CC BY
6005.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств (технические науки) DOI: 10.257127ASTU.2072-8921.2019.04.007 УДК 637.3:632.952
ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ПРЕГАСТРАЛЬНЫХ ЛИПАЗ
Ю.Г. Стурова, А.В. Гришкова
Липазы являются ферментами, которые классически используются для того, чтобы провести гидролиз триацилглицеринов, сопровождающийся образованием свободных жирных кислот. В настоящее время липазы используются в молочной промышленности для гидролиза молочного жира. Применение липаз в сыроделии направлено на улучшение вкуса сыров, ускорение созревания сыра, производство сырных продуктов и др.
В настоящее время липазы используются в молочной промышленности для гидролиза молочного жира. Представляло интерес изучить их активность в зависимости от изменения активной кислотности и температуры раствора для их приготовления. Липолитическую активность, которая является основным технологическим показателем, необходимо учитывать для правильного выбора липазы животного происхождения. Показано, что наибольшая активность наблюдалась у ферментных препаратов, приготовленных в растворах, активная кислотность которых находилась в диапазоне от 5,0 до 6,0 условных единиц. С увеличением значений рН активность препаратов существенно снижалась. При оценке пригодности препаратов прегастральной липазы для производства сыра недостаточно учитывать только липолитическую активность. Считается, что необходимо контролировать термостабильность липолитических препаратов.Температурный оптимум липолитической активности достигает максимума при 35 оС. Наибольшей чувствительностью к изменению температуры отличалась липаза телят.
Ключевые слова: прегастральная липаза, ферменты, липолитическая активность, температура, активная кислотность, созревание, молочный жир, жирные кислоты, сыр.
Созревание сыра - это длительный и многофакторный ферментативный процесс, основывающийся на реакции коагуляции казеина молока под воздействием сычужного фермента (химозина), так как в формировании вкуса, аромата и физико-химических характеристик принимают участие протеолити-ческие процессы. Повышенное внимание уделяется гидролизу белков, поскольку именно пептиды и аминокислоты играют большую роль во вкусообразовании [1, 2, 3].
Наряду с казеином молочный жир также является одним из важнейших компонентов молока и сыров. Содержание жира в сухом веществе сыра, чаще всего, составляет от 40% до 55%. Высоко диспергированное распределение жировой фазы в сырной массе обеспечивает тесный контакт липидных компонентов молочного жира с ферментами и химическими соединениями, что предполагает существование интенсивных биохимических реакций при созревании сыра, в которых ли-пиды играют роль субстратов.
Липазы (триацилглицерин липазы, ЕС 3.1.1.3) - одни из наиболее универсальных ферментов и являются ферментами, которые классически используются для того, чтобы провести гидролиз триацилглицеринов, сопровождающийся образованием свободных жирных кислот.
В настоящее время липазы используются в молочной промышленности для гидролиза молочного жира. Применение липаз в сыроделии направлено на улучшение вкуса сыров, ускорение созревания сыра, производство сырных продуктов и др. [2, 4].
Традиционными источниками липаз, используемых для интенсификации вкуса сыра, являются животные ткани, особенно поджелудочные железы (говяжьи и свиные) и пре-гастральные ткани молодых жвачных (козлят, ягнят и телят). Обычно в производстве сыра используются липазы, полученные из прега-стральных желёз молодых жвачных [4].
Желудочная липаза, получаемая из желез молочных жвачных животных, характеризуется оптимумом рН в диапазоне от 7,0 до 7,6. Липолитические ферменты, секретируе-мые тканями ротовой полости - это так называемые, преджелудочные (прегастральные) эстеразы. Их действие заключается в расщеплении крупных молекул молочного жира на молекулы с короткими и средними цепями, которые в основном формируют характерный вкус зрелого сыра. Область оптимальных значений рН для прегастральных эстераз - от 4,5 до 6,0 с инактивацией при рН меньше 2,4 и больше 7,8 [6]. Липазы производят, экстрагируя активный компонент из желез в основании языка козлят, ягнят и телят. Сразу после забоя животных железы замораживаются и хранятся при температуре 25°С. Экстракция
даёт несколько видов энзимов (не менее 6), образующих комплекс слюнных и преджелу-дочных липаз. Ферменты с протеолитической активностью (то есть расщепляющие молочные белки) отсутствуют.
Препарат прегастральной липазы широко используется в сыродельной промышленности при выработке различных сыров с высокой и низкой температурой второго нагревания [5].
Хранить липазу нужно в тёмном помещении при температуре от 0 °С до 5 °С, что
сохраняет его активность в течение шести месяцев,
при минус 18°С - в течение одного года [7].
Липолитическую активность, которая является основным технологическим показателем, необходимо учитывать для правильного выбора липазы животного происхождения. Для исследования использовались образцы липаз, полученные из преджелудочных желёз молодых жвачных животных, производства фирмы Caglificio Clerici SPA (Италия). Состав препаратов приведен в таблице 1.
