CC BY
8
Краткое сообщение (Research note)
УДК: 661.74 DOI: 10.17217/2079-0333-2021-57-96-100
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРИФТОРУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ В АЦЕТОЛИЗЕ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН ПРИ МЕЛИССОПАЛИНОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
Гончаров Б.И.1, Снегур П.П.2, 3
1 Центр гигиены и эпидемиологии в Камчатском крае, г. Петропавловск-Камчатский, ул. Ря-биковская, 22.
2 Камчатский филиал Тихоокеанского института географии ДВО РАН, г. Петропавловск-Камчатский, ул. Партизанская, 6.
3 Камчатский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, Камчатский край, Елизовский р-н, п. Сосновка, ул. Центральная, 4.
В работе показана возможность использования трифторуксусной кислоты вместо ныне запрещенного ангидрида уксусной кислоты для проведения ацетолиза пыльцевых зерен при мелиссопалинологиче-ском анализе. Кроме названного вещества, в тесты были включены ледяная уксусная кислота и этил-ацетат, которые не позволили получить необходимый эффект.
Ключевые слова: ацетолиз, интина пыльцевого зерна, мелиссопалинологический анализ, пыльцевые зерна, трифторуксусная кислота, уксусный ангидрит.
USING TRIFLOUROACETIC ACID IN ACETOLYSIS OF POLLEN GRAINS IN MELISSOPALYNOLOGICAL ANALYSIS
Goncharov B.I.1, Snegur P.P.2, 3
1 Center of Hygiene and Epidemiology on Kamchatka Territory, Petropavlovsk-Kamchatsky, Rya-bikivskaya Str. 22.
2 Kamchatka Branch of Pacific Geographical Institute FED RAS, Petropavlovsk-Kamchatsky, Par-tizanskaya Str. 6.
3 Kamchatka Research Institute of Agriculture, Sosnovka, Elizovsky District, Kamchatka Territory, Centralnaya Str. 4.
The possibility of using the triflouroacitic acid for performance of pollen grains acetolysis in melissopalino-logical analysis instead of currently prohibited acetic anhydrite was demonstrated in this investigation. Glacial acetic acid and ethyllacetate were also used in testing without required effects.
Key words: acetolysis, intine layer of pollen grain, melissopalinological analysis, pollen grains, triflouroa-cetic acid, acetic anhydrite.
В последнее время некоторые вещества, используемые в классических методиках подготовки образцов к анализу, запрещаются к свободному применению, что вызывает затруднения в исследовательской работе. В частности, ангидрид уксусной кислоты, применяемый в палинологическом анализе, включен в список запрещенных прекурсоров [Постановление..., 1998]. Поэтому для возможности использования данного метода потребовался подбор другого пригодного химического соединения.
Одной из сфер применения палинологического анализа является мелиссопали-нология - исследование пыльцевого состава меда. Поскольку специфичность меда не только как продукта питания, но и как лечебного средства предъявляет особые требования к его качеству, наряду с органо-лептическими, общими физико-химическими и биохимическими показателями необходимо иметь достоверное представление о его происхождении. Пыльцевой анализ меда позволяет определить, с каких растений пчелы приносили нектар [Bryant, Jones, 2001], а также обозначить регион, где был получен мед, т. е. указать его географическое происхождение [Maurizio, 1951]. В условиях Камчатки данная проблема встает особенно остро, т. к. фальсификация камчатского меда привозными аналогами дискредитирует его исключительное качество и препятствует дальнейшему развитию отрасли пчеловодства в регионе.
В процедуру мелиссопалинологическо-го анализа входит несколько этапов: отбор материала (мед, в котором будут исследоваться пыльцевые зерна), подготовка пробы (приготовление препарата из меда) и определение качественного и количественного состава пыльцы в препарате. К подготовке препаратов пыльцевых зерен существует два подхода: с применением ацетолиза и без него.
Оболочка пыльцевого зерна состоит из двух слоев: экзины (наружный слой) и ин-тины (внутренний слой) [Рудая, 2010; Федорова, 1959]. Главным компонентом, из которого состоит экзина, является вещество спорополленин, благодаря которому наружный слой пыльцевого зерна не растворяется в кислотах и щелочи, выдерживает нагрев до 100°С [Куприянова, Алешина, 1978]. Интина состоит в основном из пектина и целлюлозы и облегает все содержимое гаметофита. Она способна растворяться в кислотах и щелочах. Благодаря этому с помощью ацетолиза можно удалять интину из пыльцевого зерна, но экзи-ну в основном сохранять.
Метод ацетолиза, несмотря на то, что не позволяет учитывать при разрушении интины некоторые палинологические аспекты [Ramalho, Kleinert-Giovannini, 1986; Hesse, Waha, 1989], а также препятствует определению в меде грибковых элементов и водорослей (в случае работы с падевым медом), дает возможность лучшей визуализации структуры пыльцевого зерна, т. к. сохраняется только его внешняя стенка [Almeida-Muradian et al., 2020]. Кроме того, поскольку значительная часть описаний пыльцы в палинологической литературе основана на ацетолизированном материале, применение данного метода в ряде случаев может быть необходимым [Louveaux et al., 1978].
