Железосвязывающая способность лактоферрина при воспалении

Терехова М.С.; Горудко И.В.; Григорьева Д.В.; Семак И.В.; Соколов А.В.; Панасенко О.М.; Черенкевич С.Н.

Доклады БГУИР

Doklady BGUIR

2018, № 7(117) 2018, No. 7 (117)

УДК 577.3+538.958

ЖЕЛЕЗОСВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ЛАКТОФЕРРИНА ПРИ ВОСПАЛЕНИИ

М.С. ТЕРЕХОВА1, ИВ. ГОРУДКО1, Д.В. ГРИГОРЬЕВА1, ИВ. СЕМАК1, А.В. СОКОЛОВ2, О.М. ПАНАСЕНКО3, С.Н. ЧЕРЕНКЕВИЧ1

1 Белорусский государственный университет, Республика Беларусь

2ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Российская Федерация

3Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России,

Российская Федерация

Поступила в редакцию 12 ноября 2018

Аннотация. Лактоферрин (Лф), выполняющий ряд полезных функций в организме, может находиться в условиях, ассоциированных с накоплением активных форм галогенов (астма, инфекционные заболевания, болезни сердца и т. д.). В работе с применением спектрофотометрического и флуоресцентного методов показано, что HOCl и особенно HOBr вызывают значительные разрушения остатков Trp и нарушение железосвязывающей способности Лф.

Ключевые слова: лактоферрин, триптофан, железосвязывающая активность, HOCl, HOBr.

Abstract. Lactoferrin (Lf) is a biologically important molecule, that accomplishes a number of useful functions in an organism. Lf can be situated in conditions associated with enrichment of reactive halogen species (asthma, infectious disease, heart-disease eta). It was shown using spectrophotometry and fluorescence methods that HOCl and particularly HOBr lead to significant destruction of Trp residues and iron-binding capacity of Lf.

Keywords: lactoferrin, tryptophan, iron binding property, HOCl, HOBr.

Doklady BGUIR. 2018, Vol. 117, ]Чо. 7, pp. 80-84 Iron-binding property of lactoferrin in the case of inflammation M.S. Terekhova, I.V. Gorudko, D.V. Grigorieva, I.V. Semak, A.V. Sokolov, O.M. Panasenko, S.N. Cherenkevich

Введение

Лф представляет собой мономерный белок, в полипептидной цепи которого выделяют две гомологичные половины - глобулярные доли N и С, в каждой из которых находится по одному железосвязывающему сайту размером ~ 42 А. Молекула Лф прочно, но обратимо связывает два иона железа (Kd~ 10-20 М-1) и может существовать в насыщенной (холо-) и ненасыщенной железом (апо-) форме [1]. Атом железа скоординирован четырьмя белковыми лигандами: двумя атомами кислорода фенолят-ионов Tyr-92 и Tyr-192, карбоксильным кислородом Asp-60 и атомом азота имидазола His-253.

В организме Лф проявляет антибактериальную, противовирусную, антиоксидантную, противовоспалительную и фунгицидную активность, способен ингибировать развитие раковых заболеваний, регулирует гомеостаз ионов железа и поддерживает рост пробиотической микрофлоры кишечника. Концентрация Лф быстро возрастает и достигает 200 мкг/мл в очагах воспаления, что позволяет рассматривать данный белок в качестве маркера воспалительного процесса. Антибактериальная активность Лф представлена бактериостатическим и бактерицидным

действием. Первое заключается в связывании ионов железа. Переход Лф в холо-форму создает дефицитную по катионам металлов среду и тем самым ослабляет экспрессию фактора вирулентности и ингибирует рост и развитие бактерий [2]. Бактерицидное действие обусловлено непосредственным связыванием молекулы Лф в апо-форме с поверхностью микроорганизмов (с липополисахаридами в случае грамотрицательных и с анионными молекулами в случае грамположительных бактерий), в результате чего происходит дестабилизация их мембраны и гибель [1, 3].