Таблица 1 - Состав препаратов прегастральной липазы
Наименование препарата Маркировка Состав Производитель
Липаза телячья Calf lipase Липаза телячья (ягнячья, козья), хлорид натрия, сухое молоко, сухая молочная сыворотка Caglificio Clerici SPA (Италия)
Липаза козья
Липаза ягнячья
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ АКТИВНОМ КИСЛОТНОСТИ НА ЛИПОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТИ ЛИПАЗ
Исследования изменения липолитической активности препаратов прегастральных липаз при изменении активной кислотности буферных растворов с 5,0 до 9,0 условных единиц, с дискретностью 1,0 условных единиц проводили по модифицированному методу Ота, Ямада. Липолитическую активность фер-
мента (ЛА, ед/г) определяют по формуле 1.
АТ50
ЛА=-
В
(1)
где ЛА - липолитическая активность, ед/г;
А - разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;
Т - титр щелочи;
В - концентрация образца ферментного раствора, г/см3 [8]. В таблице 9 приведены результаты проведенных исследований.
Таблица 2 - Изменение липолитической активности липазы при изменении активной кислотности буферных растворов с 5,0 до 9,0 условных единиц
№ образца Липаза pH, условных ЛА, ед/г
единиц
1 Телячья 5 140000
2 Ягнячья 5 125000
3 Козья 5 125000
4 Телячья 6 125000
5 Ягнячья 6 120000
6 Козья 6 115000
7 Телячья 7 117500
8 Ягнячья 7 117500
9 Козья 7 110000
10 Телячья 8 115000
11 Ягнячья 8 112000
12 Козья 8 107500
13 Телячья 9 112500
14 Ягнячья 9 105000
15 Козья 9 105000
Ниже на рисунке 1 приведен график зави- препаратов липаз от уровня активной кислот-симости уровня липолитической активности ности раствора.
► Телячья I Ягнячья А Козья
Рисунок 1 - Зависимость липолитической активности препаратов липаз от уровня
активной кислотности раствора
Из рисунка 1 видно, что липолитическая активность всех испытанных ферментных препаратов, приготовленных в растворе с активной кислотностью 7,0 условных единиц, находилась приблизительно на одном уровне. Изменение кислотности раствора в кислую или щелочную сторону приводило соответственно к увеличению или снижению липолитической активности препаратов.
Наибольшая активность наблюдалась у ферментных препаратов, приготовленных в растворах, активная кислотность которых находилась в диапазоне от 5,0 до 6,0 условных единиц. С увеличением значений рН активность препаратов существенно снижалась. Например, при снижении активной кислотности от 7,0 до 8,0 условных единиц активность телячьей липазы снижалась - на 3,1 %, ягнячья - на 4,9 %, козья - на 3,3 % относительно контрольной точки 6,0 условных единиц, и все ферменты имели относительно небольшие отличия между значениями липолитической активности. Использование растворов с рН 5,0 условных единиц повышало активность препарата телячьей липазы - на 82 %, ягнячьей - на 89%, козьей - на 88 % относительно контрольной точки, это значительная разница в сравнении с активной кислотностью 8,0 условных единиц. Это можно объяснить тем, что оптимумом действия всех ферментов является кислая проте-аза, а в щелочной среде они начинают терять свою активность, тем не менее, активность ферментов остается в пределах нормы [9].
Практика показывает, что на большинстве предприятий уровень активной кислотности водопроводной воды, используемой для
растворения ферментов, приближается к значению 8,0 условных единиц, в этих условиях активность ферментов снижается, что отрицательно сказывается на дальнейшем протекании технологического процесса. Это может приводить к неэффективныму липолизу, что в дальнейшем сказывается на качественных показателях готового продукта, в частности, на вкусе и аромате [10].
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ЛИПОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ ЛИПАЗ
Как показывает практика, при оценке пригодности препаратов прегастральной липазы для производства сыра недостаточно учитывать только липолитическую активность. Считается, что необходимо контролировать термостабильность липолитических препаратов. Термостабильность препаратов в значительной мере влияет на липолиз и является одним из основных регуляторов интенсивности и направленности первичных липолитиче-ских реакций при созревании сыра. Проведенное исследование различных ферментных препаратов показало существование расхождений в их устойчивости к температурным воздействиям [9].
В таблице 3 приведены результаты измерений липолитической активности препаратов прегастральной липазы при изменении температуры от 31 оС до 35 оС, с шагом 1 оС. Расчет липолитической активности проводился по формуле 1.
