CC BY
89
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ОрЫгЫНаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbW Meditsinskaya Immunologiya 2018, Т. 20, № 5, стр. 699-710 * ^ . . . . . 2018, Vol. 20, No5, pp. 699-710
© 2018, спбро рааки Original articles © 2018, spb raaci
СВЯЗЬ МЕЖДУ АКТИВНОЙ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗОЙ И ХЛОРИРОВАННЫМ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНОМ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
Соколов А.В.1, 2' 3' 4, Костевич В.А.1, 2, Горбунов Н.П.1, Григорьева Д.В.5, Горудко И.В.5, Васильев В.Б.1, 3, Панасенко О.М.2, 6
1ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБУ«Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» России, Москва, Россия
3 ФГБОУВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург, Россия
4 Центр доклинических трансляционных исследований, ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
5 Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь
6 ГБОУВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Резюме. Миелопероксидаза является ключевым фактором, отвечающим за развитие окислитель-ного/галогенирующего стресса при воспалении. Ранее в плазме пациентов с воспалительными заболеваниями различной этиологии, в том числе при атеросклерозе, нами были обнаружены комплексы, образованные миелопероксидазой и ее физиологическим ингибитором, церулоплазмином. Анализ регуляции активности миелопероксидазы церулоплазмином показал, что при воспалении могут возникать условия, при которых церулоплазмин будет модифицирован хлорноватистой кислотой, HOCl — специфическим продуктом катализа миелопероксидазы. Целью данного исследования был анализ связи между активностью миелопероксидазы и концентрацией церулоплазмина, модифицированного HOCl (хлорированного церулоплазмина), в образцах плазмы крови пациентов с сердечнососудистыми заболеваниями.
Были получены специфические антитела против миелопероксидазы, церулоплазмина, в том числе модифицированного HOCl, отработаны условия твердофазного иммуноферментного анализа. С помощью комбинации сорбции антигенов на твердой фазе и последующего выявления их собственной активности либо пероксидазной активности меченых антител были разработаны высокочувствительные методы определения миелопероксидазы (концентрация, пероксидазная и галогенирующая активность), концентрации церулоплазмина, в том числе модифицированного HOCl. Обнаружена положительная корреляция между концентрацией миелопероксидазы, ее активностью и концентрацией церулоплазмина, модифицированного HOCl. Выводы: впервые в плазме крови пациентов с сер-
Адрес для переписки:
Соколов Алексей Викторович
ФГБНУ «Институт экспериментальной медициныI» 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.
Тел.: 8(812) 234-56-06, 234-94-89. E-mail: [email protected]
Образец цитирования:
А.В. Соколов, В.А. Костевич, Н.П. Горбунов, Д.В. Григорьева, И.В. Горудко, В.Б. Васильев, О.М. Панасенко «Связь между активной миелопероксидазой и хлорированным церулоплазмином в плазме крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями» //Медицинская иммунология, 2018. Т. 20, №5. С. 699-710.
doi: 10.15789/1563-0625-2018-5-699-710 © Соколов А.В. и соавт., 2018
Address for correspondence:
Sokolov Alexey V.
Institute of Experimental Medicine
197376, Russian Federation, St. Petersburg,
Acad. Pavlov str., 12.
Phone: 7 (812) 234-56-06, 234-94-89.
E-mail: [email protected]
For citation:
A.V. Sokolov, V.A Kostevich, N.P. Gorbunov, D.V. Grigorieva, I.V. Gorudko, V.B Vasilyev., O.M Panasenko. "A link between active myeloperoxidase and chlorinated ceruloplasmin in blood plasma of patients with cardiovascular diseases ", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2018, Vol. 20, no. 5,pp. 699-710. doi: 10.15789/1563-0625-2018-5-699-710
DOI: 10.15789/1563-0625-2018-5-699-710
дечно-сосудистыми заболеваниями обнаружен церулоплазмин, модифицированный HOCl. Получена достоверная положительная корреляционная зависимость между концентрацией хлорированного це-рулоплазмина и активностью миелопероксидазы. Предполагается, что физиологический ингибитор миелопероксидазы, церулоплазмин, претендует на роль мишени для продукта ее катализа — HOCl.
Ключевые слова: миелопероксидаза, галогенирующий стресс, церулоплазмин, пероксидазная активность, сердечнососудистые заболевания, биомаркер
A LINK BETWEEN ACTIVE MYELOPEROXIDASE AND CHLORINATED CERULOPLASMIN IN BLOOD PLASMA OF PATIENTS WITH CARDIOVASCULAR DISEASES
Sokolov A.V.a' b' c' d, Kostevich V.A.a' b, Gorbunov N.P.a, Grigorieva D.V.e, Gorudko I.V.e, Vasilyev V.B.a c, Panasenko O.M.b f
a Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
b Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russian Federation
c St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation
d Centre of Preclinical Translational Research, V. Almazov National Medical Research Centre, St. Petersburg, Russian Federation
e Belarusian State University, Minsk, Republic of Belarus
f Russian National N. Pirogov Research Medical University, Moscow, Russian Federation
Abstract. Myeloperoxidase is a key factor promoting development of halogenative/oxidative stress under inflammatory conditions. Previously, we have discovered complexes including myeloperoxidase and its physiological inhibitor, ceruloplasmin in blood plasma of patients with inflammatory diseases of different etiology, e.g., atherosclerosis. Studies on regulation of myeloperoxidase activity by ceruloplasmin have shown that hypochlorous acid, a specific product of myeloperoxidase action, is likely to modify ceruloplasmin during inflammation. The present study was aimed for analysis of relationships between the myeloperoxidase activity, native, and HOCl-modified ceruloplasmin levels in blood plasma samples of the patients with cardiovascular diseases.
Specific antibodies against myeloperoxidase, ceruloplasmin, and HOCl-modified ceruloplasmin were obtained and specific enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were developed. A combination of highly sensitive methods of myeloperoxidase assay i.e., solid-phase adsorption of antigens with subsequent testing of either their activity, or peroxidase-labeled antibody activity allowed elaborating the highly sensitive assays for ceruloplasmin and its HOCl-modified molecules, and for myeloperoxidase (concentration, peroxidase and halogenating activity). Positive correlation was proven between the myeloperoxidase concentration and activities. HOCl-modified ceruloplasmin content also correlated with myeloperoxidase activity.
