CC BY
71
УДК 615.322:582.734.4:581.45] 07[
АНАЛИЗ ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ БАРБАРИСА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Н.С. Терешина*, А.А. Абрамов, А.А. Маркарян*
(кафедра радиохимии; e-mail: [email protected])
Разработаны методики определения алкалоидов Berberis vulgaris в матричной гомеопатической настойке и многокомпонентных гомеопатических препаратах. Методом ВЭЖХ с помощью диодно-матричного детектора изучен алкалоидный состав настойки. Обнаружено 13 соединений, установлена чистота пиков в трехмерных координатах (время — интенсивность поглощения — длина волны). Проведена количественная оценка суммы алкалоидов в настойке (от 0,20 до 0,60%), из которых на долю берберина приходится 38-42%. Разработаны методики хроматографических «отпечатков пальцев» для определения подлинности гомеопатических препаратов барбариса.
В научной медицине препараты барбариса обыкновенного ( Berberis vulgaris L., семейство Berberidaceae) применяют при хронических заболеваниях печени и желчного пузыря, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, воспалении верхних дыхательных путей, туберкулезе и маточных кровотечениях в послеродовом периоде. В гомеопатической практике препараты барбариса используют при почечно-каменной болезни и других заболеваниях мочеполовой системы, заболеваниях печени, надпочечников, кожи, подагрических, ревматических и нервных заболеваниях, а также при заболеваниях кожи [1, 2]. В гомеопатических разведениях настойка входит в более чем 80 гомеопатических препаратов. Барбарис относится к числу лучших лекарственных растений во всех странах мира, где он произрастает.
В гомеопатии для приготовления матричных настоек применяется только один вид барбариса — обыкновенный. Используют высушенную кору корней, подземных и наземных частей растения, свежие зрелые плоды.
По литературным данным, в высушенных плодах барбариса содержится до 5% сахаров и 6—7% яблочной кислоты, а также лимонная и виннокаменная кислоты. Листья, собранные в июне, содержат в пересчете на абсолютно сухое сырье алкалоиды, дубильные вещества, глюкозид арбутин (до 22%), галловую кислоту и свободный гидрохинон (2—4%), а также эфирное масло. Корневища и корни содержат до 25—27% дубильных веществ, алкалоида!, глюко-
зид бергенин (4,5%), фенолы, сахара (глюкозу и сахарозу), декстрин и другие вещества [3—7]. Алкалоиды локализуются в основном в коре [3, 7, 8]. Согласно литературным данным, активными компонентами настойки являются в основном алкалоиды, относящиеся к трем химическим группам: протобер-берина (берберин, берберубин, ятроррицин, пальма-тин, колумбамин и др.); бисбензилизохинолина (ок-сиакантин, бербамин, бербамунин и др.); апорфина (магнофлорин, вульрацин, бераульцин).
В России в качестве лекарственного растительного сырья используют высушенную кору наземных и подземных частей растения, содержащую не менее 2% алкалоидов в пересчете на берберин (С20И19КО5). Матричную настойку готовят методом мацерации из измельченного сырья на 62%-м (по массе) этиловом спирте.
Цель исследования состояла в разработке методики определения алкалоидов в матричной гомеопатической настойке и многокомпонентных гомеопатических препаратах, содержащих разведения этой настойки.
Разработке нормативной документации на матричную настойку предшествует изучение ее состава. С этой целью в настоящее время наиболее часто используют хроматографические методы. В последние годы опубликован ряд работ, посвященных использованию метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для исследования алкалоидов в сырье и в том числе в барбарисе [4, 7, 9, 10].
Исследования по изучению алкалоидного состава настойки проводили на хроматографе "ОИвоп" с
*Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова.
Рис. 1. ВЭЖХ гомеопатической матричной настойки барбариса (колонка "Luna C—18" (4,6x150 мм; подвижная фаза — 0,02 М раствор калия дигидрофосфата с рН 2,0 (А); ацетонитрил—вода, 80:20 (В); ацетонитрил—вода, 85:15 (А—В); 800 мкл/мин; детектор — диодно-матричный; интервал длин волн 200—400 нм)
последующей компьютерной обработкой результатов исследований (программа "Мулътихром" для "Windows"). В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка "Luna C—18" (4,6x150 мм) с градиентной подачей подвижной фазы. В качестве подвижных фаз были использованы: 0,02 М раствор калия дигидрофосфата с рН 2,0 (А); ацетонитрил—вода, 80:20 (В); ацетонитрил—вода, 85:15 (А—В). Скорость подачи элюента 800 мкл/мин, продолжительность анализа 15,1 мин. Для детектирования использовали УФ-детектор (длина волны 264 нм) и диодно-матричный детектор (ДНД) [11].
