CC BY
282
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 573.088.1
Использование различных видов матриксов для культивации стволовых клеток крупного рогатого скота как альтернативного источника получения пищевого белка
Сидорова В. Ю.
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт механизации животноводства» г. Москва
Аннотация. Статья рассматривает вопросы применения матриксов различного типа для культивирования в искуственной среде мезенхимных стволовых клеток (МСК) крупного рогатого скота (КРС) "in vitro", как альтернативного источника пищевого белка.
Ключевые слова: матрикс, коллаген, пористость, выбор носителя, биосовместимость материалов, окисляющие агенты.
The use of different types of matrices for the cultivation of cattle stem cells as an alternative source of dietary protein
Sidorova V. Yr.
FSBSU "All-Russian Scientific Research Institute for cattle breeding mechanization" Moscow
Annotaion. The article considers the various types' matrices for mesenchymal stem cells (MSC) of cattle (BHC) culture medium "in vitro" cultivation as an alternative source of dietary protein application issues.
Keywords: matrix, collagen, porousness, media selection, material biocompatibility , oxidation agents.
Введение Методы клеточной биологии находят все большее распространение в различных областях современных фундаментальных и прикладных исследований. Одним из
наиболее используемых среди них является метод искусственного культивирования стволовых клеток (СК) сельскохозяйственных животных, в частности крупного рогатого скота.
Процесс культивирования СК в искусственной среде биореактора протекает в сложных многофазных системах: газ ^ жидкость ^ твердое тело (среда - клетки - матрикс). В виде твердой фазы (матрикса) предпочтителен нерастворимый в воде источник: эластин, углерод, желатин, коллаген, пластик, стекло, биокерамика и др. Специфика культивирования стволовых клеток КРС в биореакторах для получения пищевого белка заключается в получении продукта, используемого в пищу людьми и животными - культурального (искусственного) мяса.
Вопрос с выбором матрикса для определенного типа клеток зависит от целей их использования. Роль матриксов в культивировании СК млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных, остается до сих пор мало исследованной [12,15,20].
Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) сельскохозяйственных животных культивируют in vitro на матриксе из биосовместимого материала, относительно долговечного (до 30 дней и более), пористого и не твердого, для избежания гибели от прямого механического воздействия и кавитации.
Выбор адекватного носителя (оптимальная плотность 1,05 -1,15 г/см3, диаметр частиц от 100 до 250 мкм) для культивирования стволовых клеток является одной из сложных проблем, так как для реализации своих потенций СК должны определенное время находиться в фиксированном к носителю состоянии, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, прикрепиться к субстрату и распластаться на нем [1,7,9,10].
Клетки прикрепляются в матриксу в том числе за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность носителей для их закрепления должна быть смачиваемой и электролитической, т. е. отрицательно заряженной небольшим электролитическим зарядом в пределах 1,5-1,8 МЭКВ/г. Этого можно достичь химической обработкой носителей окисляющими агентами или физическими воздействиями - высоковольтным
разрядом, ¡ультрафиолетовым светом, лазером, бомбардировкой высокоэнергетическими электронами т.д. Иногда поверхность носителей покрывают веществом, облегчающим прикрепление клеток. Наиболее часто для этого используют полиаминокислоты.
Материал и методы исследования. В качестве матрикса-носителя при культивировании МСК КРС были исследованы фиброзные, биокерамические, стеклянные, желатиновые, коллагеновые и др материалы. Среди методов исследования -наблюдение и сбор литературных фактов, научный эксперимент и имитационное моделирование.
Результаты исследований: Матриксы выступают в качестве стимула для размножения и дифференцировки СК. При прикреплении клетки к матриксу большое значение на функциональную активность клеток оказывает поверхностная текстура пор носителей или шероховатость поверхности, которые влияют, в частности на прикрепление и пролиферацию. Требования к размерам пор (80-95 % матрикса, величина пор 20-150 мкм) специфичны в зависимости от типа культивируемых клеток. Например, при культивировании фибробластов маленькие поры носителя могут вызвать состояние гипоксии, а также остеохондрозные состояния (онемение) при клонообразовании, в то время как более крупные размеры пор обеспечивают нормальное протекание цитогенеза. От размера пор в матриксе зависят диффузионные свойства, определяющие отток продуктов обмена клеток и снабжение их питательными компонентами [2,11,16].
