иммуноглобулина G при использовании трипсина в качестве положительного контроля обусловлено природной устойчивостью молекул иммуноглобулинов к действию протеолитических ферментов [5]. При сравнении общей гидролитической активности в отношении белковых субстратов (желатина, казеина, протаминсульфата, IgG, БСА) между бесклеточными фракциями и препаратами СКЖ отмечена высокая активность последних (9.00±0.04 мм, p<0.05), наибольшей активностью отличались препараты преимущественно нетоксигенных штаммов, что свидетельствует о большей активности секретируемых ферментов. Отмечены различия протеолитической активности между токсигенными штаммами O1 серогруппы и O139 серогруппы; так, у препарата МЭ V. cholerae El Tor O1 1263 (ctx+) размер зоны гидролиза желатина был 8.00±0.03 мм, в то время как у МЭ V. cholerae

Рис. 1. Реакция РЭД препаратов бесклеточных фракций V. cholerae O1 El Tor и O139 серогрупп в 1 % агарозном геле. А. Гель содержит в качестве субстрата 0.5% раствора желатина: 1 - Трипсин (К+); 2 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor M-878 (ctx+); 3 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor 129-05-B (ctx-); 4 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor И-638 (ctx-); 5 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor И-680 (ctx-); 6 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor И-1263 (ctx+); 7 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor И-1300 (ctx+); 8 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor И-1334 (ctx+); 9 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor И-1368 (ctx-); 10 - СКЖ V. cholerae O1 El Tor 2-01 (ctx-); 11 - СКЖ V. cholerae O139 И-12 (ctx*); 12 - СКЖ V. cholerae O139 И-16 (ctx'). Б. Гель содержит иммуноглобулины человека класса G: 1 - Трипсин (К*); 2 - МЭ V. cholerae O1 И-1263 (ctx*); 3 - МЭ V. cholerae O1 И-1368 (1 мг/мл) (ctx'); 4 - МЭ V. cholerae O1 1291 (ctx'); 5 - МЭ V. cholerae O1 129-05-B (ctx'); 6 - МЭ V. cholerae O139 И-16 (4 мг/мл) (ctx-); 7 - МЭ V. cholerae O139 И-16 (1 мг/мл) (ctx'); 8 - МЭ V. cholerae O1 М-878 (ctx*); 9 - МЭ V. cholerae O139 И-16 (1 мг/ мл) (ctx-); 10 - МЭ V. cholerae O1 И-1368 (4 мг/мл) (ctx-); 11 - МЭ V. cholerae O1 И-1369 (ctx-); 12 - МЭ V. cholerae O1 2131 (ctx-); 13 - МЭ V. cholerae O1 2-01 (ctx'); 14 - dH2O (К-).

El Tor O1 И-1337 (ctx*) он составлял 2.50±0.03 мм. У препарата МЭ V cholerae O139 И-12 (ctx*) он составил 3.00±0.03 мм, в отличие от МЭ V. cholerae O139 И-16 (ctx-) (6.00±0.03 мм). Протеолитическая активность большинства препаратов НМ холерных вибрионов обоих серогрупп оказалась ниже по сравнению с препаратами МЭ и СКЖ и составила в среднем 1.50±0.03 мм. Максимальную липолитическую активность в отношении Tween-20 проявили МЭ и НМ нетоксигенных штаммов O1 серогруппы, размер «гало» которых составлял 7.00±0,04 мм и 2.50±0.03 мм соответственно. Однако в отношении Triton X-305 препараты МЭ токсигенных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп показали высокую активность: 8.00±0.03 мм и 5.00±0.03 мм (p<0.05) (Рис. 2А). При изучении активности хитиназ установлено, что препараты бесклеточных фракций и СКЖ из нетоксигенных штаммов обладают большей активностью, чем из клинических токсигенных штаммов, зоны гидролиза коллоидного хитина которых составляют

6.00±0.04 мм (нетоксигенные) и 2.00±0.04 мм (токсигенные) при р<0.05 (Рис. 2Б). Наибольшей лецитиназной активностью отличаются препараты наружных мембран и препараты СКЖ, полученные из токсигенных штаммов, размер зон гидролиза которых составляет (4,6 ±0,03) мм, у нетоксигенных он в среднем составил (1,0±0,04) мм.

Суммарно результаты изучения гидролазной активности препаратов, полученных из штаммов V. с^1егае разной эпидзначимости представлены в таблице, где ++++ - высокая активность, +++ -средняя активность, ++ - умеренная активность, + -низкая активность.

