CC BY
55
УДК: 61.615.32.322
ИССЛЕДОВАНИЕ АЛКАЛОИДОВ COCHLEARIA OFFICINALIS, ОБЛАДАЮЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ ИНГИБИРОВАТЬ АКТИВНОСТЬ ГЛЮКОЗИДАЗ
© О. Г. Струсовская
Северный государственный медицинскийуниверситет, пр. Троицкий, 51, Архангельск, 163000 (Россия), e-mail: Strol3@yandex.ru
Предметом исследования являлось воздушно сухое сырье Cochlearia officinalis второго года вегетации, собранное во время цветения растения летом 2010 г, на островах Соловецкого архипелага, В сырье идентифицированы алкалоиды тропанового ряда: тропин, псевдотропин и полигидроксилированные нортропановые алкалоиды, калистегины А5, В2 и В3, обладающие способностью конкурентного ингибирования активности глюкозидаз, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения данного вида растительного сырья в качестве средства профилактики и лечения диабета II типа,
Ключевые слова: Cochlearia officinalis, алкалоиды, калистегины, диабет,
Введение
Cochlearia officinalis (сем. Cruciferae L.), или ложечная трава, является эндемичным растением Соловецких островов и нашло широкое применение в народной медицине, однако в отечественной научной литературе имеется недостаточно сведений о химическом составе растения. Известно, что Cochlearia officinalis наряду с другими биологически активными веществами, содержит тропинон, алкалоиды: кохлеарин, тропин и псевдотропин, а также группу соединений, представляющих собой неэтерифицированные полигидроксилированные нортропановые алкалоиды - калистегины (А3, А5, В2 и В3) [1]. Установлено, что калистегины обладают уникальными свойствами конкурентного ингибирования активности глюкозидаз [2]. В связи с этим открывается перспектива использования Cochlearia officinalis для профилактики и лечения диабета II типа - неинсулинзависимого.
Цель исследования - определение тропановых и нортропановых алкалоидов Cochlearia officinalis, произрастающей на территории островов Соловецкого архипелага.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служило воздушно-сухое сырье Cochlearia officinalis (сырье) второго года вегетации, собранное во время цветения растения на территории островов Соловецкого архипелага в июле 2010 г. Изучаемое растение было определено как Cochlearia officinalis по сумме морфологических признаков [3].
Алкалоиды идентифицировали методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) [1]. С этой целью сырье измельчали и просеивали через лабораторные сита С30/50 (ГОСТ 3826-82) с размером отверстий 1 мм. К 3,0 г (точная масса) измельченного сырья прибавляли спирт этиловый (ГОСТ Р 51652-2000) 80% в соотношении экстрагент-сырье 1 : 3 г/мл. Фильтровали. Операцию проводили трижды. Объединенные спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до объема 5 мл и подкисляли до pH 3-4 2% раствором кислоты винной (ГОСТ 5817-77). Водное извлечение экстрагировали, последовательно петролейным эфиром (ТУ 2631-075-44493179-01) и этилацетатом
Струсовская ОльгаГеннадьевна - доцент кафедры (ГОСТ 223°°-76Х прибавляя растворители в количе-
фармации и фармакологии, кандидат фармацевтических стве 3 мл. Органические извлечения, содержащие
нау^ e-mail Strol3@yandex ru липиды и хлорофилл, отбрасывали. Затем pH водно-
го экстракта доводили до значения 10 с помощью 10% раствора гидроксида аммония (ГОСТ 3760-79) и добавляли 10 мл смеси хлороформ (ТУ 2631-066-44493179-01) - изопропиловый спирт (ТУ 2632-06444493179-01) в соотношении 3 : 1. Органический слой отделяли и упаривали под вакуумом. Остаток растворяли в 1,0 мл воды очищенной (ФС 42-2619-97) для определения методом ТСХ. Полученное извлечение, 2 мМоль/л растворы свидетелей: тропина (Sigma Aldrich T89400); псевдотропина (Simagchem Corp. 135-97-7), тропинона (Sigma Aldrich T89605) и их модельной смеси, наносили на пластинку «Silica gel 60 F254» (Merk). Хроматографировали в системе растворителей хлороформ - 96% этиловый спирт - 10% раствор аммиака (44 : 10 : 1) [4].