Классическим методом проведения ацетолиза является способ, разработанный Гуннаром Эрдманом [Erdtman, 1969], при котором растворение целлюлозы в интине происходит за счет действия смеси уксусного ангидрида и серной кислоты (9 : 1). Но в настоящее время представляется затруднительным использовать уксусный ангидрид в связи с тем, что это вещество было исключено из разряда соединений свободного доступа. Таким образом, возникла не-
обходимость найти другие подходящие вещества, с помощью которых возможно осуществление ацетолиза пыльцевых зерен.
Для проведения тестов пыльцевые зерна были выделены из меда согласно ГОСТ 31769-2012 «Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен». Для этого навеску меда массой 10 г заливали теплой водой в количестве 20 мл. Мед тщательно перемешивали до полного растворения осадка. В дальнейшем получившийся раствор центрифугировали в течение 10 минут на ускорении в 1000 g и воду декантировали. Процедуру проводили несколько раз. Благодаря этому из меда удаляется практически весь сахар, который сильно затрудняет ацетолиз. Затем осадок промывали ледяной уксусной кислотой, центрифугировали и декантировали лишнюю жидкость.
После того как пыльцевые зерна были получены, приступили собственно к оценке пригодности новых веществ для ацето-лиза. Вместо уксусного ангидрида были использованы следующие вещества: ледя-
ная уксусная кислота, этилацетат и трифто-руксусная кислота. В пробирки с осадком из пыльцевых зерен добавлялось 0,5 мл смеси из испытуемого вещества и серной кислоты (9 : 1). Пробирки ставили в кипящую водяную баню на 3 минуты до появления характерного темно-бурого цвета, после чего их центрифугировали. Лишнюю жидкость декантировали, осадок промывали водой для удаления смеси кислот (так же центрифугировали и декантировали). На завершающем этапе его промывали ледяной уксусной кислотой для удаления воды, центрифугировали, декантировали и вновь полученный осадок переносили на предметное стекло.
В результате исследований было выяснено (рисунок), что использование ледяной уксусной кислоты не производило нужного эффекта. Наблюдается низкая степень выхода интины из гаметофита, ап-пертуры различимы довольно слабо. В препарате, а иногда даже на поверхности пыльцевого зерна, присутствуют нераство-рившиеся механические примеси.
Пыльцевые зерна после обработки смесью с содержанием: 1 - ледяной уксусной кислоты; 2 - этилацетата; 3 -трифторуксусной кислоты
Pollen grains processed with mixture containing: 1 - glacial acetic acid; 2 - ethyllacetate; 3 - triflouroacetic acid
Обработка пыльцевых зерен этилаце-татом позволяет различать крупные аппер-туры. Но интина пыльцевых зерен с мелкими порами почти не растворяется и остается внутри. Использование этого вещества позволяет в основном освободить пробы от большинства механических примесей и удалить интину из пыльцевых зерен с крупными аппертурами.
Ацетолиз пыльцевых зерен с помощью трифторуксусной кислоты позволяет полностью растворить и вывести из них инти-ну и увидеть при микроскопии готовых препаратов все аппертуры. Механические примеси при подготовке образца растворяются и не мешают определению. Пыльцевые зерна, находящиеся в препарате, становятся пригодными для соответствующей идентификации.
По данной измененной методике была получена целая серия препаратов, которые послужили материалом для дальнейшей работы по определению качественного состава меда. Таким образом, для ацетолиза пыльцевых зерен в мелиссопалинологиче-ском анализе представляется возможным заменить классическую смесь в виде ангидрида уксусной кислоты и серной кислоты на смесь трифторуксусной кислоты и серной кислоты в той же пропорции.
ЛИТЕРАТУРА
ГОСТ 31769-2012. 2014. Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен. Москва: Стандартин-форм. 15 с.
Куприянова Л.А., Алешина Л.А. 1978. Пыльца двудольных растений флоры Европейской части СССР. Ленинград: Наука. 183 с. Постановление Правительства РФ от 30.06.1998 № 681 «Об утверждении перечня наркотических средств, пси-
хотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации» со всеми редакциями. URL: https: // minzdrav.gov.ru/documents/ 8008-postanovlenie-pravitelstva-rf-681 -ot-30-iyunya-1998-g.
Рудая H.A. 2010. Палинологический анализ. Учебно-методическое пособие. Новосибирск: Новосибирский государственный университет, Институт археологии и этнографии СО РАН. 48 с.