При постановке РЭД-тестов на альгинат-лиазную и сульфатазную активности при проявлении агарозных гелей раствором Люголя наблюдаются зоны просветления (5.80±0.03 мм) вокруг лунок с препаратами субклеточных фракций и СКЖ, полученных из токсигенных штаммов, в то время, как у нетоксигенных радиус зон просветления в среднем составляет 3.00±0.04 мм, при

А

Рис. 2. Реакция РЭД препаратов субклеточных фракций V. cholerae O1 El Tor и O139 серогрупп в 1%-м агарозном геле, содержащем в качестве субстрата 5% раствор Тритона X-305. А. Реакция на липолитическую активность: 1 - ЗФР (К-); 2 - МЭ V. cholerae O1 1263 (ctx*); 3 - МЭ V. cholerae O1 M-878 (ctx*); 4 - МЭ V. cholerae O1 2-01 (ctx-); 5 - МЭ V. cholerae O1 И-1369 (ctx-); 6 - МЭ V. cholerae O1 2131 (ctx-); 7 -МЭ V. cholerae O1 1291 (ctx-); 8 - МЭ V. cholerae O1 И-1369 (ctx-); 9 - НМ V. cholerae O1 И-1407 (ctx-); 10 - МЭ V. cholerae O139 И-12 (ctx*); 11 - НМ V. cholerae O1 El И-638 (ctx-); 12 - НМ V. cholerae О139 И-16 (ctx-); 13 - МЭ V. cholerae O1 И-1361 (ctx-); 14 - МЭ V. cholerae O1 И-1299 (ctx'); 15 - МЭ V. cholerae O1 M 800 (ctx*); 16 - МЭ V. cholerae O1 И-1334 (ctx*). Б. Реакция 0.5%-го коллоидного хитина на хитиназную активность: 1 - ЗФР (К-); 2 - МЭ V. cholerae И-1337 (ctx*); 3 - НМ V. cholerae И-1337 (ctx*); 4 - МЭ V. cholerae И-1334 (ctx*); 5 - НМ V. cholerae И-1263 (ctx*); 6 - МЭ V. cholerae И-1298 (ctx*); 7 - МЭ V. cholerae И-1300 (ctx*); 8 - МЭ V. cholerae И-1369 (ctx-); 9 - МЭ V. cholerae И-1368 (ctx-); 10 - МЭ V. cholerae И-638 (ctx-); 11 - МЭ V. cholerae И-1330 (ctx*); 12 - МЭ V. cholerae 129-05-B (ctx-); 13 - МЭ V. cholerae O1 2-01 (ctx-); 14 - буфер Tris HCl (pH 7.6); 15 - dH2O (К-).

сравнении с отрицательными контролями (ЗФР и прокипячённые образцы), а также с образцами, куда был добавлен водный раствор 5% С^04 для ингибирования гидролаз (зоны просветления отсутствуют) (Рис. 3А, Б).

Интересно отметить факт быстрого обесцвечивания агарозного геля и исчезновения зон просветления через 10-15 мин после окраски гелей и появление этих зон на агарозном геле вообще без субстрата. При проявлении 0.02%-м раствором метиленового синего на наличие альгиназной и сульфатной активности возле лунок с опытными образцами формировались зоны просветления. Они также формировались возле лунок с инертными белками лизоцимом и БСА. Параллельно в отрицательных контролях - в лунках с дистиллированной водой и панкреатической липазой - зон просветления не было. При проявлении чашки с альгинатом натрия 5%-м раствором СаС12 зоны просветления появились в лунках с препаратами бесклеточных фракций из

токсигенных клинических штаммов и отсутствовали в лунках с отрицательными контролями с ЗФР, БСА и протамин сульфатом (Рис. 3Б). Аналогичная картина (зоны просветления) наблюдалась без добавления в агарозу альгината натрия и додецилсульфата натрия. При добавлении в агар, как с альгинатом натрия, так и без него, раствора 2N Н2Б04 для осаждения материала видимых изменений на поверхности агара (появления «просветлений») не наблюдали, что свидетельствует о неспецифичности протекающих реакций.