Для идентификации калистегинов использовали метод хромато-масс-спектроскопии (ГХ-МС) [5]. Полигидроксилированные нортропановые алкалоиды являются нелетучими соединениями, поэтому для идентификации калистегинов в экстракте Cochlearia officinalis необходимо было получить их силильные производные. С этой целью сырье измельчали и просеивали через лабораторные сита с размером отверстий 1 мм. К 1 г (точная масса) измельченного сырья добавляли спирт этиловый 50% в соотношении 1 : 10 и оставляли в укупоренной колбе с пришлифованной крышечкой на 24 ч при комнатной температуре. Через сутки смесь фильтровали через бумажный складчатый фильтр и центрифугировали на лабораторной центрифуге ЦЛ 1/3 со скоростью вращения 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернантат пропускали через ионообменную колонку, заполненную Amberlite IR-120 в Н+-форме. Колонку промывали водой очищенной до нейтральной реакции. Калистегины элюировали, дважды пропуская через колонку по 10 мл 0,5 Моль/л раствора аммония гидроксида и воды очищенной. Полученный элюат пропускали через ионообменную колонку, заполненную Dowex 1-Х2 в ОН- - форме. Элюирование проводили 10 мл воды очищенной. Элюат упаривали и лиофилизировали с помощью лабораторной установки «Martin Christ ALPHA 1-2». Лио-фильную массу растворяли в 50 мкл пиридина (CAS 110-86-1, Merck), прибавляли 40 мкл гексаметилдиси-локсана (CAS 107-46-0, Merck), 10 мкл хлортриметилсилана (CAS 75-77-4, Merck), выдерживали при 50° С в течение 15 мин и центрифугировали 10 мин со скоростью 3000 об/мин [1]. ГЖХ-определение полученных триметилсилильных производных калистегинов проводили на приборе Hewlett Packard HP 6890/5972A (USA), работающем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ, оснащенном пламенноионизационным и масс-спектрометрическим детекторами, капиллярной колонкой OV-23 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, заполненной неподвижной жидкой фазой метил 5% фенилсиликоном, с размером частиц 0,25 мкм, с программируемым температурным режимом. Начальная температура составляла 160 °C, подъем температуры со скоростью 5°/мин - до 240 °С. Температура детектора - 250 °С. Объем вводимой пробы составлял 5 мкл. Скорость газа-носителя, в качестве которого использовали гелий, составляла 1 мл/мин [6].
Количественное определение алкалоидов и калистегинов проводили методом ГЖХ, для чего измельченное до размера частиц 1 мм сырье экстрагировали дважды 50% раствором этилового спирта 1 : 1 (г/мл). Объединенные экстракты упаривали. К полученному остатку прибавляли 1 мл воды очищенной, 50 мкл 26% раствора аммиака и пропускали через колонку, заполненную 1,0 г Extrelut (Merk). Через 20 мин алкалоиды элюировали последовательно 4 мл хлороформа и 4 мл смеси хлороформ - этиловый спирт 9 : 1 по объему. Элюат упаривали. К сухому остатку прибавляли 150 мкл этилацетата и хроматографировали на приборе Hewlett Packard 6890 (USA), оснащенном пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой OV-23 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, заполненной неподвижной жидкой фазой метил 5% фенилсиликоном, с размером частиц 0,25 мкм [5]. Параметры проведения эксперимента: программируемое повышение температуры термостата колонки - от 60 до 240 °С со скоростью 5°/мин, скорость потока газа-носителя, в качестве которого использовали гелий, - 1 мл/мин, температура испарителя и детектора - 250 °С. Объем вводимой пробы 1 мкл. Параллельно анализировали модельную смесь свидетелей (100 мкг/мл).