Условия диодно-матричного детектирования были следующими:
Для определения чистоты пика: шкала поглощения 0,1—1,0, интервал длин волн 200—400 нм, время анализа 10 мин, фиксируемый минимум площади пика от 0,0001 интенсивности поглощения в мин.
Для выбора длины волны: интервал 1 с, шкала поглощения 0,001—0,0011, интервал длин волн 200— 400 нм, время анализа 10 мин.
Рис. 2. УФ-спектр поглощения раствора берберина в метаноле
С помощью ДНД исследован состав гомеопатической настойки барбариса, чистота выделенных пиков в трехмерных координатах (время—интенсивность поглощения—длина волны). Полученный абсорбционный график и хроматограмма ВЭЖХ гомеопатической матричной настойки барбариса показали наличие 13 веществ. На рис. 1 показан пример анализа берберина. Чистый пик закрашен в черный цвет. Спектр, полученный для вершины пика, сравнивается со спектром стандарта (рис. 2).
При исследовании чистоты пиков и их спектральных характеристик обнаружено, что 6 пиков имеют значительную степень поглощения. По спектральным характеристикам и временам удерживания они определены как колумбамин, пальматин, ятрор-рицин, берберин, бербамин и оксиакантин (таблица) [9, 10, 12-14].
Методом ВЭЖХ проведена количественная оценка суммы алкалоидов в настойке в пересчете на бербе-рин. Содержание алкалоидов в настойке в зависимости от их содержания в сырье колеблется от 0,20 до 0,60%, из которых на долю берберина приходится 38-42%. Чувствительность метода составляет 0,1 мкг, а линейная зависимость соблюдается в интервале 0,1-0,8 мкг в расчете на берберин.
Для гомеопатических препаратов общепринятым методом определения подлинности является так называемый метод "отпечатков пальцев", при котором на хроматограмме оцениваются не отдельные классы соединений, а совокупность биологически активных веществ (БАВ). Тонко-слойную хромотографию гомеопатической настойки барбариса проводили на пластинках, покрытых силикагелем (Сорбфил) в подвижных фазах: н-бутиловый спирт-кислота уксусная
Результаты исследования качественного состава гомеопатической матричной настойки барбариса с помощью диодно-матричного детектора
Вещество Вpемя yдеpживaния
Koлyмбaмин 0 мин 48 с
Пaльмaтин 1 мин 12 с
Ятpoppицин 2 мин 00 с
Беpбеpин 2 мин 12 с
Беpбaмин 3 мин 54 с
4 мин 36 с
ледяная—вода (БУВ) (40:10:10); хлороформ—метиловый спирт (19:1). Зоны на хроматограмме быши обнаружены при дневном свете, в УФ-свете при 365 нм и модифицированным реактивом Драгендор-фа. В качестве веществ сравнения использовали сульфат хинина и бисульфат берберина. Наибольшее количество зон (8) получено в первой подвижной фазе, из которых три зоны относятся к алкалоидам. Метод "отпечатков пальцев" применим также для определения подлинности комплексных гомеопатических препаратов, содержащих настойку барбариса в гомеопатических разведениях. Ввиду малого содержания активных компонентов (менее 10 5) в готовый лекарственных формах и большого количества БАВ, число которык может достигать нескольких десятков, метод ТСХ в ряде случаев является наиболее доступным и информативным для целей стандартизации.
В качестве объектов исследования быши использованы препараты в разных лекарственных формах. Были разработаны методики для капель гомеопатических: "ЭДАС-129" состава Berberis vulgaris C3, Lycopodium clavatum C12, Cholesterinum C6, Phosphorus C3, Mercurius dulcis C6; "Холедиус" состава Berberis vulgaris D3, Chelidonium majus D3, Carduus marianus D3, Podophyllum peltatum D6. Из твердых лекарственных форм изучены гранулы гомеопатические "Иов-нефролит" состава Berberis vulgaris D3, Lycopodium clavatum D12, Cantharis D6; таблетки гомеопатические состава Taraxacum officinale C4, Carduus marianus C4, Chelidonium majus C4, Berberis
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Потопалъский А.И., Петличная Л.И., Ивасивка C.B. Барбарис и его препараты в биологии и медицине. Киев, 1986.