The HOCl-modified ceruloplasmin was first discovered in blood plasma samples from patients with cardiovascular diseases. In view of correlation between myeloperoxidase activity and HOCl-modified ceruloplasmin content in plasma, we suggest that HOCl production is aimed for suppression of myeloperoxidase-inhibitory function of ceruloplasmin.
Keywords: myeloperoxidase, halogenative stress, ceruloplasmin, peroxidase activity, cardiovascular diseases, biomarker
Исследование поддержано грантом РНФ 17-75-30064 (выделение и очистка СР и МРО, получение антител против белков), грантами РФФИ 15-04-03620 (получение антител против СР-НОС1, измерение концентрации СР, СР-НОС1), 17-04-00530, БРФФИ (Б16Р-015) (измерение концентрации и активности МРО).
Сокращения: СР — церулоплазмин, СР-НОС1 — модифицированный НОС1 церулоплазмин, НА —
галогенирующая активность, МРО — миелопероксидаза, РА — пероксидазная активность, Е (РА) — общая пероксидазная активность.
Введение
Развитие сердечно-сосудистых заболеваний ассоциировано с хроническим воспалением и активацией лейкоцитов. Активированные нейтро-филы секретируют миелопероксидазу (МРО, К.Ф. 1.7.1.11, донор:Н2О2-оксидоредуктаза), по-
вышенная концентрация которой в плазме пациентов является предиктором инфаркта миокарда [2,15]. MPO содержится главным образом в азурофильных гранулах нейтрофилов и в моноцитах, составляя около 5 и 0,9% от общего белка этих клеток соответственно [25]. При взаимодействии с H2O2 происходит превращение MPO в высокореакционное Соединение I, которое, наряду с классическим одноэлектронным окислением пероксидазных субстратов (например, о-дианизидина, тирозина [3, 35]), обладает уникальной способностью катализировать двухэлек-тронное окисление хлорид-иона с образованием хлорноватистой кислоты (HOCl). Образование HOCl в описанном выше галогенирующем цикле функционирования MPO считается важным фактором врожденного иммунитета. Однако при хроническом воспалении HOCl, продуцируемая MPO, может модифицировать молекулы организма-хозяина и приводить к развитию окисли-тельного/галогенирующего стресса, сопровождающего многие заболевания [6, 7].
MPO формирует в плазме крови комплексы с церулоплазмином (CP), в составе которых могут оказываться липопротеины низкой плотности [27, 31]. CP претендует на роль эндогенного ингибитора хлорирующей активности MPO и окислительной модификации липопротеинов низкой плотности [9, 24, 28]. Однако в наших опытах было показано, что CP эффективно ин-гибирует только хлорирующую, но не бромиру-ющую активность MPO, что, вероятно, связано с большим сродством бромида к активному центру MPO [32]. Кроме того, ингибирование активности MPO возможно только в случае ин-тактности полипептидной цепи CP, которая может расщепляться провоспалительными протеи-назами, например, тромбином [26, 30]. Недавно нами было показано, что альбумин сыворотки крови и липопротеины низкой плотности, модифицированные HOCl, активируют респираторный взрыв нейтрофилов и секрецию ими MPO [6, 8, 21, 31].
Маркеры галогенирующего стресса — молекулы, модифицированные HOCl, были обнаружены в атеросклеротических бляшках [7, 17]. Известно о наличии аутоантител против модифицированных HOCl липопротеинов низкой плотности у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями [1]. Учитывая, что MPO в плазме крови взаимодействует с CP и при определенных условиях может проявлять ферментативную активность, актуальным явилось определение концентрации CP, модифицированного HOCl (CP-HOCl), а также оценка корреляционных
связей СР-НОС1 с активностью и концентрацией МРО в плазме крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Материалы и методы
Реактивы
В работе были использованы следующие реактивы: конъюгат антител против IgG кролика с пероксидазой из корней хрена, UNOsphere Q, агароза Bio-Gel A-1.5m fine (Bio-Rad, США); Br2, KCN, NaCl, NaBr, триэтиламин, цитрат натрия, этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (Merck, Германия); NaN3, глицерин, Кумасси R-25G, мер-каптоэтанол, персульфат аммония, Tris (Serva, Германия); NaOCl (1,79 M), 6-аминокапроновая кислота, Ю-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин, гепарин, глицин, конъюгат антител против IgG крыс с пероксидазой из корней хрена, неомици-на трисульфат, o-дианизидин, p-фенилендиамин, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, фенил-агароза, SDS, Sephacryl S-2GG HR, Sephadex G-75 Superfine, триэтаноламин, фенилметилсульфонилфторид (Sigma, США); акриламид, ^№-метилен-бис-акриламид, ^^№№-тетраметилэтилендиамин («Медиген», Россия). Растворы для хроматографии были приготовлены с использованием апирогенной деионизованной воды с удельным сопротивлением 18,2 MОм x см. BrCN синтезирован при бромировании KCN в двухфазной системе: вода-дихлорэтан. Лиганды для аффинной хроматографии (гепарин, неомицин, CP) иммобилизовали на BrCN-активированной агаро-зе [13].
Общая характеристика пациентов, включенных в исследование
Проведенное исследование одобрено комитетом по этике Республиканского научно-практического центра «Кардиология» Министерства здравоохранения Республики Беларусь (г. Минск, Беларусь) (протокол заседания № 2, п. 6 от 13.G2.2GG9 г., заключение этической экспертизы № 15/G2/G9 от 18.G2.2GG9 г., приказ № 66 от 13.G2.2GG8 г.). Перед проведением всех процедур бралось письменное информированное согласие пациентов. Всего в исследование включено 69 пациентов: 19 — с хронической ише-мической болезнью сердца (стабильная стенокардия) и 5G — с острым коронарным синдромом (нестабильная стенокардия и острый инфаркт миокарда). В исследовании приняли участие 51 мужчина и 18 женщин (средний возраст всех пациентов составил 55,7±1,3 лет). Все лица, включенные в исследование, прошли тщательное клинико-инструментальное и лабораторное обследование, включающее эхокардиографию,
ультразвуковое исследование брахиоцефальных артерий, суточное мониторирование ЭКГ и артериального давления, при наличии показаний — коронароангиографию.