Носители должны иметь также выраженные гидрофильные свойства, прикрепление клеток к гидрофобным носителям затруднено.
По отношению к клетке материал матрикса должен отвечать следующим основным требованиям: не быть цитотоксичным, канцерогенным, аллергенным, не вызывать воспаления, не травмировать живую ткань, не вызывать антигенного действия, не вызывать деструкции и разложения белков и ферментов, не нарушать электролитный баланс, не вызывать отклонений в системах метаболизма.
Под воздействием среды материал не должен: поддаваться механическому разрушению и истиранию, менять структуру и конфигурацию поверхности, химически трансформироваться и разлагаться, адсорбироваться и седиментироваться (осаждаться, оседать), экстрагироваться (распадаться при массо-обменных процессах) [3,4].
Основными физическими характеристиками матриксов должны быть: поддержание адгезии, фиксации, пролиферации и дифференцировки, помещенных на их поверхность клеток, достаточная механическая прочность.
Носители клеточных структур для получения пищевого белка, обладающие перечисленными свойствами, не могут быть построены из синтетических материалов (полимеров на основе органических кислот, сплавов, полиэфирных смол, силиконов, минеральных матриксов и др), а только из природных, так как в перспективе будут использоваться в пищу человека и животных.
Среди природных матриксов в качестве объемных носителей можно назвать биотехнологические материалы, подходящие с точки зрения биосовместимости: белковые: фибрин, коллаген, эластин; полисахариды: хитозан, альгинаты, целлюлоза, крахмал, агар и некоторые другие, а также белково-полисахаридные комплексы.
Определенный интерес для биотехнологии матриксов представляют сывороточные белки крови группы фибрина. Фибрин - это белок, образующийся из фибриногена под действием фермента тромбина, конечный продукт свертывания крови. Фибрин может быть использован в виде фибрин-полимерного сгустка, фибриновой пены или пленки в тканевых технологиях для получения субстрата для культивирования. В литературе встречаются описания результатов поисковых исследований, направленных на разработку матриксов, пригодных для культивирования in vitro клеток фибробласти-ческого ряда для формирования тканей, в том числе и мышечных структур [5,8,13].
Носители из фибрина удовлетворяют всем факторам биосовместимости. Кроме того, они формируют волокна,
скрепляющиеся друг с другом поперечными связями, а присутствие фибринстабилизирующего фактора крови среди плазменных глобулинов значительно укрепляет сеть субстрата.
Все природные матриксы разделяются на органические и неорганические. Принципиальная пригодность неорганических носителей для культивирования животных клеток с целью получения пищевого белка экономически менее эффективна, так как их необходимо освобождать от урожая, тогда как некоторые органические носители можно употреблять в пищу.
Значимость органических носителей была показана еще в конце 80-х - начале 90-х гг. XX в. В настоящее время эти полимеры активно используют для конструирования биоинженерных матриксов различных типов - кожа, хрящи, сухожилия, мышцы. К недостаткам при их эксплуатации следует отнести спонтанную бионесовместимость при изменении условий среды (например, pH), инкапсулирование, недостаточную остеокондуктивность (электропроводность), резорбируемость, недостаточную механическую прочность и т.д [18, 21].
Наиболее оптимальны матриксы в виде двух, трех или многомерных структур. Относительной простой тип субстратов для культивирования клеточных культур in vitro (2D) представлен в форме пленок, сеток, мембран, гелей, плотных и пористых конструкций. Объемные матриксы (3D) представляют собой более сложные системы в виде скафолдов (матриц), шариков, бусин, губок, волокон, трубок, или других объемных конструкций, например, гидрогелей - нерастворимых разбухающих в воде сетчатых структур. При их эксплуатации можно контролировать параметры процесса культивирования для обеспечения необходимой биосовместимости, адгезионных и диффузных характеристик.
Общей особенностью таких матриксов является способность к желатинизации, которая поддерживает процесс диффузии веществ и клеток, электролитические свойства или другие взаимодействия между цепями полимера и диффундирующими молекулами. Диффузия крупных молекул, например, белков, может происходить так же свободно в гелях,
как диффузия более мелких молекул, например, полисахаридов или кислорода, что способствует клеточному прикреплению и делению клеток.