Таблица 3 - Изменение липолитической активности препаратов прегастральной липазы при из-
менении температуры
№ образца Липаза Температура инкубирования субстрата, оС ЛА, ед/г
1 Телячья 31 85000
2 Ягнячья 31 75000
3 Козья 31 72500
4 Телячья 32 87500
5 Ягнячья 32 77500
6 Козья 32 77500
7 Телячья 33 90000
8 Ягнячья 33 82500
9 Козья 33 80000
10 Телячья 34 92500
11 Ягнячья 34 87500
12 Козья 34 82500
13 Телячья 35 104500
14 Ягнячья 35 94000
15 Козья 35 85000
График изменения уровня липолитиче-ской активности препаратов прегастральной
липазы при увеличении температуры инкубирования субстрата приведен на рисунке 2.
Телячья ■ Ягнячья А Козья
Рисунок 2 - Изменение липолитической активности препаратов прегастральной липазы при увеличении температуры инкубирования субстрата
Наибольшей чувствительностью к изменению температуры отличалась телячья липаза. При повышении температуры с 32 оС до 33 оС активность увеличилась на 37%, затем темп нарастания стал плавным. Это может быть связано с тем, что температурный опти-
мум для липазы от 30 оС до 35 оС, при дальнейшем повышении температуры активность препарата липазы растет постепенно. Следовательно, нарастание липолитической активности происходило поэтапно и достигало максимума при 35 оС. Активность ягнячьей и козьей липазы нарастала последовательно,
максимума достигала в интервале от 34 оС до 35 оС, в данном интервале происходило увеличение активности у ягнячьей липазы до 94000 ед./г, у козьей липазы до 85000 ед./г.
Изменение температуры является важным параметром для более активного протекания липолиза. Наиболее пригодным для сыроделия считается интервал от 33 оС до 35 оС, в котором липолиз протекает плавно и происходит активация препарата липазы.
Таким образом, показано, что наибольшая активность наблюдалась у ферментных препаратов, приготовленных в растворах, активная кислотность которых находилась в диапазоне от 5,0 до 6,0 условных единиц. С увеличением значений pH активность препаратов существенно снижалась. Температурный оптимум липолитической активности достигает максимума при 35 оС. Наибольшей чувствительностью к изменению температуры отличалась липаза телят.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Беленькая, С.В. Некоторые биохимические свойства рекомбинантного химозина альпака (Vicugna pacos L.) / С.В. Беленькая, А.П. Рудометов, Д.Н. Щербаков, Д.В. Балабова, А.В. Кригер, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.В. Ельчанинов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2018.- Т. 54.- № 6.- С. 585-593.
2. Кригер, А.В. Влияние состава ферментных композиций на качество сыров / А.В. Кригер, А.Н. Белов // Сыроделие и маслоделие. - 2010.- № 6.- С. 22-23.
3 Стурова Ю.Г. Молокосвертывающие ферментные препараты [Текст] / Стурова Ю.Г., Кригер А.В. // Монография. LAP LAMBERT Academic Publishing - 2014 - 73 с.
4. Белов, А.Н. Формирование органолептиче-ских показателей сыров и управление процессом созревания / А.Н. Белов, А.В. Кригер, А.Д. Коваль, В.А. Миклишанский // Сыроделие и маслоделие. -2018 - №4. - С. 10-12.
5. Кригер, А.В. Влияние прегастральной липазы на созревание сыра / А.В. Кригер, А.Н. Белов // Сыроделие и маслоделие. - 2010.- № 2.- С. 34-35.
6. ЛИПАЗА ДЛЯ СЫРА [Электронный ресурс]. - Электрон. дан. - Москва, 2018. - Режим доступа: http://zakvaska-ferment.ru/lipaza-dlya-syra-chto-eto-takoe-kak-kupit.html
7 Патент РФ 2007121994/13, 13.06.2007 Белов А.Н., Авданина Е.А., Ельчанинов В.В., Коваль А.Д. Способ производства сыра // патент России № 2346450. 2009. Бюл. № 5.
8 Грачева, И.М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов / И.М. Грачева, Ю.П. Грачев, М.С. Мосичев, Е.Г. Борисенко - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 240 c.
9 Стурова, Ю.Г. Влияние температуры и активной кислотности на молокосвертывающие ферментные препараты животного происхождения / Ю.Г. Стурова. А.В. Кригер, Е. О. Безбородова // Ползуновский вестник. - 2013. - №4-4. - С. 95-100
10 Стурова, Ю.Г. Факторы, влияющие на активность ферментных препаратов животного происхождения / Ю.Г. Стурова, А.В. Кригер, К.В. Жидких // Сыроделие и маслоделие. - 2014.- № 3.- С. 47-49.
Стурова Юлия Геннадьевна, к.т.н., доцент кафедры «Технологии продуктов питания» ФГБОУ ВПО АлтГТУ им. И.И. Ползунова, тел.: 8(3852) 29-07-35, е-mail: y stur-ova79@yahoo.com
Гришкова Анастасия Викторовна, к.т.н., доцент, старший научный сотрудник ФГБНУ ФАНЦА; доцент кафедры биологии, гистологии, эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России; е-mail: sibniis. altai@mail. ru