Обсуждениерезулътатов
При идентификации алкалоидов методом ТСХ хроматографические пластинки после высушивания на воздухе обрабатывали реактивом Драгендорфа в модификации Мунье [4]. На хроматограммах веществ-свидетелей обнаруживали пятна со значениями Rf = 0,24 (тропин); 0,34 (псевдотропин) и 0,93 (тропинон). На хроматограмме экстракта Cochlearia officinalis проявлялись два пятна со значениями Rf, соответствующими тропину и псевдотропину. Пятна, соответствующего тропинону, обнаружено не было.
В ходе проведенных исследований установлено, что при анализе тропановых алкалоидов в Cochlearia officinalis методом ГЖХ (рис. 1) определяемый минимум для исследуемых веществ составляет 15 мкг/мл для тропинона и тропина и 60 мкг/мл - для псевдотропина.
Идентификацию калистегинов проводили методом ГХ-МС по времени удерживания (рис. 2) и характеристическим пикам в масс-спектрах исследуемых веществ (рис. 3) в соответствии с данными литературы [7-9]. На хроматограмме триметилсилильных производных калистегинов присутствуют три пика, время удерживания которых соответствует 14,65, 18,05 и 19,98 мин. Максимальный пик, имеющий время удерживания 14,65 мин (92,6%), имеет сигнал с m/z 360, соответствующий молекулярному иону тетра-триметилсилильному производному калистегина А5 [8]. Характерными сигналами, соответствующими отщеплению гидроксильных силилированных групп, являются сигналы с m/z 285 и m/z 156, которые соответствуют иону дигидропиррола, образующемуся за счет расщепления шестичленного кольца фрагмента молекулы тропана. Характеристические сигналы с m/z 101; 117; 156; 245; 246; 360 совпадают с масс-спектральными характеристиками калистегина А5, описанными в литературе [7-9].
Модельная смесь алкалоидов: 1 - тропинон (время удерживания 11,06 мин); 2 - тропин (время удерживания 11,47 мин);
3 - псевдотропин (время удерживания 12,47 мин)
Рис. 1. Хроматограмма тропановыхалкалоидов
Экстракт Cochlearia officinalis: 1 - тропин (время удерживания 11,47 мин); 2 - псевдотропин (время удерживания 12,47 мин)
Рис. 2. Хроматограмма триметилсилильных производных калистегинов cochlearia officinalis:
1 - калистегин А5;
2 - калистегин B3;
3 - калистегин В2
Калистегин А5
Калистегин В3
Рис. 3. ГХ-МС фрагментации триметилсилильных производных калистегинов экстракта сырья Cochlearia officinalis
Калистегин В2
Следующие два пика на хроматограмме со временем удерживания 18,05 (5,4%) и 19,98 (1,9%) имеют фрагментацию с молекулярным ионом с m/z 463, что соответствует пентатриметилсилильным производным калистегинов группы В. В отличие от масс-спектра калистегина А5, базовый пик в масс-спектрах калистегинов группы В, с сигналом, соответствующим иону с m/z 217, характеризует появление дополнительной гидроксильной группы, локализующейся в подвергающемся фрагментации шестичленном кольце. В результате образуется 2-замещенный ион дигидропиррола, с m/z 373. Для второго по величине пика на хроматограмме со временем удерживания 18,05 мин - наиболее характерны выраженные сигналы m/z 373; 288; 284; 259; 244; 229; 218; 217;170; 167; 156;147, что делает возможным идентифицировать его как калистегин В2 [8, 9]. Третий пик со временем удерживания 19,98 мин имеет характеристические пики с m/z 373; 288; 244; 217; 167; 156, идентифицирующие его как калистегин В3 (рис. 4) [8, 9]. Общая схема фрагментации тетратриметилсилильных производных калистегинов приведена на рисунке 5 [10].
