CC BY
20
ПРЕПАРАТЫ
io Использование жидкой питательной среды из
£ ферментативного гидролизата белков
£ обезжиренного коровьего молока в технологии
| вакцины чумной живой сухой
¡S Лещенко А.А., Тетерин В.В., Лазыкин А.Г., Ежов А.В., Хонин А.З., Мохов Д.А., Бирюков В.В.,
(Q Багин С.В., Логвинов С.В.
X Научно-исследовательский центр Федерального бюджетного учреждения «33 Центральный
¡5 научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской
S Федерации», Киров
а
° Using of Liquid Nutrient Medium Prepared from
Digestion Proteins Hydrolyzate of Skim Cow Milk by Technologing of Vaccine Plague Live Dry
Leshchenko A.A., Teterin V.V., Lazykin A.G., Ezhov A.V., Khonin A.Z., Mokhov D.A., Birjukov V.V., Bagin S. V., Logvinov S.V.
Biological Defense Research Center of the Federal State Establishment «Russian Federation Ministry of Defense 33 Central Research and Development Testing Institute», Kirov
f - - « "
В статье представлены данные изучения возможности использования жидкои питательном
среды из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока в технологии вакцины чумноИ живоИ сухоИ. Вакцина чумная живая сухая, полученная с использованием данноИ среды, соответствует предъявляемым к неИ требованиям нормативной документации и на 25% дешевле, чем препарат полученныИ по регламентноИ технологии. Ключевые слова: вакцина чумная живая сухая, питательная среда, питательная основа, технология, ферментативный гидролизат белков обезжиренного коровьего молока.
Библиографическое описание: Лещенко А.А., Тетерин В.В., Лазыкин А.Г., Ежов А.В., Хонин А.З., Мохов Д.А., Бирюков В.В., Багин С.В., Логвинов С.В. Использование жидкой питательной среды из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока в технологии вакцины чумной живой сухой // Биопрепараты. - 2011. - № 3. - С. 53-56.
According to aminoacid, peptide and mineral composition requirements, the liquid nutrient medium prepared from the digestion proteins' hydrolyzate of skim cow milk satisfies the requests of the vaccine's EV strain taken from a plague microbe being deep-cultured. The vaccine plague live dry, received with the help of the specified medium, corresponds to the normative regulations and is 25% cheaper than a preparation received at protocol technology. Keywords:
Bibliographic description: Leshchenko A.A., Teterin V.V., Lazykin A.G., Ezhov A.V., Khonin A.Z., Mokhov D. A., Birjukov V.V., Bagin S.V., Logvinov S.V. Using of liquid nutrient medium prepared from digestion proteins hydrolyzate of skim cow milk by technologing of vaccine plague live dry // Biopreparats (Biopharmaceuticals). - 2011. - № 3. - С. 53-56.
Для корреспонденции:
А.А. Лещенко - ведущий научный сотрудник Научно-исследовательского центра Федерального бюджетного учреждения «33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации» Адрес: НИЦФБУ «33 Центральный научно-исследовательский испытательный институт министерства обороны Российской Федерации» 610017 г Киров, Октябрьский проспект, 119 Статья поступила 17.08.2011 г, принята к печати 25.08.2011 г
В биотехнологии производства иммунобиологических препаратов (ИБП) важнейшим условием получения полноценного конечного продукта является использование высококачественных питательных сред (ПС).
К основным компонентам ПС, обеспечивающим их питательную ценность, относятся белковые гидроли-
заты, которые традиционно изготавливаются из пищевого (филейная говяжья вырезка) и непищевого (технический казеин, рыбная кормовая мука и т.д.) сырья [1, 2]. При этом доля ПС из непищевого сырья составляет не более 15% от всего ассортимента выпускаемых в мире сред [3].
В этой связи, становятся понятными стремления исследователей, занимающихся конструированием ПС, направленные на поиск непищевого недефицитного белкового сырья, позволяющего изготавливать стандартизованные питательные основы (ПО) и среды.
В настоящее время в качестве основного белоксо-держащего сырья в ПС, нашедших применение в технологии вакцины чумной живой сухой используются кислотные гидролизаты казеина [4, 5].
Однако высокая стоимость и ощутимый дефицит казеина на Российском рынке обусловили необходимость разработки технологии ПО и сред, не зависящей от рыночной конъюнктуры.
Следует отметить, что сырьем для производства сухого казеина служит обезжиренное коровье молоко (обрат). Оно является продуктом переработки цельного молока и используется в технологических процессах приготовления пищевых продуктов, а также при подкормке молодняка в животноводческих хозяйствах. Вполне логичным является вопрос возможности замены готового продукта - казеина на полуфабрикат технологии его получения - обрата, с целью применения последнего в качестве сырья для производства белковых гидролизатов. К положительному моменту при решении данного вопроса относится доступность сырья и его не дефицитность [6]. Помимо этого цена гидролизата из обрата молока будет существенно ниже, чем из сухого казеина. Причина заключается в исключении из технологии казеина самой энергозатратной стадии - термического обезвоживания.