В условиях воспаления основным источником Лф в крови являются нейтрофилы, активация которых сопровождается сборкой НАДФН-оксидазы и образованием супероксид анион-радикала, который может спонтанно или в присутствии катализатора дисмутировать в пероксид водорода (H2O2). В результате дегрануляции нейтрофилов наряду с Лф во внеклеточное пространство высвобождается миелопероксидаза (МПО), которая в присутствии H2O2 катализирует двухэлектронное окисление X- (галогенидов (I-, Br-, Cl) и псевдогалогенидов (SCN-)) до соответствующих гипогалоидных кислот (HOX), которые принято называть активными формами галогенов (АФГ). Вблизи активированных нейтрофилов и моноцитов главным продуктом функционирования МПО является HOCl [4]. В то же время развитие аллергических реакций и паразитарной болезни сопровождается инфильтрацией эозинофилов. Активированные эозинофилы содержат пероксидазу эозинофилов, функционирующую по тому же принципу, что МПО. Однако главным продуктом пероксидазы эозинофилов является HOBr [5]. HOCl и HOBm могут взаимодействовать с биологическими молекулами, включая аминокислоты, белки, антиоксиданты (в том числе тиолы), карбогидраты, липиды и ДНК [5, 7].Было показано, что основными мишенями для HOBr являются свободные аминогруппы, в то время как HOCl в первую очередь взаимодействует с серосодержащими аминокислотными остатками (Cys и Met) и дисульфидными связями в белках [4, 7]. Модификация белков гипогалоидными кислотами может приводить к изменению их аминокислотного состава, нарушениям третичной структуры и утрате выполняемых функций [8]. Поскольку Лф оказывается в очагах воспаления, то в случае изменения функционального состояния антиоксидантной системы и накопления АФГ он может быть подвержен воздействию HOCl и HOBr. Целью настоящей работы является выяснение характера модификации молекулы Лф (изменение аминокислотного состава и антибактериальных свойств) при действии АФГ.

Материалы и методы

В работе использованы следующие растворы: фосфатно-солевой буфер (ФСБ), содержащий 10 мМ Na2HPOyKH2P04, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl (рН 7,4); NaBr (0,1 М), NaOCl (0,97 М). Рабочие растворы NaOCl (Sigma, США) и NaOBr готовили непосредственно перед экспериментом. В работе использовали рекомбинантный Лф, полученный из молока трансгенных коз, по своим свойствам и структуре сходный с Лф человека [9].

Модификацию белка проводили при комнатной температуре (23 °С) в течение 2-3 ч при умеренном перемешивании - один раз в начале и один раз в конце модификации. Степень модификации функциональных групп белка после его обработки АФГ оценивали путем анализа изменений интенсивности собственной флуоресценции белка, обусловленной флуоресценцией остатков триптофана (Хвозб. = 285 нм, Хрегистр. = 340 нм). Флуоресцентные исследования проводили с использованием компьютеризованного спектрофлуориметра СМ2203 («СОЛАР», Минск, Беларусь) при 23 °С и постоянном перемешивании раствора.

Лф может существовать в апо- и холо-форме. Спектр поглощения обеих форм обладает максимумом около 295 нм, однако в холо-форме наблюдается дополнительный максимум между 400 и 500 нм. Учитывая данный факт, железосвязывающую способность Лф определяли спектрофотометрически по изменению поглощения раствора при длине волны X = 465 нм при последовательных добавках Fe3+ (NH4Fe(SO4^) с использованием спектрофотометра PB2201 («СОЛАР», Минск, Беларусь) при 23 °С и постоянном перемешивании раствора.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета Origin 9.1. Данные представлены как среднее плюс / минус стандартная ошибка среднего. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Изучение изменения локальной структуры и внутримолекулярной динамики белка удобно проводить путем исследования. Молекула Лф содержит 10 остатков Тгр [10]. Известно, что Тгр является одной из мишеней в белке для НОС1 (константа скорости реакции - 1,Ы04 М-1 с1 [8]) и ИОБг (константа скорости реакции - 3,740° М- с [4]), поэтому важным является исследование изменения интенсивности флуоресценции Тгр в Лф при действии на него НОС1 и ИОБг.

Установлено, что максимум спектра флуоресценции Тгр в Лф составляет лтах=328±1 нм. В результате модификации Лф при избытке как НОС1, так и ИОБг в мольном соотношении вплоть до 200:1 (ИОХ: Лф) не происходило сдвига спектра флуоресценции Тгр. Это свидетельствует в пользу того, что остатки Тгр, доступные НОС1 и ИОБг, находятся на границе раздела белок-вода [11]. На рис. 1 представлены типичные кинетики изменения интенсивности флуоресценции Тгр в Лф при действии ИОС1 и ИОБг. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в ходе модификации Лф ИОС1 и ИОБг происходит прямое разрушение ароматических колец Тгр. При молярных соотношениях ИОХ:Лф от 10:1 до 50:1 модификация под действием ИОБг больше, чем при действии ИОС1. Но при соотношении 100:1 (ИОХ:Лф) степень модификации остатков Тгр обеими гипогалоидными кислотами одинакова и составляет 94±3 %.