Однако при постановке реакции РЭД в 1%-й агарозе с применением в качестве образцов-контролей L-цистеина ^еапа1, Венгрия), овальбумина и глутатиона ^еапа1, Венгрия), являющихся донорами водорода тиольных ^И-) групп, и последующей окраской после инкубации чашек раствором Люголя наблюдали зоны просветления по сравнению с отрицательным контролем (буфер), что свидетельствует о протекании окислительно-восстановительных

А

Рис. 3. Реакция РЭД препаратов бесклеточных фракций V. cholerae Ol El Tor и O139 серогрупп в 1%-м агарозном геле, содержащем в качестве субстрата 0.5%-й раствор альгината натрия. А. Последующее проявление геля раствором Люголя: 1 - ЗФР (К-); 2 - СКЖ V. cholerae И-1263 (ctx*); 3 - СКЖ V. cholerae И-1299 (ctx-); 4 - СКЖ V. cholerae О139 59 Din (ctx*); 5 - СКЖ V. cholerae Ol 1296 (ctx-); 6 - МЭ V cholerae O1 И-1407 (ctx-); 7 - МЭ V cholerae O1 1298 (ctx*); 8 - МЭ V. cholerae O1 И-638 (c&r); 9 - МЭ V cholerae O1 И-1337 (ctx*); 10 - МЭ V cholerae O1 2-01 (ctx'); 11 - МЭ V cholerae O1 И-1330 (ctx*); 12 - МЭ V cholerae O1 M-878 (ctx*); 13 - МЭ V cholerae O1 И-1334 (ctx*); 14 - БСА (К-); 15 - раствор протамин сульфата (К-). Б. Последующее проявление 5%-м раствором CaCl2: 1 - ЗФР (К-); 2 - МЭ V. cholerae И-1337 (ctx*); 3 - НМ V cholerae 1298 (ctx*); 4 - МЭ V cholerae И-1300 (ctx*); 5 - МЭ V cholerae 217-N-16 (ctx'); 6 - МЭ V cholerae 1298 (ctx*); 7 - МЭ V. cholerae 2-01 (ctx'); 8 - НМ V cholerae 2-01 (ctx'); 9 - МЭ V cholerae И-680 (ctx'); 10 - МЭ V cholerae И-1369 (ctx-); 11 - МЭ V. cholerae 1291 (ctx-); 12 - МЭ V. cholerae 2131 (ctx-); 13 - МЭ V. cholerae O139 И-16 (ctx-); 14 - БСА (К-); 15 -раствор протамин сульфата (К-).

Рис. 4. Реакция РЭД инертных белков и препарата МЭ V. cholerae И-1263 на 1% агарозе. Проявление агарозного геля проводили раствором Люголя. 1 - раствор 0.05 М Tris фосфатного буфера, pH 7.6 (К-); 2 - раствор L-цистеина (исходный); 3 - раствор овальбумина; 4 - раствор глутатиона; 5 - раствор БСА; 6 - МЭ V. cholerae И-1263.

Б

Таблица. Суммарная активность препаратов бесклеточных фракций V. cholerae О1 и О139 серогрупп

Штаммы Протеазная активность Липазная активность (гидролиз Тритон Х-305) Хитиназная активность Лецитиназная активность Муциназная активность

Токсигенные штаммы ++ ++++ + ++++ ++++

Нетоксигенные штаммы ++++ + ++++ + +

реакций, в результате которых происходит обесцвечивание зоны вокруг лунок (Рис. 4). Это прямо указывает на непригодность использования раствора Люголя для выявления агаразной, альгиназной и сульфатазной активностей.

ОБСУЖДЕНИЕ

РЭД-тесты обследованных препаратов бесклеточных фракций (МЭ, НМ, СКЖ) показали наличие и статистически достоверную разницу активности гидролаз разных подклассов у препаратов, полученных из штаммов V. с^1егае 01 и 0139 серогрупп разной эпидемической значимости и происхождения - протеаз, хитиназ (преобладание у нетоксигенных штаммов) и лецитиназ, муциназ и липаз (у токсигенных). Обнаружены статистически достоверные межштаммовые различия в степени их активности (размер радиуса зон гидролиза субстрата) при однотипности методик обнаружения. Анализ многочисленных данных литературы показал, что патогенность холерного вибриона и способность его к персистенции в ООС является полидетерминантным, слагающемся из целого ряда факторов и их комбинаций признаком, однако на настоящий момент не все факторы одинаково хорошо изучены. Одним из таких факторов являются гидролитические ферменты - такие, как муциназа и гемагглютинин/протеаза. Они участвуют в деструкции муцина эпителия тонкого кишечника, способствуя дальнейшему распространению холерных вибрионов и усилению связывания холерного токсина с эпителием кишечника, а также гидролизуют такие антимикробные белки, как фибронектин, лактоферрин, овомуцин и секреторный иммуноглобулин sIgA, являющийся фактором локального иммунитета макроорганизма (человека) [6]. Гемагглютинин/протеаза инактивирует СТХф (умеренный филаментозный фаг V. с^кгае, несущий гены ЛхАБ холерного токсина), предотвращая фаговое инфицирование холерного вибриона. Это позволяет ему выживать в разных экосистемах. Разрушение гликопротеиновых матрикс яиц хирономид, являющихся резервуаром