Разработанная сотрудниками НИЦ технология ферментативного гидролиза белков обезжиренного коровьего молока (ФГБОКМ) [7] обеспечила получение субстрата, который по аминокислотному, пептидному и минеральному составам не отличается от стандартного кислотного гидролизата из сухого казеина (КГК) и может использоваться для конструирования микробиологических сред.
Цель работы заключалась в оценке возможности использования жидкой ПС, приготовленной из ферментативного гидролизата белков обезжиренного коровьего молока, в технологии вакцины чумной живой сухой.
Материалы и методы:
В работе использовали вакцинный штамм ЕУ чумного микроба линии НИИЭГ из коллекции ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора (инв. № 52), обладающего типичными культурально - морфологическими, биохимическими и фаголизабельными свойствами.
При получении чистой рабочей культуры выполняли последовательные пересевы штамма на плотные и жидкие ПС, которые приготовили на основе перевара Хоттингера. Для инокуляции ферментера готовили посевной материал в глубинной культуре на аналогичной среде. Микробы выращивали при температуре (27±2) °С в 20-литровых бутылях с 10 л жидкой среды на основе перевара Хоттингера, при аэрации воздухом - 10 л/мин в течение 48 ч.
Культивирование проводили в ферментерах БИОР (Россия) объемом 0,25 м3 с коэффициентом заполнения 0,6. Биореакторы были оснащены магнитными перемешивающими устройствами, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, кислотности среды, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию.
При глубинном культивировании использовали экспериментальные (на основе ФГБОКМ) и контрольные (на основе КГК) среды, с содержанием аминного азота (0,110 ± 0,010) %, концентрацией водородных ионов (7,0±0,2) ед. рН. Состав среды включал: ПО, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, магния сульфат, натрия хлорид, дистиллированную воду. В качестве добавки использовали 20%-ный раствор натрия тиосульфата, который вводили в ферментер перед внесением посевного материала [4].
Процесс осуществлялся по следующему режиму: температура (27±2) °С; кислотность среды (7,1 ± 0,3) ед. рН; скорость непрерывного перемешивания - 176 об/мин, аэрация воздухом - 30 - 35 л/мин; продолжительность - 27 ч.
Параметры кинетики роста культуры рассчитывали по концентрации живых микробов, определяемой методом высева стандартных серийных разведений бактериальных суспензий на агаризованные ПС [8].
Вакцину чумную сухую живую оценивали по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам. В ходе работы определяли характеристики качества биопрепарата: внешний вид, растворимость, наличие посторонний микрофлоры, потерю в массе при высушивании, термостабильность, общую концентрация микробных клеток, концентрацию живых микробных клеток, специфическую безвредность и иммуноген-ность [4].
Результаты и обсуждение:
Выращивание чумного микроба штамма ЕУ проводили в периодических условиях. В процессе выращивания и по его окончанию из ферментеров отбирали пробы культуральной жидкости, в которых определяли концентрацию живых микробов. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Анализ данных таблицы 1, показал, что экспериментальная ПС, приготовленная на основе ФГБОКМ не оказывала негативного воздействия на рост и накопление биомассы чумного микроба штамма ЕУ. Отсутствие статистически значимых различий в результатах по накоплению биомассы в ферментерах с использованием экспериментальной и контрольной ПС позволили рассчитать и проанализировать параметры кинетики роста культур на данных средах (таблица 2).