Таким образом, в ходе проведенных исследований в сырье Cochlearia officinalis второго года вегетации были идентифицированы полигидроксилированные нортропановые алкалоиды - калистегины А5, В2 и В3. Калистегин А3 не обнаружен.
Определение количественного содержания тропановых алкалоидов в экстракте Cochlearia officinalis проводили методом добавки. Среднее содержание алкалоидов в исследуемых образцах составило: псевдо-тропина - 32 мкг/г и тропина - 6,3 мкг/г сырья Cochlearia officinalis (табл. 1). Пик, соответствующий тро-пинону на хроматограмме исследуемого экстракта, обнаружить не удалось.
h
I
OH OH
H
I
OH
4
V7—toh H0p:~^k^0H
OH
7 7
Калистегин A5 Калистегин B2 Калистегин B3
Рис. 4. Структурные формулы идентифицированных в Cochlearia officinalis калистегинов
Рис. 5. Общая схема фрагментации при проведении масс-спектрометрического анализа на примере тетра-триметилсилильных производных калистегинов [10]
Таблица 1. Результаты количественного определения тропановых алкалоидов в воздушно-сухом сырье Cochlearia officinalis
Масса сырья, г Псевдотропин, мкг/г Метрологические характеристики Тропин, мкг/г Метрологические характеристики
10,12235 10,09950 10,00560 33,45 33,40 30,12 x = 32,037 S- = 0,615 x 6,54 6,52 6,10 X = 6,29 S- = 0,083 X
10,09985 33,42 A x = 1,582 6,32 A x = 0,213
10,02330 30,14 s = +4,94% 6,12 s = +3,39%
10,06580 31,69 6,13
Отсутствие стандартных веществ не позволило количественно определить калистегины в исследуемом сырье, поэтому нами был проведен полуколичественный анализ изучаемых веществ с помощью внутреннего стандарта. Поскольку избирательность, как правило, представляет собой относительные значения (площади или высоты пика) одного соединения по сравнению с другим, то в качестве внутреннего стандарта при полуколичественном определении используют соединения, содержащие элемент, представляющий интерес, например при определении углеводородов, в качестве внутреннего стандарта обычно используют октадекан, при определении соединений, содержащих в структуре азот - азобензол [1, 11, 12]. Для определения калистегинов к 90 мкл экстракта Cochlearia officinalis, полученного для идентификации методом ГХ-МС, добавляли 9 мкл азобензола (CAS 103-33-3, Fluka) и хроматографировали в тех же условиях. Полученная хроматограмма приведена на рисунке 6.
Количественное содержание калистегинов рассчитывали по площадям пиков исследуемых соединений и азобензола, используя значение коэффициента чувствительности [12, 13]. В ходе проведенных исследований было установлено, что содержание калистегинов А5; В2 и В3 составляет около 1600, 34 и 85 мкг/г воздушно-сухого сырья Cochlearia officinalis. Статистическая обработка полученных результатов представлена в таблице 2.
Рис. 6. Хроматограмма триметилсилильных производных калистегинов.
1 - азобензол (время удерживания 13,88 мин); 2 - калистегин А5 (время удерживания 14,65 мин);
3 - калистегин В3 (время удерживания 18,05 мин);
4 - калистегин В2 (время удерживания 19,98 мин).