Лф

•е-

£ 0,4

- X = Cl ■ X = Br

^ 10:1

^ 25:1

HOX 50:1

HOX 1 100:1

0,35-1

0,300,250,200,150,100,050,00-

Нативный Лф НОС1:Лф - 100:1 HOBr^ - 100:1

Hi

{{И

т т I Т I Ш111 ЦП

-niiHiibiiiii1111

0

2 3

Время, мин

Концентрация Fe , мкМ

HOX

00

200

300

400

0

4

Рис. 1. Изменение интенсивности флуоресценции Рис. 2. Кривая доза-эффект, отражающая зависимость

Trp при последовательных добавках АФГ (HOCl оптической плотности раствора Лф от концентрации или HOBr). Показано соотношение конечных связанных ионов железа в случае нативного и концентраций HOX: Лф (моль/моль) модифицированного HOCl или HOBr белка

Модификация структуры молекулы может отражаться на ее свойствах. Одно из наиболее важных свойств Лф - железосвязывающая способность, необходимая для выполнения антибактериальной, противовоспалительной, антиоксидантной, пробиотической функций. С использованием спектрофотометрического метода исследовано изменение железосвязывающей способности Лф при его модификации HOCl и HOBr. Известно, что один моль нативного Лф связывает 2 моля ионов железа. Как видно из рис. 2, Лф после действия 100-кратного молярного избытка HOCl утрачивает железосвязывающую способность на 43±2 %: один моль Лф связывает 1,12±0,23 моля ионов железа. В случае действия 100-кратного молярного избытка HOBr железосвязывающая способность уменьшается на 74±5 %: из 10 молей Лф 5±2 свяжут один моль ионов Fe3+.

Таким образом, нарушение железосвязывающего свойства Лф более выражено при действии HOBr, чем HOCl. Данный факт, по всей видимости, обусловлен тем, что железосвязывающий Лф состоит из аминокислотных остатков His, Tyr и Asp, с которыми скорость реакции HOBr на несколько порядков выше, чем HOCl.

Заключение

Установлено, что в условиях воспаления, ассоциированного с накоплением АФГ, изменение структуры и железосвязывающей способности Лф при действии ИОБгболее значительны, чем при действии ИОС1. Нарушение железосвязывающей способности может

сказаться на основных функциях Лф: антибактериальной, противовоспалительной, антиоксидантной, пробиотической. Данная работа позволяет углубить знания о реакциях, происходящих с молекулой Лф в условиях, связанных с развитием воспалительного процесса.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 17-04-00530 и 18-515-00004) и Белорусского фонда фундаментальных исследований (грант Б18Р-058).

Список литературы

1. Lactoferrin: a modulator of immune and inflammatory responses/ D. Legrand [et al.] // Cellular and Molecular Life Sciences. 2005. Vol. 62 (22). P.2549-2559.

2. Ochoa T.J., Cleary T.G. Effect of lactoferrin on enteric pathogens // Biochemie. 2009. Vol. 91(1). P. 30-34.

3. Lactoferrin is a lipid A-binding protein/ B. J. Appelmelk [et al.] // Inf. And Immun. 1994. Vol. 62 (6). P. 2628-2632.

4. Pattison D.I., Davies M.J. Kinetic analysis of the reactions of hypobromous acid with protein components: implications for cellular damage and use of 3-bromotyrosine as a marker of oxidative stress // Biochem. 2014. Vol. 43. P. 4799-4809.

5. Eosinophils generate brominating oxidants in allergen-induced asthma / W. Wu [et al.] // The J. of Clinic. Investig. 2000. Vol. 105 (10). P. 1455-1463.

6. Panasenko O.M., Gorudko I.V., Sokolov A.V. Hypochlorous acid as a precursor of free radicals in living systems // Biochemistry (Moskow). 2013. Vol. 78 (13). P. 1466-1489.

7. Pattison D.I., Davies M.J. Absolute rate constants for the reaction of hypochlorous acid with protein side chains and peptide bonds // Chem. Res. Toxicol. 2001. Vol. 14. P.1453-1464.

8. Petronio M.S., Ximenes V.F. Effects of oxidation of lysozyme by hypohalous acids and haloamines on enzymatic activity and aggregation // Biochim. etBiophys. acta. 2012. Vol. 1824(10). P. 1090-1096.

9. Получение рекомбинантного лактоферрина человека из молока коз-продуцентов и его физиологические эффекты / В.С. Лукашевич [и др.] //Докл. Нац. акад. наук Беларуси. 2016. Т. 60, № 1. С. 72-81.

10. Baker E.N., Baker H.M. Molecular structure, binding properties and dynamics of lactoferrin // Cellular and Molecular Life Sciences. 2005. Vol. 62. P. 2531-2539.

11. Lakowicz J.R. Protein fluorescence // Principles of fluorescence spectroscopy. Ch 16. Baltimore, 2006. P. 530-578.

References