CC BY
22
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦЕЛЕСТИНОВОГО СИНЕГО В КАК ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ЗОНДА ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ
ХЛОРНОВАТИСТОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
19 19 9 9
А.В. Соколов, , В.А. Костевич, , С.О. Козлов , И.В. Кудрявцев , О.М. Панасенко1
1ФГБУ Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины
ФМБА, Москва
2
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург
Abstract
Hypochlorous acid (HOCl) is produced by myeloperoxidase (MPO) in activated neutrophils. To assay MPO activity we proposed previously a HOCl-selective dye i.e. celestine blue B (CB). Now our aim was to elaborate fluorescent methods of measuring HOCl production by activated neutrophils. Scanning CB fluorescence before and after its reaction with HOCl revealed excitation and emission maxima, respectively, at 487 and 578 nm, which are specific for oxidized product. Confocal microscopy allowed obtaining images of CB- and DAPI-stained neutrophils. Flow cytometry showed that intensity of neutrophils activated by 50 nM PMA was 5 times higher (p<0.05) than in PMA-free cells.
Key words: hypochlorous acid, neutrophils, celestine blue B, fluorescense
HOCl образуется при стимуляции нейтрофилов благодаря активности миелопероксидазы. Ранее мы предложили целестиновый синий B (CB) для селективной спектрофотометрической детекции HOCl. Целью данной работы явилась разработка флуоресцентных методов оценки продукции HOCl нейтрофилами. Продукт реакции CB с HOCl флуоресцировал при 578 нм (возбуждение 487 нм). Методом конфокальной микроскопии получили изображения активированных нейтрофилов, окрашенных CB и DAPI. При проточной цитометрии флуоресценция активированных 50 нМ PMA нейтрофилов была в 5 раз выше (p<0.05), чем у клеток без активатора.
Ключевые слова: хлорноватистая кислота, нейтрофилы, целестиновый синий В, флуоресценция
За последние 10 лет предложен ряд веществ для детекции хлорноватистой кислоты (HOCl) с помощью флуоресцентных методов: 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин, аминофенилфлуоресцеин, дигидро-родамин и др. Однако практически ни одно из предложенных веществ не является абсолютно специфичным к HOCl, но что более важно, такие вещества, как правило, коммерчески недоступны и быстро разрушаются при хранении. Ранее для скрининга ингибиторов активности миелопероксидазы (МПО) нами был
предложен кинетический спектрофотометрический метод измерения продукции HOCl по окислению красителя целестинового синего B - C.I. 51050 (CB) в присутствии таурина [1]. Было доказано, что CB избирательно реагирует на действие HOCl, окисляющей его до гликоля с переходом синей окраски в розовую. CB не окислялся супероксидным анион-радикалом и пероксидом водорода, но реагировал с HOCl и N-хлорамином таурина с высокими константами скорости - 25300 и 119000 M-1xc-1, соответственно. Ингибиторы активности МПО (церулоплазмин, гидразид 4-аминобензойной кислоты, салицилгидроксамовая кислота, 4-аминофенилсульфон, азид натрия), скавенджеры HOCl (цистеин и метионин), а также тиоцианат, конкурирующий с хлоридом за МПО и снижающий выход HOCl, подавляли окисление CB в системе с очищенной МПО и в случае активации нейтрофилов.
Материалы и методы исследования
В настоящей работе мы исследовали возможность использования CB при конфокальной микроскопии и проточной цитометрии для оценки интенсивности синтеза HOCl при активации нейтрофилов. Измерение интенсивности флуоресценции проводили с помощью планшетного флуориметра CLARIOStar (BMG LABTECH, Германия). Изображения клеток получали с использованием инвертированного конфокального лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss «LSM 510 META» (Carl Zeiss, Германия) с объективом Plan-Apochromat 20x/0.8 M27. Интенсивность флуоресценции нейтрофилов (возбуждение - 488 нм, 22 мВт, регистрация флуоресценции - 620±30 нм) оценивали с помощью проточного цитометра NaviousTM (Beckman Coulter). Нейтрофилы (106 клеток/мл) инкубировали в течение 30 минут в присутствии 20 мкМ CB с добавками и без 50 нМ PMA и/или 50 мкМ ABAH. Регистрировали 10000 клеток, полученные данные анализировали с помощью программы Kaluza Flow (Beckman Coulter).
Результаты
Продукт окисления CB под действием HOCl характеризовался максимумом возбуждения при 487 нм с широким пиком эмиссии с максимумом при 578 нм, подобных максимумов не было зафиксировано в спектрах неокисленного CB. Инкубация нейтрофилов в среде с активатором (PMA) и CB приводила к увеличению флуоресценции окисленного CB по мере увеличения времени инкубации нейтрофилов и концентрации PMA. Суспензия нейтрофилов без добавления PMA характеризовалась фоновым увеличением флуоресценции, которая отсутствовала при инкубации клеток без CB вне зависимости от присутствия активатора. Ингибитор активности МПО, ABAH, снижал до фоновых значений интенсивность флуоресценции при стимуляции нейтрофилов PMA. Изучение препаратов нейтрофилов с помощью конфокальной микроскопии показало, что клетки, находившиеся в среде без CB, не обладают флуоресценцией, характерной для окисленного CB. Контрольные опыты показали, что препарат CB в концентрации 1 мМ не был токсичен для клеток и в нём отсутствовали примеси липополисахарида. При инкубации нейтрофилов с PMA и CB на препаратах были хорошо различимы локальные участки интенсивной флуоресценции. Как правило, они совпадали с тяжами ДНК,
вытянутыми от клеток. Такие структуры называют внеклеточными нейтрофильными ловушками (NET), которые представляют собой один из факторов защиты от патогенов. Известно, что NET выбрасываются активированными нейтрофилами; при этом на тяжах ДНК находятся компоненты гранул нейтрофилов, в том числе и активная МПО. Таким образом, использование CB позволяет выявить участки синтеза HOCl на препаратах нейтрофилов, активированных in situ. С помощью проточного цитометра была измерена интенсивность флуоресценции нейтрофилов при различных комбинациях CB, PMA и ингибитора активности МПО (ABAH) в среде. Сравнение гистограмм флуоресценции нейтрофилов в среде с CB и без него позволяет предположить проникновение красителя в клетки (увеличение флуоресценции в 7 раз, p<0,05). При стимуляции нейтрофилов 50 нМ PMA происходило достоверное (p<0,05) увеличение флуоресценции клеток в 5 раз по сравнению с неактивированными нейтрофилами. Специфический ингибитор активности МПО, ABAH, уменьшал интенсивность флуоресценции в 1,5 раза как у нейтрофилов без стимуляции PMA, так и у стимулированных 50 нМ PMA клеток.
Выводы
Таким образом, CB позволяет оценивать интенсивность синтеза HOCl нейтрофилами и влияние на этот процесс ингибиторов МПО, например, ABAH, что открывает возможности использовать СВ для оценки функциональной активности нейтрофилов и ферментативной активности МПО.
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 18-515-00004).
Список литературы
1. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Kozlov S.O., Donskyi I.S., Vlasova I.I., Rudenko A.O., Zakharova E.T., Vasilyev V.B., Panasenko O.M. Kinetic method for assaying the halogenating activity of myeloperoxidase based on reaction of celestine blue B with taurine halogenamines // Free Radic. Res. 2015. Vol. 46. P. 777-789.