холерных вибрионов разных серогрупп, позволяет вибрионам персистировать в их личинках, что объясняет отсутствие в межэпидемический период вспышек холеры (в неблагоприятных условиях). Наличие хитиназ позволяет холерному вибриону адгезироваться на хитинсодержащих субстратах в окружающей среде, используя их как источник углерода и энергии, что также имеет значение в процессах персистенции. Тогда обнаруженная повышенная хитинолитическая активность нетоксигенных штаммов по сравнению с токсигенными свидетельствует о ее вкладе в адаптационно-приспособительный потенциал нетоксигенных изолятов, выделенных из ООС. Более высокая способность препаратов, приготовленных из нетоксигенных штаммов вибриона El Tor O1 и из токсигенных штаммов холерного вибриона O139 серогруппы, к гидролизу субстратов, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты (Tween-20), может быть обусловлена преобладанием в препаратах указанных штаммов эстераз. Более высокая активность препаратов МЭ из токсигенных штаммов в отношении Triton X-305, в состав которых входят длинноцепочечные жирные кислоты, можно связать с действием липаз. Обнаруженные различия в липолитической активности препаратов в отношении используемых субстратов отражают индивидуальные свойства исследованных штаммов и связаны как с разным составом липолитических ферментов, так и с удельной активностью полученных из них препаратов и чувствительностью к факторам внешней среды и в целом демонстрируют интенсивность липидного обмена микробной клетки. Кроме того, более высокая активность липаз, лецитиназ и муциназ у препаратов из токсигенных штаммов может свидетельствовать об их вкладе в патогенный потенциал исходных штаммов. Прослеживается также зависимость степени активности обнаруженных гидролаз в РЭД-тестах от токсигенности исходных штаммов, что может быть использовано для дополнительной фенотипической характеристики штаммов в отношении их потенциальной эпидзначимости и персистентного потенциала. Таким образом, реакция РЭД является

подходящим методом для скрининга препаратов бесклеточных фракций холерного вибриона на наличие гидролитических ферментов разных подклассов. При использовании таких проявителей, как растворы йода и метиленового синего, для детекции альгинат-лиазной и сульфатазной активности возникновение таких артефактов, как быстрое появление и исчезновение зон «просветления», их появление на агарозном геле без субстрата и формирование их у лунок с некоторыми инертными белками и аминокислотами (БСА, протаминсульфат, L-цистеин), можно объяснить результатом окислительно-восстановительных реакций молекулярного йода, входящего в состав раствора Люголя, и метиленового синего с SH-группами белков анализируемых препаратов [7, 8]. Входящие в состав аминокислотцистеинаи метионина, трипептида глутатиона и многочисленных белков тиольные группы, способные к окислению, приводят к обесцвечиванию раствора йода и метиленового синего и, соответственно, к появлению неспецифических реакций, что может привести к неправильной интерпретации полученных результатов (ложноположительных реакций). Растворы йода широко используются для обнаружения агараз, целлюлаз, ксиланаз в агаровых гелях как с субстратами, так и без них, так как считается, что это более быстрый метод по сравнению с другими с применением других красителей [8, 9, 10, 11]. Считалось, что некоторые агаролитические бактерии могут изменять двойную спиральную структуру агара без его разжижения, чтобы он не темнел при «окраске» раствором йода [12]. Однако наши данные позволяют утверждать, что редокс-реакции делают раствор йода непригодным для экспериментов