Таблица 2. Результаты полуколичественного определения калистегинов в воздушно-сухом сырье Cochlearia officinalis
Калистегин A5 Калистегин В2 Калистегин В3
Содержание, Метрологические Содержание, Метрологические Содержание, Метрологические
мкг/г характеристики мкг/г характеристики мкг/г характеристики
1бб4,25 X = 1б19,72 29,87 X = 33,бб 90,28 X = 84,79
7 OO 5 Os 38,45 79,55
1597,13 S- = 52,б5 X 28,б4 S- = 1,72 X 7б,15 S- = 2,98 X
1б82,45 Д X = 135,31 35,б7 Д X = 4,41 93,1б AX = 7,б5
1395,1б е = +8,35% 37,12 е = +13,22% 90,45 £ = +9,03%
1598,7б 30,44 79,1б
Выводы
В ходе проведенных исследований в воздушно-сухом сырье Cochlearia officinalis второго года вегетации, собранного во время цветения на территории островов Соловецкого архипелага, были идентифицированы алкалоиды тропанового ряда: тропин, псевдотропин и полигидроксилированные нортропановые алкалоиды - калистегины А5; В2 и В3. В результате количественного и полуколичественного определения установлено содержание псевдотропина - 32 мкг/г, тропина - 6 мкг/г; калистегинов: А5 - 1600 мкг/г; В2 -34 мкг/г иВ3 - 85 мкг/г в пересчете на абсолютно сухое сырье. Содержание в сырье калистегинов свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения данного вида растительного сырья в качестве средства для профилактики и лечения неинсулинзависимого диабета.
Список литературы
1. Brock A., Herzfeld T., Paschke R., Koch M., Drager B. Brassicaceae contain nortropane alkaloids // Phytochemistry. 2006. Vol. 67, N18. Pp. 2050-2057.
2. Goldmann A., Message B., Tepfer D., Molyneux R.J., Duclos O., Boyer F.D., Pan Y.T., Elbein A.D. Biological activities of the nortropane alkaloid, calystegine B2 and analogs: structure-function relationship // Journal of Natural Products. 1996. Vol. 59, N12. Pp. 1137-1142.
3. Gill E. Conservation genetics of the species complex Cochlearia officinalis L. s.l. in Britain. PhD thesis The University of Edinburgh, 2007. 93 p.
4. Гаевская O.A. Исследование травы красавки как источника промышленного получения алкалоидов: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. М., 2004. 24 с.
5. Richter U., Rothe G., Fabian A-K., Rahfeld B., Drager B. Overexpression of tropinone reductases alters alkaloid composition in Atropa belladonna root cultures // Journal of Experimental Botany. 2005. N56. Pp. 645-652.
6. Keiner R., Drager B. Calystegine distribution in potato (Solanum tuberosum) tubers and plants // Plant Science. 2000. Vol. 150, N2. Pp. 171-179.
7. Drager B. Identification and quantification of calystegines, polyhydroxyl nortropane alkaloids // Phytochemical Analysis. 1995. Vol. 6, N1. Pp. 31-37.
8. Schimming T., Jenett-Siems K., Mann P., Tofern-Reblin B., Milson J., Johnson R.W., Deroin T., Austin D.F., Eich E. Calystegines as chemotaxonomic markers in the Convolvulaceae // Phytochemistry. 2005. Vol. 66. Pp. 469-480.
9. Schimming T., Tofern B., Mann P., Richter A., Jenett Siems K., Drager B., Asano N., Gupta M.P., Correa M.D., Eich E. Distribution and taxonomic significance of calystegines in the Convolvulaceae // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. Pp. 1989-1995.
10. Molyneux R.J., Pan Y.T., Goldmann A., Tepfer D.A., Elbein A.D. Calystegins, a novel class of alkaloid glucosidase inhibitors // Archives of biochemistry and biophysics. 1993. Vol. 304, N1. Pp. 81-88.
11. Azemi M. E., Mosaddegh M., Cheraghali A. M., Namjooyan F., Drager B. Isolation and identification of calystegines in root cultures of four Physalis species // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2006. N1. Pp. 69-72.
12. Stenerson K.K., Sidisky M. The quantitative analysis of semi-volatile organic compounds on the MDN™-5S capillary column // Sigma-Aldrich Co., Supelco., 2000. 23 p.
13. A Guide to Interpreting Detector Specifications for Gas Chromatographs. Technical Note // Agilent Technologies, Inc., 2005. 8 p.
Поступило в редакцию 9 августа 2011 г.
После переработки 28 сентября 2011 г.
