CC BY
42
УДК 663.52:658.567.1
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ БИОКОМПОЗИЦИЙ НА ОСНОВЕ СПИРТОВЫХ ОТХОДОВ
© 2009 г. А.Ш. Кайшев
Пятигорская государственная фармацевтическая академия, Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy,
пр. Калинина, 11, г. Пятигорск, 357532, Kalinin Ave, 11, Pyatigorsk, 357532,
rector@pgfa.ru rector@pgfa.ru
Предложено выделение из жидкой и твердой фракций спиртовых отходов комплекса аминокислот, углеводов, витаминов, биогенных элементов (образец 1) и пектинов (образец 2). В опытах на животных установлена практическая нетоксичность выделенных биокомпозиций. Методами хемилюминесценции и аскорбатзависимого пероксидного окисления липидов установлено ин-гибирующее влияние обоих образцов на кинетику окисления липидов, что свидетельствует об их выраженной антиоксидантной активности. Образец 2 по сравнению с образцом № 1 на 8,5—12 проявил более высокую активность.
Ключевые слова: спиртовые отходы, утилизация, экологические проблемы, биологически активные вещества, антиоксидантная активность, лекарственные средства.
Allocation from liquid and firm fractions spirit waste of a complex of amino acids, carbohydrates, vitamins, biogenic elements (the sample 1) and pectins (the sample 2) is offered. In experiences on animals it is established practical nottoxicity the allocated biocompositions. By methods hemiluminescences and ascorbatdependent peroxydas oxidations fats it is established braking influence of both samples on kinetics oxidations fats, that testifies about their expressed antioxidizing activity. The sample 2 in comparison with the sample 1 on 8,5—12 has shown higher activity.
Keywords: spirit waste, recycling, environmental problems, biologically active substances, antioxidizing activity, medical products.
Основной причиной патологических процессов, вызывающих преждевременное старение организма человека и развитие ряда заболеваний, особенно сердечнососудистых, онкологических, служит избыточное накопление свободных радикалов кислорода и, как следствие, разрушение липидов, белков, ДНК, мембран клеток, называемое окислительным стрессом [1]. Кумуляция свободных радикалов в организме возрастает вследствие снижения эффективности естественной антиоксидантной системы человека, вызванной воздействием радиации, УФ-облучения, курения, алкоголя, постоянных стрессов, некачественного питания.
Против токсичных эффектов свободных радикалов клетки организма используют ферментативные (супер-оксиддисмутаза, каталаза и т.д.) и неферментативные (витамины А, С, каротиноиды, глутатион и др.) механизмы защиты [1]. В нормальном состоянии организма эффективно реализуются оба механизма, поддерживающие его гомеостаз. В случае развития патологических процессов требуется усиление антиоксидантной
защиты организма, например, путем использования экзогенных биоантиоксидантов (витаминов, флавонои-дов, биогенных металлов и др.), источниками которых служат растительные объекты.
Цель исследования - экспериментальное обоснование использования биокомпозиций, выделенных из спиртовых отходов, в качестве антиоксидантов.
Методики и результаты исследования. Проведено сравнительное изучение антиоксидантной активности двух биокомпозиций, полученных на основе спиртовых отходов. Выбор данных объектов основан на наличии в них компонентов с выраженной антиоксидантной активностью.
Для выделения биокомпозиций зерновые спиртовые отходы сначала разделяли на жидкую и твердую фракции, после чего жидкую концентрировали до плотности 1,480 г/мл, обрабатывали ацетоном в объемном соотношении концентрата и ацетона 1:3. Выпавший осадок (образец 1) отделяли, очищали ацетоном, высушивали. Экстракцию твердой фракции про-
водили методом мацерации 1%-м раствором оксалата аммония в мас-со-объемном соотношении сырья и экстрагента 1:10 при температуре 70 °С в течение 3 ч; полученный экстракт фильтровали, концентрировали до плотности 1,480 г/мл и обработкой концентрата спиртом 95 % в соотношении 1:2 выделяли из него осадок (образец 2), который фильтровали, очищали спиртом 95 %, высушивали. Выход образца № 1 составил 3,6 % к жидкой фракции отходов, образца 2 - 13,0 % к твердой фракции отходов [2]. Образец 1 - густой экстракт темно-коричневого цвета, легкорастворимый в воде с образованием пены, образец 2 - аморфный порошок светло-бежевого цвета, легкорастворимый в воде.