на агаразную, целлюлазную активность в РЭД-тестах. Ранее такое же утверждение было высказано J.A. O'Hair о непригодности использования раствора йода по Граму для выявления целлюлазной активности в РЭД-тестах в агарозных гелях [13].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в препаратах бесклеточных фракций холерного вибриона O1 и O139 серогрупп с помощью реакции РЭД в агарозе нами обнаружена активность гидролитических ферментов, относящихся к разным подклассам. В ходе исследований были выявлены статистически достоверные различия в их активности и обнаружена следующая закономерность: нетоксигенные штаммы отличаются повышенной продукцией протеаз и хитиназ, в то время как токсигенные отличаются повышенной продукцией липаз, лецитиназ и муциназ. В отношении оценки наличия альгинат-лиазной, сульфатазной и агаразной активностей при постановке РЭД-тестов показана непригодность использования для «окрашивания» агарозных гелей растворов йода и метиленового синего, поскольку это может привести к получению ложноположительных результатов. По итогам проведённых исследований реакция энзимодиффузии показала себя надёжным и перспективным методом для определения наличия гидролаз, но в ряде случаев требует осторожной интерпретации полученных результатов. Однако в будущем необходима существенная модификация этого метода. В перспективе результаты исследования могут быть использованы в микробиологической диагностике холеры для дифференциальной биохимической характеристики штаммов холерных вибрионов.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

1. Zhang X, Shuai Y, Tao H, Li C, He L. Novel method for the quantitative analysis of protease activity: the casein plate method and its applications. ACS Omega 2021; 6(5), 3675-80. doi: 10.1021/acsomega.0c05192.

2. Монахова ЕВ. Стратегия вирулентности холерных вибрионов и пути её реализации (обзор). Проблемы особо опасных инфекций 2013; 4, 608. doi: 10.21055/0370-1069- 2013-4-60-68.

3. Racault MF, Abdulaziz A, George G. Environmental reservoirs of Vibrio cholerae: challenges and opportunities for ocean-color remote sensing.

Remote Sens 2019; 11(2763), 1-26. doi: 10.3390/rs11232763.

4. Hossain TJ. Hydrolytic exoenzymes produced by bacteria isolated and identified from the gastrointestinal tract of Bombay duck. Front Microbiol 2020; 11(2097). doi: 10.3389/fmicb.2020.02097.

5. Lee YH, Tan HT, Chung MCM. Subcellular fractionation methods and strategies for proteomics. Proteomics 2010; 10(22), 3935-56. doi: 10.1002/pmic.201000289.

6. Burton RE, Kim S, Patel R, Hartman DS, Tracey DE, Fox BS. Structural features of bovine colostral

immunoglobulin that confer proteolytic stability in a simulated intestinal fluid. J Biol Chem 2020; 295(34), 12317-27. doi: 10.1074/jbc.RA120.014327.

7. Шелковский ВС, Косевич МВ, Боряк ОА, Зобнина ВГ, Плохотниченко АМ. Редокс-взаимодействия с аминокислотой цистеином как один из возможных механизмов биологического действия метиленового синего. Бiофiзичний вкник 2017; 37(1), 30-41.

8. Kwon MJ, Jang WY, Kim GM, Kim YH. Characterization and application of a recombinant exolytic GH50A P-agarase from Cellvibrio sp. KY-GH-1 for enzymatic production of neoagarobiose from agarose. ACS Omega 2020; 5(45), 29453-64. doi: 10.1021/acsomega.0c04390.

9. Meddeb-Mouelhi F, Moisan JK, Beauregard M. A comparison of plate assay methods for detecting extracellular cellulase and xylanase activity. Enzyme Microb Technol 2014; 66, 16-9. doi: 10.1016/j.enzmictec.2014.07.004.

10. O'Hair JA, Johnson T, Ejiofor A, Zhou S. Reducing inconsistent cellulolytic screenings during the Gram's iodine assay. Cellulose 2016; 23(5), 3389-92. doi: 10.1007/s10570-016-1027-6.

11. Tsevelkhoroloo M, Shim SH, Lee CR, Hong SK, Hong YS. Lacl-family transcriptional regulator DagR acts as a repressor of the agarolytic pathway genes in Streptomyces coelicolor A3(2). Front Microbiol 2021; 12 (Article 658657). doi: 10.3389/fmicb.2021.658657.

12. Agbo JAC, Moss MO. The isolation and characterization of agarolytic bacteria from a lowland river. Microbiology 1979; 115(2), 355-68. doi: 10.1099/00221287-115-2-355.

13. O'Hair JA. Inadequacy of Gram's iodine assay to detect cellulase degradation during screening for lignocellulolytic bacteria and fungi. ETD Collection for Tennessee State University 2014; Paper AAI1557680. https://digitalscholarship.tnstate.edu/ dissertations/AAI1557680/.