Представленные в таблице 2 результаты свидетельствовали о том, что культуры, полученные в ПС из ФГБОКМ и КГК, имеют отличия по основным параметрам кинетики роста. Так, на ряду с близкими величинами равновесной концентрации, культуры чумного микроба штамма ЕУ при выращивании в ПС из ФГБОКМ имели более высокие значения максимальной удель-
ПРЕПАРАТЫ
Таблица 1. Динамика накопления биомассы чумного микроба штамма ЕУ,, в процессе его выращивания в ферментерах вместимостью 0,25 м3 с различными питательными средами (Х±195, п=6)
Питательная среда на основе ... Концентрация живых микробов, млрд ж. м. кл.хсм -3, на ? час роста
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
ФГБОКМ 0,5±0,2 0,8±0,3 1,3±0,6 2,5±0,5 4,0±1,0 7,4±0,7 10,8±1,2 14,5±1,9 18,2±3,1 20,9±3,6
КГКд 0,4±0,2 0,7±0,3 1,1±0,3 3,2±1,0 5,4±0,5 7,1±0,6 8,9±0,8 14,2±1,9 19,4±2,7 21,4±4,7
Таблица 2. Параметры кинетики роста культур чумного микроба штамма ЕУ, выращенных в ферментерах вместимостью 0,25 м3 в различных питательных средах (Х±195, п=6)
Питательная среда на основе . Максимальная удельная скорость роста, ч-1 Равновесная концентрация, млрд м.кл.хсм-3 Максимальная абсолютная скорость роста, млрд м.кл.хсм-3 хч-1 Время достижения фазового состояния 95%, ч Продолжительность одной генерации, ч Число генераций Показатель фазового состояния
ФГБОКМ 0,228±0,022 23,5±4,4 1,51±0,2 25,6±3,8 5,0±1,6 5,3±0,8 0,824±0,016
КГК д 0,194±0,010 27,3±2,6 1,32±0,3 29,9±2,4 7,6±1,3 3,6±0,4 0,786±0,015
Таблица 3. Сравнительная оценка физико-химических и иммунобиологических свойств вакцины чумной живой сухой, приготовленной с использованием различных питательных сред
Показатель качества, свойство Требования НД [3] Результаты исследований вакцины, приготовленной с использованием среды из ...
ФГБОКМ КГКд
Внешний вид Пористая масса серовато-белого цвета Пористая масса серовато-белого цвета
Растворимость, мин Через 3 мин гомогенная взвесь серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев Через 3 мин гомогенная взвесь серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев
Посторонняя микрофлора Не допускается Отсутствует
Потеря в массе при высушивании, процент 4,0, не более 3,1 3,3
Термостабильность, сут 4, не менее 5,8 5,5
Общая концентрация микробных клеток, млрд м.кл. х см-3 От 50 до 100 85 80
Концентрация живых микробных клеток, млрд ж.м.кл. х см-3 - 29,3 26,4
Специфическая безвредность Безвредна Безвредна
Иммуногенность, (ЕД50) ж.м.кл., для ...: ' белых мышей 40000, не более 28350 31780
морских свинок 10000,не менее 8258 8980
С55
ной скорости роста и меньшую продолжительность одной генерации с большим числом генераций за цикл культивирования. Кроме того, экспериментальные культуры согласно характеристике фазового состояния (0,824) были наиболее близки к завершению процесса роста.
Исследования показали возможность использования ПС из ФГБОКМ для глубинного выращивания и накопления биомассы чумного микроба штамма ЕУ.
Полученные в процессе глубинного культивирования микробные суспензии использовали на дальнейших этапах приготовления конечного продукта - вакцины чумной живой сухой.
Результаты сравнительной оценки физико - химических и иммунобиологических свойств вакцин, наработанных с использованием экспериментальной и контрольной ПС, представлены в таблице 3.
Литература:
1. Микробиологические питательные среды: Каталог ФГУП Научно - производственного объединения «Питательные среды». - Махачкала, 2001.
2. Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусанов М.Ш. Микробиологические среды. - Казань, Изд. «Фэн», 1999.
3. Телишевская А.Я. Белковые гидролизаты: получение, состав, применение. - М.: «Россельхозакаде-мия», 2000.
4. Промышленный регламент ПР 08461522-07-08 на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, ингаляций и накожного скарификационного нанесения.
Как следует из таблицы 3, вакцина чумная живая сухая, приготовленная с использованием экспериментальной (на основе ФГБОКМ) и контрольной (на основе КГК) ПС, не имеют различий по всем изученным показателям и соответствуют требованиям нормативного документа, регламентирующего их качество.
Таким образом, результаты работы свидетельствуют о том, что замена в составе питательной среды КГК на ФГБОКМ не ухудшила её качественных характеристик и обеспечила получение кондиционного полуфабриката при глубинном культивировании чумного микроба штамма ЕУ. Кроме того, согласно расчётам, использование в технологии вакцины чумной живой более дешевой по сравнению с регламентной среды (на основе ФГБОКМ) обеспечило снижение её себестоимости на 25%.
5. ГОСТ 17626-81. Казеин технический. Введ.: 31.07.1981 г
6. Мурашов А.С. Молочная промышленность Приволжского федерального округа // Молочная промышленность. - 2001 № 4. - С. 8.
7. Некоторые направления стандартизации питательных сред из казеина. Зайцев В.Ф., Маслов С.А., Комоско ГВ., Лещенко А.А., Лазыкин А.Г., Филимонова Г.В.// Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров - 2003 С. 145.
8. Кобазев Н.И. Термодинамические факторы в кинетике размножения простых и сложных прототипов // Журн. физ. хим. - 1962 - Т. 36, вып.1. - С. 21 - 31.