Strusovskaya O.G. DETERMINATION OF ALKALOIDS FROM COCHLEARIA OFFICINALIS
Northern State Medical University, pr. Troitskii, 51, Arkhangelsk, 163000 (Russia) e-mail: Strol3@yandex.ru
Cochlearia officinalis (Cruciferae L.) or scurvy-grass is a common plant of the islands of Solovetsky archipelago and it has been used in folk medicine for a long time. However, in domestic scientific literature, there is little information about the chemical compounds of the plant. It is known that Cochlearia officinalis contains tropinon, tropanes alkaloids, and calystegines - polyhydroxylated nortropane alkaloids. Calystegines have unique properties of competitive inhibition of glucosidasis.
The aim of the study was to determine the composition of alkaloids of Cochlearia officinalis second year vegetation, growing on the islands of Solovetsky archipelago. In a study of air raw Cochlearia officinalis, collected in summer 2010, tropine and psevdotropine were identified by the TLC and GLC methods. Tropinon was not detected. The quantitative content of pseudotropine 32 ^g/g and tropine - 6,3 ^g/g in dry raw material was determined by GLC.
As a result of semi-quantitative analysis the content of calystegine A5 was determined - 1600 |xg/g; B2 - 34 |xg/g and B3 - 85 |xg/g. Calystegine A3 was not detected.
The identification of calystegines in Cochlearia officinalis shows perspective of further study of this type of plant material as a means of preventing and treating type II diabetes.
Keywords: Cochlearia officinalis, alkaloids, calystegines, diabetes.
References
1. Brock A., Herzfeld T., Paschke R., Koch M., Drager B. Phytochemistry, 2006, vol. 67, no. 18, pp. 2050-2057.
2. Goldmann A., Message B., Tepfer D., Molyneux R.J., Duclos O., Boyer F.D., Pan Y.T., Elbein A.D. Journal of Natural
Products, 1996, vol. 59, no. 12, pp. 1137-1142.
3. Gill E. Conservation genetics of the species complex Cochlearia officinalis L. s.l. in Britain. PhD thesis The University of Edinburgh, 2007, 93 p.
4. Gaevskaia O.A. Issledovanie travy krasavki kak istochnika promyshlennogo polucheniia alkaloidov: avtoref. dis. ... kand. farm. nauk. [The study of grass as a source of industrial belladonna alkaloids produce: PhD thesis of pharmaceutical sciences]. Moscow, 2004, 24 p. (in Russ.).
5. Richter U., Rothe G., Fabian A-K., Rahfeld B., Drager B. Journal of Experimental Botany, 2005, no. 56, pp. 645-652.
6. Keiner R., Drager B. Plant Science, 2000, vol. 150, no. 2, pp. 171-179.
7. Drager B. Phytochemical Analysis, 1995, vol. 6, no. 1, pp. 31-37.
8. Schimming T., Jenett-Siems K, Mann P., Tofern-Reblin B., Milson J., Johnson R.W., Deroin T., Austin D.F., Eich E.
Phytochemistry, 2005, vol. 66, pp. 469-480.
9. Schimming T., Tofern B., Mann P., Richter A., Jenett Siems K., Drager B., Asano N., Gupta M.P., Correa M.D., Eich E. Phytochemistry, 1998, vol. 49, pp. 1989-1995.
10. Molyneux R.J., Pan Y.T., Goldmann A., Tepfer D.A., Elbein A.D. Archives of biochemistry and biophysics, 1993, vol. 304, no. 1, pp. 81-88.
11. Azemi M. E., Mosaddegh M., Cheraghali A. M., Namjooyan F., Drager B. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2006, no. 1, pp. 69-72.
12. Stenerson K.K., Sidisky M. The quantitative analysis of semi-volatile organic compounds on the MDN™-5S capillary column // Sigma-Aldrich Co., Supelco, 2000. 23 p.
13. A Guide to Interpreting Detector Specifications for Gas Chromatographs. Technical Note // Agilent Technologies, Inc., 2005. 8 p.
Received August 9, 2011
Revised September28, 2011