Пробоподготовка образцов плазмы и сыворотки крови
Анализ данных литературы и собственные предварительные эксперименты [2, 3, 4, 20] свидетельствовали о том, что для адекватного измерения активности и концентрации МРО в плазме кровь должна быть стабилизирована ЭДТА либо цитратом натрия. Использование гепарина в качестве антикоагулянта либо образцов сыворотки крови приводит к результатам, искаженным секрецией МРО из нейтрофилов. Для измерения концентрации СР, напротив, адекватные результаты были получены только при анализе сыворотки крови, что обусловлено ингибирую-щим действием хелаторов ионов кальция на ок-сидазную активность СР. В данном исследовании образцы венозной крови, стабилизированной цитратом натрия, получали у пациентов в Республиканском научно-практическом центре «Кардиология» и в течение 2 часов с момента взятия крови ее центрифугировали при 600 g в течение 15 минут. Отобранную плазму повторно центрифугировали в таком же режиме для удаления следов тромбоцитов. Параллельно для анализа концентрации СР забирали вторую пробу венозной крови без антикоагулянтов, которую через 30 минут после свертывания центрифугировали при 600 g в течение 15 минут и отбирали сыворотку. Образцы плазмы и сыворотки делили на 5-6 аликвот по 0,2 мл и хранили при -70 °С до выполнения измерений.
Получение белков
МРО была очищена из экстракта лейкоцитов здоровых доноров с помощью хроматографий на гепарин-агарозе, фенил-агарозе и Sephacryl S-200 НЯ. Препарат характеризовался А430/А280 (Я^) около 0,85, что соответствует гомогенному ферменту [29]. Для получения препарата мономерного СР, содержащего более 95% не-фрагментированных 132 кДа-молекул с А^/ А280 > 0,049, плазму крови с добавлением 1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфтори-да подвергали хроматографии на UNOsphere Q и неомицин-агарозе [13].
Спектрофотометрическое определение концентрации веществ
Спектры поглощения препаратов были измерены с помощью спектрофотометра СФ-2000-02 («ОКБ-Спектр», Россия). Концентрацию реагентов определяли, используя коэффициенты экс-тинкции: димер МРО - е430 = 178 000 М-1 х см-1 [14],
CP - e610 = 10 000 M-1 х см-1 [23], H2O2
i = 43,6
M-1 х см-1 [16], ClO- - е292 = 350 M-1 х см-1 [22].
Получение антител против CP и CP-HOCl, а также выявление CP-HOCl
Антитела против CP от крыс получали после 3-х иммунизаций крыс препаратом интактного CP, из сыворотки животных выделяли фракцию IgG и проводили их аффинную очистку на агаро-зе с иммобилизованным CP.
С помощью иммунизации кроликов CP-HOCl были получены специфические поликлональные антитела кроликов против CP-HOCl, использованные для сорбции модифицированного CP на твердой фазе и его последующей детекции с помощью антител крысы против CP. Для получения антигена CP инкубировали с HOCl при мольном соотношении окислитель:СР = 20:1 в течение 30 минут при 37 °С. Модифицированный CP отделяли от неокисленного белка с помощью диск-электрофореза в ПААГ [18], вырезали из геля зону окисленного CP. Далее CP-HOCl подвергали препаративному электрофорезу с SDS [19], вырезали белок из геля и использовали для иммунизации кроликов. После 4-х иммунизаций с интервалом в 2 недели была получена антисыворотка против CP-HOCl. Из сыворотки выделяли фракцию IgG с помощью осаждения сульфатом аммония. Для очистки антител от фракции, реагирующей с интактным CP-проводили негативную аффинную хроматографию на агарозе с иммобилизованным CP.
Измерение концентрации CP-HOCl в плазме крови осуществляли по следующему протоколу: антитела кроликов против CP-HOCl (5 мкг/мл), растворенные в 40 мМ Na2CO3, 80 мМ NaHCO3, pH 9,4, адсорбировали в 96-луночных полисти-рольных планшетах в течение ночи при 4 °С. После 3-х отмывок фосфатно-солевым буфером (PBS: 8,7 мМ Na2HPO4, 1,5 мМ KH2PO4, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl; рН 7,4), содержащим 0,05%-ый Tween 20, в лунки помещали препараты CP, модифицированного 20-молярным избытком HOCl, в концентрациях 0; 0,625; 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 нг/мл и образцы плазмы, разбавленные от 10 до 80 раз PBS, содержащим 0,05%-ый Tween 20. После 60 минут инкубации в термошейкере при 37 °С и 270 об/мин лунки планшета отмывали 3 раза PBS, содержащим 0,05%-ый Tween 20. В лунки помещали аффинные антитела крыс против CP (50 мкг/мл), через 60 минут планшет отмывали 3 раза PBS, содержащим 0,05%-ый Tween 20. В лунки помещали конъюгат антител против IgG крыс с пероксидазой из корней хрена (1:5000), через 60 минут планшет отмывали 3 раза PBS, содержащим 0,05%-ый Tween
е
20. В планшет помещали раствор, содержащий 2 мг 3,3',5,5'-тетраметилбензидина, 1 мМ H2O2 в 12 мл 50 мМ Na-ацетатного буфера, pH 5,5. Через 5 минут инкубации реакцию останавливали 2 M серной кислотой и измеряли поглощение при 405 нм с помощью планшетного монохрома-торного флуориметр-люминометр-спектрофото-метра (CLARIOstar, BMG LABTECH, Германия). Калибровочный график зависимости A405 от [CP-HOCl] обрабатывали в программе MS Excel 2002 как линейную функцию (коэффициент детерминированности R2, нормированный от 0 до 1, составлял не менее 0,98). Концентрацию CP-HOCl в образце плазмы крови выражали в нг/мл после сравнения поглощения образца плазмы (с учетом его разбавления) с калибровочной прямой для модифицированного CP.
Определение концентрации CP
Для количественного определения концентрации CP в плазме крови сравнивали р-фенилендиамин-оксидазную активность образца сыворотки крови с активностью серии калибровочных растворов CP в модифицированном для микроформата варианте [35]. В лунки 96-луночного планшета вносили по 10 мкл проб сыворотки крови либо калибровочных растворов, содержащих 100-1300 мкг/мл очищенного CP [13], во все лунки добавляли по 200 мкл 0,2% р-фенилендиамина в 0,4 М Na-ацетатном буфере, рН 5,5. Через 60 минут реакцию останавливали, внося в лунки по 40 мкл 0,5% NaN3 (ингибитор активности CP). Измеряли поглощение проб при 530 нм с помощью планшетного монохрома-торного флуориметр-люминометр-спектрофото-метра (CLARIOstar, BMG LABTECH, Германия). В программном обеспечении прибора (Mars) строили калибровочную прямую, по которой прибор автоматически рассчитывает содержание CP в образцах — в мкг/мл.