Без матрикса-носителя, почти все клетки гибнут из-за отсутствия условий для их созревания и размножения. По этой причине создание матриксов-носителей является одной из ключевых проблем в реализации технологий клеточной трансплантации. Пористые матриксы используются в качестве матриксов для культивирования клеток in vitro, таких как хондроциты, гепатоциты, остеобласты, фибробласты, мышечные клетки, эпителиальные клетки, стволовые клетки. Применение многокомпонентных составов позволит получать гамму пористых одноименных носителей с пористостью до 90 % при размере пор от 50 до 350 нм.
Культивирование стволовых клеток производится методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков (бусин, губок, трубок, др.) - частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в культуральной жидкости с помощью перемешивающего устройства. Также для культвирования МСК на микроносителях используется метод микрокапсулирования [6,14,17].
Для повышения адгезионных свойств поверхности и проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток обычно применяют обработку химическими реагентами. Химическая модификация включает изменение функциональных групп на поверхности полимерного материала, что повышает гидрофильность, обеспечивает лучшую прикрепляемость и лучший рост клеток. Известны положительные примеры иммобилизации на матриксах из коллагена, хитозана, полисахаридов, обработанных липазами.
Альгинат - это природный линейный полисахарид, получаемый из морских водорослей или биотехнологической ферментацией, одобрен Департаментом по контролю качества продуктов и лекарств США (United States Food and Drug Administration - F.D.A. Хорошим эффектом обладают вспененные композиции на основе желатина. Недостатки -
изменение pH при расщеплении, недостаточная механическая прочность. Довольно широкое применение нашли комплексы хитозана и альгината, а также в сочетании с другими природными материалами, в частности, желатином.
Эластин - фибриллярный белок, синтезируется клетками фибробластов, основной компонент эластичных волокон, соединительной ткани, придающий ей упругость. Встречается вместе с коллагеном, с которым его объединяют ряд общих свойств. Нерастворим в воде, нормализованных растворах солей, щелочей и кислот, и даже при нагревании. Не продуцируется растительными клетками, а только животными.
Желатин - денатурированная форма белка коллагена, часто представлен в виде клея, в настоящее время находит применение в качестве матриксов для выращивания клеток in vitro применительно к задачам клеточной и тканевой инженерии. Матриксы из желатина пригодны для успешного выращивания клеток разного происхождения. По пищевым признакам схож с пектином и агаром. Разбухает при температуре 36-370С, растворяется при температуре 450С, через 40 минут.
Коллаген является наилучшим распространенным природным белковым полимерным материалом. Этот фибриллярный белок представляет из себя один из основных компонентов соединительной, костной и хрящевой тканей, а также соединительной ткани, входящей в состав сухожилий. Молекула коллагена имеет стержневидную форму и состоит из трех так называемых а -цепей, формирующих право-закрученную тройную спираль. Около 30 % аминокислотных звеньев коллагена приходится на глицин.
Недостатком коллагена является нерегулируемое время биодеградации и ограниченный срок функционирования (не более месяца) в условиях среды. В настоящее время разработаны методы получения больших количеств коллагена. Среди областей применения коллагена особенно широкое распространение получили композиты коллагена. Если учитывать, что основной состав современных колбас - эти коллаген, то коллагеновый носитель хорошо зарекомендовал
себя в качестве носителя для культивации стволовых клеток крупного рогатого скота, как источника пищевого белка. Немаловажное значение имеют такие свойства носителя, которые позволяют использовать их многократно [19].
Выводы Наилучшим носителем для культивации стволовых клеток, как источника пищевого белка является коллаген, и его композитные комплексы (4:1 по массе), которые имеет преимущество перед чисто коллагеновым в длительности эксплуатации. Несмотря на то, что коллаген плохо растворяется в воде, через сутки при 37°С коллагеновая матрица теряет форму, через неделю происходит частичное растворение 21-27 % исходной массы. Матрица из композита коллаген/ПЛА (молочная кислота), сохраняет форму и массу изделия до 14 и более суток, обнаруживает высокие адгезионные свойства и способность поддержания пролиферации клеток и тканей животных длительное время. На одной частице МН диаметром 16,0—23,0 мм помещается 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном объеме среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их достигает до 50 см2/мл и более.