Химический анализ исследуемых образцов проведен путем установления подлинности компонентов и их количественного содержания [3] (табл. 1). Как показали результаты химического анализа, образец 1 представляет собой комплекс а-аминокислот, восстанавливающих сахаров, витаминов (Вь В2, В6, С, Е, А), биогенных элементов; образец 2 - пектины.
В результате испытаний на острую токсичность путем перорального однократного введения образцов крысам линии Вистар массой 180-220 г в дозах 10, 100, 1000, 5000 мг/кг (6 животных в каждой серии опытов) [4] установлено, что исследуемые биокомпозиции имеют LD5o>5000 мг/кг, а значит, практически нетоксичны.
Оценка антиоксидантной активности биокомпозиций проведена с использованием двух методов. Методом хемилюминесценции изучено влияние исследуемых образцов на скорость перок-сидного окисления липидов (ПОЛ) в системе, содержащей суспензию яичного желтка в присутствии ионов железа (II) [5]. Веществом сравнения служил свекловичный пектин. Результаты изучения антиок-сидантных свойств, обработанные методом вариационной статистики (п = 6, t = 3,97) [3], приведены в табл. 2. Результаты опытов свидетельствуют о существенном ингибирующем влиянии обоих исследуемых образцов на кинетику ПОЛ в тестируемой системе: снижение скорости реакции ПОЛ мембран по сравнению с контролем составляет 57,9 % для образца 1 и 66,4 % - для образца 2; подобная активность свекловичного пектина ниже и составляет 51,9 %. Таким образом, способность выделенных образцов 1 и 2 тормозить процессы ПОЛ в 1,14 и 1,43 раза соответ-
Результаты химического анализа образцов 1, 2
Таблица 1
Показатель Метод анализа Заключение
Образец 1
Подлинность компонентов: Визуально Реакция «+»,
на а-аминокислоты что доказывает
(с нингидрином) наличие аминокислот
на восстанавливающие Спектрофотометрия Реакция «+»,
сахара (с кислотой что доказывает
пикриновой) наличие сахаров
на витамины: Реакции «+»,
В1 (с феррицианидом калия) В УФ свете что доказывает
В2 В УФ свете наличие витаминов
В6 (с 2,6-дихлорхинонхлоримидом) Визуально Вь В2, В6, С, Е, А
С (с 2,6-дихлорфенолиндофенолом) Визуально
Е (с азотной кислотой) Визуально
А (с хлоридом сурьмы (III)) Визуально
Количественное содержание: Жидкостная 8,52
Аминокислоты, % хроматография
Восстанавливающие сахара Гравиметрия 25,8
(с реактивом Фелинга), %
Витамины, мг %:
В1 Гравиметрия 0,56
В2 Спектрофотометрия 1,22
В6 Неводное титрование 0,86
С Иодиметрия 0,46
Е Цериметрия 3,15
А Спектрофотометрия 0,75
Элементный состав, мг/кг: Спектральный анализ
Фосфор >30000
Марганец 8000
Магний 1800
Цинк 150
Железо 60
Образец 2
Подлинность на пектины: Визуально Реакции «+»,
с ацетатом свинца (II) что доказывает
с карбазолом Спектрофотометрия наличие пектина
рН (0,5 % водный раствор) Потенциометрия 4,2
Количественное Потенциометрическое 32,5
содержание, % титрование
ственно выше аналогичной способности известного антиоксиданта - свекловичного пектина.