Определение пероксидазной активности MPO и общей пероксидазной активности в плазме крови
Для спектрофотометрического определения общей пероксидазной активности плазмы крови (Z (PA)) в буферный раствор, содержащий 0,2 М Na2HP04/0,1 М лимонной кислоты (рН 4,5), добавляли субстрат о-дианизидин (380 мкМ) и 1/13,3 объема плазмы крови (например, 60 мкл плазмы до объема образца 800 мкл). Реакцию запускали добавлением 100 мкМ Н2О2 и в кинетическом режиме в течение 6-8 минут определяли скорость окисления о-дианизидина — А460/мин [4, 5]. Измерения проводили при 20 °С на спектрофотометре СОЛАР PB 2201 (г. Минск, Беларусь). А460/мин рассчитывали как тангенс угла наклона начального линейного участка кине-
тической кривой, содержащей минимум шесть экспериментальных точек, по линейной экстраполяции с использованием статистической программы графического редактора Origin 7.0. Z (PA) рассчитывали с учетом разбавления образца плазмы крови:
Z (PA) = ДА/мин х 13,3.
Пероксидазную активность МРО в плазме крови (МРО (РА)) оценивали разностным методом. Для этого готовили дополнительную пробу, содержащую, помимо всех вышеперечисленных компонент, специфический ингибитор ферментативной активности МРО — гидразид 4-амино-бензойной кислоты (50 мкМ). МРО (РА) вычисляли согласно соотношению:
МРО (PA) = (ДА/мин - ДАинг/мин) х 13,3.
где ДА/мин и ДАинг/мин — скорость окисления o-дианизидина в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно.
Определение концентрации MPO и ее галогени-рующей активности
Измерение концентрации MPO в плазме крови осуществляли с помощью разработанного ранее [3] оригинального метода иммунофермент-ного анализа с использованием антител против MPO, полученных иммунизацией крыс и кроликов.
Галогенирующую активность MPO (HA) в плазме крови оценивали по флуоресценции ре-зоруфина, который образовывался при окислении 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазина в присутствии HOBr, продуцируемой активной MPO, которая связывалась при инкубации образцов в планшетах с адсорбированными на поверхности лунок аффинными антителами против MPO, полученными от крыс [3]. Антитела (5 мкг/мл), растворенные в 40 мМ Na2CO3, 80 мМ NaHCO3, pH 9,4, адсорбировали в 96-луночных полисти-рольных планшетах в течение ночи при 4 °С. После 3-х отмывок PBS, содержащим 0,05%-ый Tween 20, в лунки помещали очищенную MPO в концентрациях 0; 0,625; 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 нг/мл и образцы плазмы, разбавленные от 10 до 80 раз PBS, содержащим 0,05%-ый Tween 20. После 60 минут инкубации в термошейкере при 37 °С и 270 об/мин лунки планшета отмывали 3 раза PBS, содержащим 0,05%-ый Tween 20. В лунки помещали раствор, содержащий 1 мкМ 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазина, 10 мкМ H2O2, 20 мМ NaBr, 200 мМ (NH4)2SO4, 24 мМ Na-цитратный буфер, pH 6,0. Через 30 минут инкубации в термошейкере при 37 °С и 270 об/мин измеряли флуоресценцию резору-
фина при 580-620 нм (возбуждение 535-555 нм) с помощью планшетного монохроматорного флуориметр-люминометр-спектрофотометра (CLARIOstar, BMG LABTECH, Германия). Калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции I от [MPO] обрабатывали в программе MS Excel 2002 как биномиальную функцию I = a[MPO]2+b[MPO]+c (коэффициент детерминированности R2, нормированный от 0 до 1, составлял не менее 0,97). Вычисляли активность MPO в плазме с учетом разбавления образца и выражали ее как нг/мл очищенной MPO.
Статистическая обработка результатов
Эксперименты повторяли три раза (n = 3), среднее значение рассчитывали по формуле:
Xm = (1/n)SX„
где Х — значение для каждого измерения. Стандартную ошибку выражали как S*/n, где
S*=
2 (Xi-XJ2
(n-1)
Результаты
Для определения параметров корреляции использовали коэффициент корреляции Пирсона (г).
Были исследованы: содержание СР и СР-НОС1, МРО (РА) и МРО (НА), концентрация МРО и Е (РА) в 69 образцах плазмы крови доноров с различной степенью тяжести сердечно-сосудистых заболеваний (табл. 1).
Был проведен анализ корреляционных связей измеренных показателей (табл. 2). Концентрация МРО была связана положительной корреляционной связью с МРО (НА) (г = 0,87, р < 0,0001, рис. 1А) и МРО (РА) (г = 0,51, р < 0,0001). Концентрация СР-НОС1 была связана положительной корреляционной связью с концентрацией МРО (г = 0,76, р < 0,0001, рис. 1Б) и с МРО (НА) (г = 0,80, р < 0,0001, рис. 1В). В качестве показателя удельной активности МРО было использовано отношение концентрации МРО к Е (РА), оцененной по окислению о-дианизидина. Продемонстрирована положительная корреляционная связь данного показателя с концентрацией СР-НОС1 (г = 0,86, р < 0,0001, рис. 1Г). Интересно, что концентрация СР и Е (РА) не коррелировала ни с одним из перечисленных показателей.