vulgaris D3. На примере основного доминирующего компонента Berberis vulgaris исследовано влияние степени разведения, соотношение разведений и компонентного состава БАВ препарата. В качестве растворов сравнения для метода "отпечатков пальцев" использованы1 матричные настойки, входящие в состав препаратов. В качестве подвижной фазы использована упомянутая ранее и наиболее универсальная смесь растворителей для разделения веществ БУВ (40:10:10). Исследованы особенности выделения БАВ из лекарственной формы для оценки ее подлинности. Если для капель достаточно концентрирования, то для таких лекарственных форм, как гранулы и таблетки, необходим подбор растворителя, максимально извлекающего БАВ и не растворяющего вспомогательные вещества (лактозу, сахарозу), которые мешают определению. Установлено, что при одних и тех же разведениях настойки барбариса в гранулах и таблетках хроматог-раммы исследуемыгх растворов имеют отличия. На хроматограмме исследуемого раствора гранул обнаружено 9 зон адсорбции, 7 из которых принадлежат матричной настойке Berberis vulgaris, а две зоны соответствуют аминокислотам настойки Cantharis. На хроматограмме таблеток обнаружено 4 зоны, из которых лишь 3 соответствуют зонам настойки барбариса. Наиболее сложным является определение подлинности препаратов, содержащих БАВ одних классов. Например, матричные настойки Chelidonium majus (чистотел большой) и Berberis vulgaris, входящие в состав капель "Холедиус", содержат алкалоиды группы изохинолина. При использовании этих настоек в качестве растворов сравнения получена хроматографическая картина "отпечатков пальцев", на которой три зоны со значениями R <0,25, ~0,25 и 0,50 аналогичны зонам настойки барбариса, а три зоны со значениями R ~0,30, ~0,40 и ~0,90 аналогичны зонам настойки чистотела. Полученные хроматограммы позволяют оценить подлинность препаратов по доминирующим компонентам.
Таким образом, разработаны методики определения алкалоидов барбариса обыкновенного в матричной гомеопатической настойке методом ВЭЖХ и методики определения подлинности многокомпонентных гомеопатических препаратов.
2. Реквег Г.Г. Гомеопатическая антигомотоксикология. Систематизированное практическое лекарствоведение. Смоленск, 1997.
3. Pitea M., Petcu P., Goina T., Preda N. Dunnschichtchromatographische untersuchungen der alkaloide von Berberis vulgaris. // Planta medica. 1972. 21. N 2. S. 177.
4. Lu C.H., Chen J.M., Xiao H.G. Determination of alkaloids
in the roots of Berberis genus plants by HPLC with varied wavelength. // Yaoxue Xuebao. 1995. 30. N 4. P. 280.
5. Юсупов M.M., Каримов А., Лутфуллин К.Л. Исследова-
ние алкалоидов Berberis vulgaris. XII. // Химия природных соединений. 1990. № 1. С. 128.
6. Найдович Л.П., Трутнева Е.А., Толкачев О.Н., Васильева Б.Д. Химический состав отечественных видов семейства Berberidaceae. Взаимосвязь химической структуры и фармакологической активности // Фармация. 1976. XXV. № 4. C. 33.
7. Ma Z, Yang G, Li Ch, Han Y, Li K. On resources of the
pharmaceutical plants of Gansu Berberis. II. Determination of alkaloids in the different parts of Sankezhen // Zhongcaoyao. 1994. 25. N 3. P. 149.
8. Gao L, Ma Z, Gong J. Berberine contents from different
parts of five barberry (Berberis L.) // Zhonggeaoyao. 1997. 28. N 2. P. 83.
9. Cimpar G, Gocan S. Analysis of medicinal plants by HPLC:
recent approaches // J. Lig. Chromatogr. and Relat. Technol. 2002. 25. N 13. P. 2225.
10. Tsai P.-L, Tsai T.-H. HPLC determination of berberine in medicinal herbs and a related traditional Chinese medicine // Anal. Lett. 2002. 35. N 15. P. 2459.
11. Хубер Л. Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ. М., 1993.
12. Glasby J.S. Encyclopedia of the alkaloids. Vol. 1, 2. N.Y.;L., 1975. .
13. Guha K.P. Bisbensylisoquinoline alkaloids // J. Natural Products. 1979. 42. N 1.
14. Shamma M. The Isoquinoline Alkaloids. Chemistry and Pharmacology. N.Y.;L., 1972.
Поступила в редакцию 02.06.05
CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE BERBERIS HOMOEOPATIC PREPARATIONS
N.S. Teryoshina, A.A. Abramov, A.A. Markarian
(Division of radiochemistry)
Procedures of determination of alkaloids of Berberis vulgaris in the matrix homoeopathic tincture and in the multi component homoeopathic preparations have been developed. Composition of tincture containing alkaloids has been studied by HPLC with help of diode array multi-wavelength detector. 13 compounds have been revealed and the purity of their peaks in tridimensional coordinates (time — intensity of absorption — wavelength) has been determined. Quantitative estimation of total alkaloids in the tincture (from 0.20 to 0.60 %) has been fulfilled. The content of berberine from this amount is about 38—42 %. Methods of chromatographic "finger prints" for determination of identity of homoeopathic preparation of Berberis are disclosed.