Таблица 2
Влияние образцов 1, 2 на скорость ПОЛ (хемилюминесцентный метод)
Объект Интенсивность свечения, мВ
исследования Х ± Sx Достоверность изменения по отношению к контролю Изменение, %
Контроль 0,532±0,085 100,0
Свекловичный 0,256±0,019 <0,001 48,1
пектин
Образец 1 0,224±0,021 <0,001 42,1
Образец 2 0,179±0,014 <0,001 33,6
Антиоксидантная активность изучаемых образцов подтверждена также методом аскорбатзависимого
ПОЛ, основанного на способности к окислению кислородом воздуха в разбавленных водных растворах остатков олеиновой кислоты в составе твина-80 в присутствии кофакторов окисления - ионов железа (II) и аскорбиновой кислоты. Антиоксидантную активность оценивали по степени уменьшения концентрации комплекса малонового диальдегида (продукта окисления) с тиобарбитуровой кислотой [5]. Контролем служили пробы без добавления исследуемых образцов. Данные опытов, обработанные методом вариационной статистики (п = 12) [3], приведены в табл. 3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что под влиянием образца 1 показатель экстинкции, отражающий максимальное накопление малонового диальдегида, снизился на 52 % по сравнению с контролем, а под влиянием образца 2 - на 64, что подтверждает выраженный анти-оксидантный эффект целевых продуктов.
Таблица 3
Влияние образцов 1, 2 на скорость ПОЛ (метод аскорбатзависимого ПОЛ)
Объект исследования Показатель экстинкции Х ± Sx Достоверность изменения по отношению к контролю % снижения экстинкции по отношению к контролю
Контроль 0,25±0,006
Образец 1 0,12±0,007 <0,001 -52
Образец 2 0,09±0,004 <0,001 -64
Обсуждение результатов. Выделенные из спиртовых отходов образцы представляют собой комплексы биологически активных веществ: образец 1 - комплекс а-аминокислот, восстанавливающих сахаров, витаминов (В], В2, В6, С, Е, А), биогенных элементов; образец 2 -пектины. Оба являются безвредными. Выраженная ан-тиоксидантная активность подтверждена двумя методами, однако, образец 2 показал более высокую активность по сравнению с 1.
Поступила в редакцию_
Выводы. Предложенная технология переработки жидкой и твердой фракций спиртовых отходов позволяет получить комплекс аминокислот, углеводов, витаминов, биогенных элементов и комплекс пектинов.
В опытах на крысах установлена практическая нетоксичность выделенных биокомпозиций.
Методом хемилюминесценции доказано существенное ингибирующее влияние обоих образцов на кинетику ПОЛ. Их способность тормозить процессы ПОЛ в 1,14 и 1,43 раза соответственно выше подобной активности препарата сравнения (свекловичного пектина).
Методом аскорбатзависимого ПОЛ подтверждена выраженная антиоксидантная активность обоих образцов по сравнению с контролем: на 52 % для образца 1 и на 64 - для образца 2.
Практическая нетоксичность и выраженная антиок-сидантная активность биокомпозиций на основе спиртовых отходов позволяют рекомендовать их в качестве экзогенных средств защиты организма человека от повреждающего действия свободных радикалов.
Получение пробиотиков на основе спиртовых отходов позволит частично решить экологическую проблему охраны окружающей среды путем значительного сокращения объема отходов и повышения степени их чистоты.
Литература
1. Шанин Ю.Н., Парамонов Б.А., Зиновьев Е.В. Современные антиоксидантные препараты в клинической практике (обзор) // Бюл. экспер. биол. и медицины. 2003. Т. 34, № 11. С. 11-28.
2. Пат. 2312520 РФ, МПК А23Ь 1/0524. Способ комплексной переработки послеспиртовой барды / Н.Ш. Кайше-ва, А.Ш. Кайшев, С.А. Парфейников (РФ). № 2006100222; Заявл. 10.01.06; Опубл. 20.12. 2007. 8 с.
3. Государственная фармакопея СССР : 10-е изд. М., 1968. 1080 с.
4. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. рекомендации / под ред. А.В. Стефанова. Киев, 2001. 528 с.
5. Методы клинических лабораторных исследований / В.С. Камышников [и др.]. Минск, 2001. 695 с.
22 декабря 2008 г.