ТАБЛИЦА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ИЗМЕРЕННЫХ В ОБРАЗЦАХ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ
TABLE 1. GENERAL CHARACTERISTICS OF THE MARKERS MEASURED IN BLOOD SAMPLES OF PATIENTS
Показатель - обозначение, единицы измерения Marker: abbreviations, units Среднее ± стандартная ошибка Mean ± standard error Медиана (минимальное -максимальное значение) Median (minimum -maximum value)
Концентрация MPO - MPO, нг/мл MPO concentration: MPO, ng/ml 137,3±56,9 116,4 (37,1-680,4)
Галогенирующая активность MPO - MPO (HA), нг/мл Halogenating activity of MPO: MPO (HA), ng/ml 71,2±62,7 44,3 (3,2-662,1)
Пероксидазная активность MPO - MPO (PA), 1/мин Peroxidase activity of MPO: MPO (PA), 1/min 0,0776±0,0575 0,0559 (0-0,364)
Общая пероксидазная активность - £ (PA), 1/мин Total Peroxidase activity: £ (PA), 1/min 0,715±0,181 0,713 (0,178-1,215)
Концентрация CP - CP, мкг/мл CP concentration: CP, ig/ml 312±93 305 (65-613)
Концентрация CP, модифицированного HOCI - CP-HOCI, нг/мл Concentration of HOCl-modified CP: CP-HOCl, ng/ml 65±63 23 (1-344)
Отношение концентрации MPO к общей пероксидаз-ной активности - MPO/£ (PA), нг х мин/мл Ratio of MPO concentration and total peroxidase activity: MPO/£ (PA), ng х min/mL 212±103 171 (59-857)
700 А (A)
f 600 ~ 500
ш
1 400
<
300
0
1 200
100
0
r = 0,87
ftL
a » л" - - Л
i
/m
g/ (n 300
л /м нг
Ö о x 200
CL о
100 О О % О X V ** "is»
0 Ш™ о
100 200 300 400 500 МРО (НА), нг/мл (ng/ml)
600
400
300
о 200
CL
О
100
0
0 100 200 300 400 500 600 700 МРО, нг/мл (ng/ml) 400 В (C)
r = 0,80
ö 200
О
CL
о
100
700
Б (B)
r = 0,76
0 100 200 300 400 500 600 700 МРО, нг/мл (ng/ml)
400 Г (D)
r = 0,86
300
0 о А*. ° -Ais?3''
100 200 300 400 500 600 700 800 900 МРО/Z (РА), нг х мин/мл (ng х min/ml)
Рисунок 1. Графики зависимости галогенирующей активности MPO от концентрации MPO (А); CP, модифицированного HOCl, от концентрации MPO (Б); CP, модифицированного HOCl, от галогенирующей активности MPO (В); CP, модифицированного HOCl, от отношения концентрации MPO к общей пероксидазной активности плазмы крови (Г)
Figure 1. Dependence plots between halogenating activity of MPO and its concentration (A); concentration of HOCl-modified CP and concentration of MPO (B); concentration of HOCl-modified CP and halogenating MPO activity (C); concentration of HOCl-modified CP, and a ratio between MPO concentration and total peroxidase activity (D)
ТАБЛИЦА 2. КОРРЕЛЯЦИОННАЯ МАТРИЦА ИЗМЕРЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
TABLE 2. CORRELATION MATRIX OF THE MEASURED MARKERS
0
0
0
MPO MPO (HA) MPO (PA) Z (PA) CP CP-HOCl
MPO (HA) r = 0,87; p < 0,0001 -
MPO (PA) r = 0,51; p < 0,001 r = 0,47; p < 0,0001 -
Z (PA) r = 0,00; p = 0,61 r = -0,19; p = 0,11 r = 0,32; p = 0,05 -
CP r = 0,42; p = 0,01 r = 0,20; p = 0,09 r = 0,04; p = 0,83 r = 0,07; p = 0,69 -
CP-HOCl r = 0,76; p < 0,0001 r = 0,80; p < 0,0001 r = 0,26; p = 0,1119 r = -0,26; p = 0,11 r = 0,31; p = 0,05 -
MPO/Z (PA) r = 0,89; p < 0,0001 r = 0,84; p < 0,0001 r = 0,29; p = 0,07 r= -0,31; p = 0,06 r = 0,40; p = 0,01 r = 0,86; p < 0,0001
Примечание. Обозначения столбцов и строк см. в таблице 1, в ячейках представлены значения коэффициента корреляции Пирсона.
Note. For abbreviated names of columns and rows, see Table 1. The cells represent values of Pearson correlation quotient.
Обсуждение
Ранее нами было показано, что концентрация МРО повышена у пациентов с острым коронарным синдромом по сравнению со здоровыми донорами, а прогрессивное снижение МРО (РА) в процессе тромболитической терапии коррелирует с благоприятным исходом заболевания [4]. Нами были разработаны оригинальные методы оценки МРО (РА) и МРО (НА), а также содержания МРО, иммуноферментный анализ для оценки концентрации СР-НОС1. Наличие специфической МРО (НА) позволило разработать упрощенный вариант иммунофермент-ного анализа, в котором после сорбции МРО на твердой фазе возможно выявление активности МРО [8]. Этот подход существенно сокращает время анализа. В прототипе метода с помощью 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазина выяв -лялась МРО (РА), адсорбированной на антителах [20], однако, как показали наши эксперименты, бромирующая активность МРО практически не подавляется СР [32] и, следовательно, окисление ацетил-3,7-дигидроксифеноксазина под действием НОВг, продуцируемой МРО, более адекватно отражает концентрацию МРО. Это подтверждается достоверной корреляционной связью между концентрацией МРО и МРО (НА) (рис. 1А). Обнаружение комплексов, включающих СР и МРО, в плазме пациентов с атеросклерозом [27] предполагало возможность образования при сердечно-сосудистых заболеваниях СР, модифицированного НОС1 — основным продуктом катализа МРО, однако только в данном исследовании впервые удалось обнаружить хлорированный СР в плазме крови больных с сердечно-сосудистой недостаточностью.
При сопоставлении измеренных показателей на репрезентативном количестве образцов плазмы крови (п = 69) от пациентов с различной степенью тяжести сердечно-сосудистых заболеваний нам удалось проследить ряд корреляционных связей, хорошо согласующихся с данными, полученными на экспериментальных моделях исследования ферментативных свойств МРО. Во-первых, МРО (РА) в плазме крови положительно коррелирует с концентрацией МРО и МРО (НА). Во-вторых, получена положительная корреляционная зависимость между концентрацией МРО и показателем галогенирующего стресса (концентрация СР, модифицированного НОС1) и отношением концентрации МРО к Е (РА). Ранее нами было показано, что по мере иммунопреципитации СР из плазмы крови снижается эффективность ингибирования плазмой МРО (РА) [33]. Обращает на себя внимание факт, что концентрации МРО и СР-НОС1 довольно близки, такой результат можно объяснить тем,
что комплекс между MPO и CP в плазме крови относительно стабилен [27], и, вероятнее всего, при окислительном/галогенирующем стрессе у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями модификации подвергается CP, находящийся в непосредственном контакте с MPO.