Библиографический указатель:
1. Рубан, Е.А. Биотехнология производства препаратов для защиты животных //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, №1, 1999 -с.67-70.
2. Самуйленко, А. Я. Перспективы научно-технического развития производства биологических препаратов. //Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». М., 1991. - с. 6-7.
3. Соловьев, Б.В., Хорьков И.А., Писеева Г.П., Карпук В.А., Батуханов А.Б., Рубан Е.А., Абрамов А.Б., Назаркина Н.И. Культивирование клеток линии ПТ-80 в ферментере с автоматизированной системой управления технологическим процессом. //Тезисы докладов. Ш Всесоюзной конференции
«Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». М., 1987. - с. 1213.
4. Тарасов, B.B. Управляемое культивирование и непрерывное культивирование вирусов и клеток позвоночных. //Итоги науки и техники. ВИНИТИ, сер. «Микробиология», 4, 1975, с. 152-207.
5. Al-Rubeai, М., Emery A.N., Mechanisms and kinetics of monoclonal antibody and secretion in synchronous and asynchronous hybridoma cell culture. // J. Biotech-nol. 1990,16-p. 67-86.
6. Bach, B.R Method and apparatus for growth cell in vitro. Endotronics. Ins. Пат. США, № 737515Б 1987.
7. Bell, S.L., Bebbington C., Scott F., Wardell J.N., Spier R.E., Bushell M.E., Sanders P.G. Genetic engineering of hybridoms glutamine metabolism // Enzyme. Microbiolm. Technol, 1996, 17-p. 98-106.
8. Bibila, T.A., Flickinger M.C. A model of intraorganelle monoclonal antibody transport and secretion in mouse hibridoma cells.// Biotechnoll. Bioeng, 1991, p. 767-780.
9. Bartal , A.H. Apparatus for enhancing cell growth, preservation and transport. Пат.США, № 4734313,1988.
10. Blenca Н/ BTF Biotech-Forum, 5, № 1,1988, p. 6-10.
11. Butter ML, Jenkins H J. //of Biotechnology, 12, 1989. pp. 97-110.
12. Chang H.N., Kyung Y.S. //Biotechnol. And Bioeng., 29, № 5, 1987.552-557
13. Cotter T.G., Al-Rubeai M, Cell death (apoptosis) in cell culture system //Tib.Tech., 13-1995-p. 150-155.
14. Frame K.K., Hu W.S. Cell volume maasurment as an estimation of mammalian cell biomas.// Biotechn. Bioeng. 1990,36 p. 191-197.
15. Henzler HL X, Kouling D. J. Oxygenation of cell cultures. // Bioproc, Eng., 1993,9-61-75
16. Lu GJLy Thompson B.C., Gray M R. Physical modeling of animal cell in suspension culture.//Biotechn. Bioeng., 1996,40, 1277-1281
17. Paul J. Cell and tissue culture. // Ed. Pollak R„ N.Y. 1995, p. 301-305.
18. Pollack R.EE., Hough P.V.C. The cell surfase and malignant transformation Aun. Rev. Ved.s 25,1974. -pp.431-446
19. Rebsamen E., Coldinger W. Scheiter W. Et.al. //Develop .Biol. Standard .,66, 1987. -pp.273-377
20. Wberts В., Bray D., Lewis J., Raff М., Roberts К., Watson J.D. Molecular Biology of the Cell. Garlang Publishing, New York, 1983 p. 120/
21. Ross R. The platelet-derived factor, // In: Tissue growth factors Ed. R. Baserga. Berlin etc.,1981. pp. 133-160.
Об авторе:
Сидорова Виктория Юрьевна. - в. н. с. д-р. с.-х. наук., ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт механизации животноводства» г. Москва, [email protected].
About the author:
Sidorova Victoriya Yuryevna. - c. n. p. Dr. of agricultural sciences., FSBSU "All-Russian Scientific Research Institute for cattle breeding mechanization" Moscow, [email protected].