Федорова P.B. 1959. Некоторые особенности морфологии пыльцы культурных злаков. Труды института географии АН СССР: Материалы по геоморфологии и палеогеографии. Работы по спорово-пыльцевому анализу. Вып. 77. С.166-186.
Almeida-Muradian L.B., Barth O.M., Diete-mann V., Eyer M., Freitas A.S., Martel A.C., Rascual-Mate A., Reybroeck W., Sancho M.T., Gasparotto Sattler J.A. 2020. Standard methods for Apis mellife-ra honey research. Journal of Apicultural Research. Vol. 59. № 3. P. 1-62.
Bryant V.M., Jones G.J. 2001. The R-values of honey: Pollen coefficients. Palynology. Vol. 25. P. 11-28.
Erdtman G. 1969. Handbook of palynology. Morphology, taxonomy, ecology. An introduction to the study of pollen grains and spores. New York, Hafner. - 486 p.
Hesse M., Waha M. 1989. A new look at the acetolysis method. Plant Systematics and Evolution. Vol. 163. P. 147-152.
Louveaux J., Maurizio A., Vorwohl G. 1978. Methods of melissopalynology. Bee World. Vol. 59. № 4. P. 139-157.
Maurizio A.1951. Pollen Analysis of Honey. Bee World. Vol. 32. № 1. P. 1-5.
Ramalho M., Kleinert-Giovannini A. 1986. Some aspects of the utilization of pollen analysis in ecological research. Apidologie. Vol. 17. № 2. P. 159-174.
REFERENCES
GOST (State standard) 31769-2012. Honey. Method of pollen grains incidence detection. Moscow: Standardinform. 2014. 15 p.
Kupriyanova L.A., Aleshina L.A. 1978. Pollen of dicotyledon plants in European part of USSR. Leningrad: Nauka. 183 p.
Resolution of RF government in 30.06.1998 № 681 "About statement of list of narcotics, psychotropics and their precursors, which must be controlling" withall edits. URL: https://minzdrav.gov.ru/documents/ 8008-postanovlenie-pravitelstva-rf-681 -ot-30-iyunya- 1998-g.
Rudaya N.A. 2010. Palinological analysis. Methods handbook. Novosibirsk: Novosibirsk State University, Institute of Archaeology and EthnographySD RAS. -48 p.
Fedorova R.V. 1959. Some peculiarities of pollen morphology of cultural grass family. Trudy of Institute of Geography AS USSR: Materials of geomorphology and paleoge-ography. Issue 77. P. 166-186.
Almeida-Muradian L.B., Barth O.M., Diete-mann V., Eyer M., Freitas A.S., Martel A.C., Rascual-Maté A., Reybroeck W., Sancho M.T., Gasparotto Sattler J.A. 2020. Standard methods for Apis mellifera honey research. Journal of Api-cultural Research. Vol. 59. № 3. P. 1-62. Bryant V.M., Jones G.J. 2001. The R-values of honey: Pollen coefficients. Palynology. Vol. 25. P. 11-28. Erdtman G. 1969. Handbook of palynology. Morphology, taxonomy, ecology. An introduction to the study of pollen grains and spores. New York, Hafner. 486 p. Hesse M., Waha M. 1989. A new look at the acetolysis method. Plant Systematics and Evolution. Vol. 163. P. 147-152. Louveaux J., Maurizio A., Vorwohl G. 1978. Methods of melissopalynology. Bee World. Vol. 59. № 4. P. 139-157. Maurizio A. 1951. Pollen Analysis of Honey.
Bee World. Vol. 32. № 1. P. 1-5. Ramalho M., Kleinert-Giovannini A. 1986. Some aspects of the utilization of pollen analysis in ecological research. Apidologie. Vol. 17. № 2. P. 159-174.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Гончаров Борис Игоревич - Центр гигиены и эпидемиологии в Камчатском крае; 683004, Россия, Петропавловск-Камчатский; химик-эксперт; floop225@bk.ru. SPIN-код: 3406-8639.
Goncharov Boris Igorevich - Center of Hygiene and Epidemiology on Kamchatka Territory, 683004, Russia, Petropavlovsk-Kamchatsky; Chemist-Expert; floop225@bk.ru. SPIN-code: 3406-8639.
Снегур Павел Петрович - Камчатский филиал Тихоокеанского института географии ДВО РАН; 683000, Петропавловск-Камчатский; кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник; Камчатский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, старший научный сотрудник; snegur71 @mail.ru.SPIN-код: 2674-5580, Author ID: 439127.
Snegur Pavel Petrovich - Kamchatka Branch of Pacific Geographical Institute FED RAS; 683000, Russia, Petropavlovsk-Kamchatskiy, Candidate of Agricultural Sciences; Leading Research Worker; Kamchatka Research Institute of Agriculture; Sosnovka, Elizovsky District, Kamchatka Territory, Russia, 684033, Senior Research Worker; snegur71@mail.ru. SPIN-code: 2674-5580, Author ID: 439127.