Важно отметить, что концентрация CP, измеренная по степени окисления его синтетического субстрата ^-фенилендиамина, не коррелирует ни с одним из перечисленных показателей. Данный факт подтверждает важность определения целостности полипептидной цепи CP, а не его концентрации, поскольку именно интактность CP определяет эффективное ингибирование активности MPO [9, 28, 32]. Например, степень протеолиза CP в синовиальной жидкости коррелирует с тяжестью симптомов ревматоидного артрита [26]. Нами было показано, что CP взаимодействует с протеиназами нейтрофилов и матриксными металлопротеиназами 2 и 12, что также способствует расщеплению его полипептидной цепи [10, 11, 12]. Разработка методов количественной оценки непротеолизованного CP представляется перспективной и может быть реализована при получении моноклональных антител против участков CP, подвергающихся протеолитической деградации при воспалении. Учитывая, что при физиологических условиях MPO также способна катализировать образование бромноватистой кислоты (HOBr) [34], представляется перспективным получение антител против CP, модифицированного HOBr, с целью анализа модификации белка этим оксидантом.
На роль регуляторов активности MPO, кроме CP, претендуют низкомолекулярные соединения (тиоцианат, тирозин, глутатион и урат) [36], в будущем определение их концентрации в плазме крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями может дополнить картину регуляции развития галогенирующего стресса, опосредованного активностью MPO и других гемсодержащих пероксидаз человека.
Благодарности
Авторы выражают благодарность профессору В.Н. Кокрякову (ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины») за любезно предоставленную лейкоцитарную массу здоровых доноров, благодарность за предоставленные образцы плазмы и сыворотки крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями — профессору Л.З. Полонецкому (РНПЦ «Кардиология»). Планшетный монохроматорный флуориметр-люминометр-спектрофотометр (CLARIOstar, BMG LABTECH, Германия) получен при поддержке программы РАМН Human Proteome.
Список литературы / References
1. Белик И.В., Иванцова А.А., Мамедова З.Э., Денисенко А.Д. Содержание антител к модифицированным липопротеинами низкой плотности и их комплексов в крови пациентов с различными проявлениями атеросклероза // Биомедицинская химия, 2016. Т. 62. С. 471-475. [Belik I.V., Ivantsova A.A., Mamedova Z.E., Denisenko A.D. Antibodies against modified low-density lipoproteins and their complexes in blood of patients with various manifestations of atherosclerosis. Biomeditsinskaya khimiya = Biomedical Chemistry, 2016, Vol. 62, pp. 471-475. (In Russ.)]
2. Буненков Н.С., Комок В.В., Соколов А.В., Немков А.С. Новые возможности оценки интраопера-ционного ишемически-реперфузионного повреждения миокарда при операциях реваскуляризации в условиях искусственного кровообращения и на работающем сердце // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал имени академика Б.В. Петровского, 2017. Т. 16, № 2. С. 40-48. [Bunenkov N.S., Komok V.V., Sokolov A.V., Nemkov A.S. New methods of intraoperative evaluation of myocardial ischemic-reperfusion injury during on- and off-pump coronary artery bypass grafting. Klinicheskaya i eksperimental'naya khirurgiya. Zhurnal imeni Akademika B.V. Petrovskogo = Clinical and Experimental. Surgery Petrovsky Journal, 2017, Vol. 16, no. 2, pp. 40-48. (In Russ.)]
3. Горудко И.В., Черкалина О.С., Соколов А.В., Пулина М.О., Захарова Е.Т., Васильев В.Б., Черенке -вич С.Н., Панасенко О.М. Новые подходы к определению концентрации и пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови человека // Биоорганическая химия, 2009. Т. 35. С. 629-639. [Gorudko I.V., Cherkalina O.S., Sokolov A.V., Pulina M.O., Zakharova E.T., Vasilyev V.B., Cherenkevich S.N., Panasenko O.M. New approaches to the measurement of the concentration and peroxidase activity of myeloperoxidase in human blood plasma. Bioorganicheskaya khimiya = Bioorganic Chemistry, 2009, Vol. 35, pp. 629-639. (In Russ.)]
4. Григорьева Д.В., Горудко И.В., Костевич В.А., Соколов А.В., Буко И.В., Васильев В.Б., Полонец-кий Л.З., Панасенко О.М., Черенкевич С.Н. Активность миелопероксидазы в плазме крови как критерий эффективности лечения пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Биомедицинская химия, 2016. Т. 62. С. 318-324. [Grigorieva D.V., Gorudko I.V., Kostevich V.A., Sokolov A.V., Buko I.V., Vasilyev V.B., Polonetsky L.Z., Panasenko O.M., Cherenkevich S.N. Myeloperoxidase activity in blood plasma as a criterion of therapy for patients with cardiovascular disease. Biomeditsinskaya khimiya = Biomedical Chemistry, 2016, Vol. 62, pp. 318-324. (In Russ.)]
5. Григорьева Д.В., Горудко И.В., Соколов А.В., Космачевская О.В., Топунов А.Ф., Буко И.В., Константинова Е.Э., Черенкевич С.Н., Панасенко О.М. Определение пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2013. Т. 155, № 9. С. 129-132. [Grigorieva D.V., Gorudko I.V., Sokolov A.V., Kosmachevskaya O.V., Topunov A.F., Buko I.V., Konstantinova E.E., Cherenkevich S.N., Panasenko O.M. Measurement of plasma hemoglobin peroxidase activity. Byulleten eksperimentalnoy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2013, Vol. 155, no. 9, pp. 129-132. (In Russ.)]
6. Михальчик Е.В., Смолина Н.В., Астамирова Т.С., Горудко И.В., Григорьева Д.В., Иванов В.А., Соколов А.В., Костевич В.А., Черенкевич С.Н., Панасенко О.М. Альбумин сыворотки крови, модифицированный в условиях окислительного/галогенирующего стресса, усиливает люминол-зависимую хемилю-минесценцию нейтрофилов человека // Биофизика, 2013. Т. 58. C. 681-689. [Mikhalchik E.V., Smolina N.V., Astamirova T.C., Gorudko I.V., Grigoryeva D.V., Ivanov V.A., Sokolov A.V., Kostevich V.A., Cherenkevich S.N., Panasenko O.M. Human serum albumin modified under oxidative/halogenative stress enhances luminol-dependent chemiluminescence of human neutrophils. Biofizika = Biophysics, 2013, Vol. 58, pp. 681-689. (In Russ.)]
7. Панасенко О.М., Горудко И.В., Соколов А.В. Хлорноватистая кислота как предшественник свободных радикалов в живых системах // Успехи биологической химии, 2013. Т. 53. С. 195-244. [Panasenko O.M., Gorudko I.V., Sokolov A.V. Hypochlorous acid as a precursor of free radicals in living systems. Uspekhi biologicheskoy khimii = Advances in Biological Chemistry, 2013, Vol. 53, pp. 195-244. (In Russ.)]
8. Панасенко О.М., Михальчик Е.В., Горудко И.В., Григорьева Д.В., Соколов А.В., Костевич В.А., Васильев В.Б., Черенкевич С.Н. Влияние антиоксидантов и скавенджеров гипогалоидных кислот на активацию нейтрофилов липопротеинами низкой плотности, модифицированными гипохлоритом // Биофизика, 2016. Т. 61. С. 500-509. [Panasenko O.M., Mikhalchik E.V., Gorudko I.V., Grigorieva D.V., Sokolov A.V., Kostevich V.A., Vasilyev V.B., Cherenkevich S.N. The effects of antioxidants and hypohalous acid scavengers on neutrophil activation by hypochlorous acid-modified low-density lipoproteins. Biofizika = Biophysics, 2016, Vol. 61, pp. 500-509. (In Russ.)]
9. Панасенко О.М., Чеканов А.В., Власова И.И., Соколов А.В., Агеева К.В., Пулина М.О., Черкали-на О.С., Васильев В.Б. Влияние церулоплазмина и лактоферрина на хлорирующую активность лейкоцитарной миелопероксидазы. Изучение методом хемилюминесценции // Биофизика, 2008. Т. 53. С. 573-581. [Panasenko O.M., Chekanov A.V., Vlasova I.I., Sokolov A.V., Ageeva K.V., Pulina M.O., Cherkalina O.S., Vasilyev V.B. A study of the effect of ceruloplasmin and lactoferrin on the chlorination activity of leukocytic myeloperoxidase using the chemiluminescence method. Biofizika = Biophysics, 2008, Vol. 53, pp. 573-581. (In Russ.)]
10. Соколов А.В., Агеева К.В., Костевич В.А., Берлов М.Н., Рунова О.Л., Захарова Е.Т., Васильев В.Б. Исследование взаимодействия церулоплазмина с серпроцидинами // Биохимия, 2010. Т. 75. С. 1544-1552. [Sokolov A.V., Ageeva K.V., Kostevich V.A., Berlov M.N., Runova O.L., Zakharova E.T., Vasilyev V.B. Study of interaction of ceruloplasmin with serprocidins. Biokhimiya = Biochemistry (Moscow), 2010, Vol. 75, pp. 1544-1552. (In Russ.)]
11. Соколов А.В., Пулина М.О., Агеева К.В., Рунова О.Л., Захарова Е.Т., Васильев В.Б. Идентификация катионных белков лейкоцитов, взаимодействующих с церулоплазмином // Биохимия, 2007. Т. 72. С. 1072-1077. [Sokolov A.V., Pulina M.O., Ageeva K.V., Runova O.L., Zakharova E.T., Vasilyev V.B. Identification of leukocyte cationic proteins that interact with ceruloplasmin. Biokhimiya = Biochemistry (Moscow), 2007, Vol. 72, pp. 1072-1077. (In Russ.)]
12. Соколов А.В., Пулина М.О., Агеева К.В., Черкалина О.С., Захарова Е.Т., Васильев В.Б. Идентификация комплексов церулоплазмина с матриксными металлопротеиназами 2 и 12 // Биохимия, 2009. Т. 74. С. 17031708. [Sokolov A.V., Pulina M.O., Ageeva K.V., Cherkalina O.S., Zakharova E.T., Vasilyev V.B. Identification of complexes formed by ceruloplasmin with matrix metalloproteinases 2 and 12. Biokhimiya = Biochemistry (Moscow), 2009, Vol. 74, pp. 1703-1708. (In Russ.)]
13. Соколов А.В., Костевич В.А., Романико Д.Н., Захарова Е.Т., Васильев В.Б. Двухстадийный метод получения церулоплазмина на основе его взаимодействия с неомицином // Биохимия, 2012. Т. 77. С. 775-784. [Sokolov A.V., Kostevich V.A., Romanico D.N., Zakharova E.T., Vasilyev V.B. Two-stage method for purification of ceruloplasmin based on its interaction with neomycin. Biokhimiya = Biochemistry (Moscow), 2012, Vol. 77, pp. 775-784. (In Russ.)]
14. Bakkenist A.R., Wever R., Vulsma T., Plat H., van Gelder B.F. Isolation procedure and some properties of myeloperoxidase from human leucocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1978, Vol. 524, pp. 45-54.
15. Baldus S., Heeschen C., Meinertz T., Zeiher A.M., Eiserich J.P., Münzel T., Simoons M.L., Hamm C.W. Myeloperoxidase serum levels predict risk in patients with acute coronary syndromes. Circulation, 2003, Vol. 108, pp. 1440-1445.
16. Beers R.F.Jr., Sizer I.W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem., 1952, Vol. 195, pp. 133-140.
17. Daugherty A., Dunn J.L., Rateri D.L., Heinecke J.W. Myeloperoxidase, a catalyst for lipoprotein oxidation, is expressed in human atherosclerotic lesions. J. Clin. Invest., 1994, Vol. 94, pp. 437-444.
18. Davis B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1964, Vol. 121, pp. 404-427.
19. Fling S.P., Gregerson D.S. Peptide and protein molecular weight determination by electrophoresis using a high-molarity tris buffer system without urea. Anal. Biochem., 1986, Vol. 155, pp. 83-88.
20. Franck T., Minguet G., Delporte C., Derochette S., Zouaoui Boudjeltia K., van Antwerpen P., Gach O., Deby-Dupont G., Mouithys-Mickalad A., Serteyn D. An immunological method to combine the measurement of active and total myeloperoxidase on the same biological fluid, and its application in finding inhibitors which interact directly with the enzyme. Free Radic. Res., 2015, Vol. 49, pp. 790-799.
21. Gorudko I.V., Grigorieva D.V., Shamova E.V., Kostevich V.A., Sokolov A.V., Mikhalchik E.V., Cherenkevich S.N., Arnhold J., Panasenko O.M. Hypohalous acid-modified human serum albumin induces neutrophil NADPH-oxidase activation, degranulation and shape change. Free Radic. Biol. Med., 2014, Vol. 68, pp. 326-334.
22. Morris J.C. The acid ionization constant of HOCl from 5° to 35°. J. Phys. Chem., 1966, Vol. 70, pp. 3798-3805.
23. Noyer M., Dwulet F.E., Hao Y.L., Putnam F.W. Purification and characterization of undegraded human ceruloplasmin. Anal. Biochem., 1980, Vol. 102, pp. 450-458.
24. Samygina V.R., Sokolov A.V., Bourenkov G., Petoukhov M.V., Pulina M.O., Zakharova E.T., Vasilyev V.B., Bartunik H., Svergun D.I. Ceruloplasmin: macromolecular assemblies with iron-containing acute phase proteins. PLoS ONE, 2013. Vol. 8, e67145. doi: 10.1371/journal.pone.0067145.
25. Schultz J., Kaminker K. Myeloperoxidase of the leukocyte of normal human blood. I. Content and localization. Arch. Biochem. Biophys., 1962, Vol. 96, pp. 465-467.
26. Sokolov A.V., Acquasaliente L., Kostevich V.A., Frasson R., Zakharova E.T., Pontarollo G., Vasilyev V.B., de Filippis V. Thrombin inhibits the anti-myeloperoxidase and ferroxidase functions of ceruloplasmin: relevance in rheumatoid arthritis. Free Radic. Biol. Med., 2015, Vol. 86, pp. 279-294.
27. Sokolov A.V., Ageeva K.V., Cherkalina O.S., Pulina M.O., Zakharova E.T., Prozorovskii V.N., Aksenov D.V., Vasilyev V.B., Panasenko O.M. Identification and properties of complexes formed by myeloperoxidase with lipoproteins and ceruloplasmin. Chem. Phys. Lipids, 2010, Vol. 163, pp. 347-355.
28. Sokolov A.V., Ageeva K.V., Pulina M.O., Cherkalina O.S., Samygina V.R., Vlasova I.I., Panasenko O.M., Zakharova E.T., Vasilyev V.B. Ceruloplasmin and myeloperoxidase in complex affect the enzymatic properties of each other. Free Radic. Res., 2008, Vol. 42, pp. 989-998.
29. Sokolov A.V., Chekanov A.V., Kostevich V.A., Aksenov D.V., Vasilyev V.B., Panasenko O.M. Revealing binding sites for myeloperoxidase on the surface of human low density lipoproteins. Chem. Phys. Lipids, 2011, Vol. 164, pp. 49-53.
30. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Kozlov S.O., Donskyi I.S., Vlasova 1.1., Rudenko A.O., Zakharova E.T., Vasilyev V.B., Panasenko O.M. Kinetic method for assaying the halogenating activity of myeloperoxidase based on reaction of celestine blue B with taurine halogenamines. Free Radic. Res., 2015, Vol. 49, pp. 777-789.
31. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Runova O.L., Gorudko I.V., Vasilyev V.B., Cherenkevich S.N., Panasenko O.M. Proatherogenic modification of LDL by surface-bound myeloperoxidase. Chem. Phys. Lipids, 2014, Vol. 180, pp. 72-80.
32. Sokolov A.V., Kostevich V.A., Zakharova E.T., Samygina V.R., Panasenko O.M., Vasilyev V.B. Interaction of ceruloplasmin with eosinophil peroxidase as compared to its interplay with myeloperoxidase: Reciprocal effect on enzymatic properties. Free Radic. Res., 2015, Vol. 49, pp. 800-811.
33. Sokolov A.V., Zakahrova E.T., Kostevich V.A., Samygina V.R., Vasilyev V.B. Lactoferrin, myeloperoxidase, and ceruloplasmin: complementary gearwheels cranking physiological and pathological processes. Biometals, 2014, Vol. 27, pp. 815-828.
34. van Dalen C.J., Whitehouse M.W., Winterbourn C.C., Kettle A.J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem. J., 1997, Vol. 327, pp. 487-492.
35. Varfolomeeva E.Y., Semenova E.V., Sokolov A.V., Aplin K.D., Timofeeva K.E., Vasilyev V.B., Filatov M.V. Ceruloplasmin decreases respiratory burst reaction during pregnancy. Free Radic. Res., 2016, Vol. 50, pp. 909-919.
36. Vlasova I.I., Sokolov A.V., Arnhold J. The free amino acid tyrosine enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. J. Inorg. Biochem., 2012, Vol. 106, pp. 76-83.
Авторы:
Соколов А.В. — д.б.н., профессор, заведующий лабораторией биохимической генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медициныi», Санкт-Петербург; отдел биофизики ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» России, Москва; кафедра фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; отдел биохимических исследований, Центр доклинических трансляционных исследований ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
Костевич В.А. — к.б.н., научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург; отдел биофизики ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» России, Москва, Россия
Authors:
Sokolov A.V., PhD, MD (Biology), Professor, Head, Laboratory of Biochemical Genetics, Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg; Department of Biophysics, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow; Department of Fundamental Problems of Medicine, St. Petersburg State University; Department of Biochemical Research, Centre of Preclinical Translational Research, V. Almazov National Medical Research Centre, St. Petersburg, Russian Federation
Kostevich V.A., PhD (Biology), Research Associate, Department of Molecular Genetics, Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg; Department of Biophysics Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, Moscow, Russian Federation
Горбунов Н.П. — аспирант, младший научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
Григорьева Д.В. — к.б.н., старший научный сотрудник кафедры биофизики, Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь
Горудко И.В. — к.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник кафедры биофизики, Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь
Васильев В.Б. — д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; кафедра фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург, Россия
Панасенко О.М. — д.б.н., профессор, заведующий отделом биофизики ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» России; отдел медицинской биофизики ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Поступила 12.10.2017 Отправлена на доработку 16.10.2017 Принята к печати 23.10.2017
Gorbunov N.P., Postgraduate Student, Junior Research Associate, Department of Molecular Genetics, Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
Grigorieva D.V., PhD (Biology), Senior Research Associate, Department of Biophysics, Belarusian State University, Minsk, Republic of Belarus
Gorudko I.V., PhD (Biology), Associate Professor, Leading Research Associate, Department of Biophysics, Belarusian State University, Minsk, Republic of Belarus
Vasilyev V.B., PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Molecular Genetics, Institute of Experimental Medicine; Department of Fundamental Problems of Medicine, St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation
Panasenko O.M., PhD, MD (Biology), Professor, Head, Department of Biophysics, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency; Department of Medical Biophysics, Russian National N. Pirogov Research Medical University, Moscow, Russian Federation
Received 12.10.2017 Revision received 16.10.2017 Accepted 23.10.2017
