CC BY
82
УДК 619:616.982.21:636 НЛ. Першикова, Н.А. Донченко
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
В статье выявлено, что полимеразную цепную реакцию целесообразно применять для лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и как дополнительный экспресс-метод для изучения патолологического материала от животных, убитых с диагностической целью.
Туберкулез - инфекционное заболевание многих видов животных, птиц и человека, характеризующееся поражением различных органов (легкие, печень, почки, селезенка и др.) с образованием в них специфических бугорков-туберкулов, подвергающихся казеозному некрозу. Болезнь протекает в хронической форме.
Возбудитель туберкулеза - микроорганизмы рода Mycobacterium (mycos - гриб, bacterium - палочка), который включает в себя более 38 самостоятельных видов. Болезнь у животных вызывают микобактерии туберкулеза бычьего (M.bovis), человеческого (M.tuberculosis) и птичьего (M.avium) видов [2].
В настоящее время основным способом диагностики туберкулеза остается внутрикожная туберкулиновая проба, а также бактериологическое исследование с постановкой биопробы на лабораторных животных [4, 5]. Однако данные методы диагностики туберкулеза занимают много времени, достаточно трудоемки и не всегда дают положительный результат. В последние годы для выявления возбудителей инфекционных болезней наиболее чувствительными и специфичными предлагаются методы, основанные на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Освоение методов молекулярного анализа радикально расширило возможности изучения патогенеза инфекционных болезней и принципиально усовершенствовало диагностику [1, 3].
Наиболее перспективна ПЦР в определении некультивируемых и персистирующих форм возбудителей, патогенов, вызывающих хронические инфекции, и с выраженной антигенной изменчивостью внутриклеточных паразитов [2].
Целью наших исследований явилось использование полимеразной цепной реакции для обнаружения ДНК микобактерий в биоматериале животных.
Материалы и методы исследования. С использованием базы данных Medline и PubMed провели поиск литературы по изучению генетической структуры микобактерий, характеристике наиболее употребляемых молекулярно-генетических методов индивидуальной идентификации штаммов и культур микобактерий.
Хромосомную ДНК выделяли несколькими способами. Процедура подготовки пробы включала лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. Выбор метода диктовался природой исследуемого образца, необходимостью предотвращать влияние ингибиторов ПЦР, сконцентрировать нуклеиновую кислоту в объеме, соответствующем формату ПЦР, и предотвратить действие ДНКаз и РНКаз.
Гуанидин-феноловый метод:
1. К пробам добавляли по 500 мкл гуанидин-феноловой смеси, перемешивали. Экспозиция при комнатной температуре 10-15 мин.
2. Добавляли в пробы и в чистые пробирки по 100 мкл хлороформа, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10-15 мин.
3. Центрифугировали 15 мин на максимальных оборотах и отбирали верхнюю фазу в пробирки, содержащие 100 мкл хлороформа. Перемешивали и 10-15 мин держали при комнатной температуре.
4. Центрифугировали 15 мин при максимальных оборотах, отбирали верхнюю фазу в пробирки, содержащие 4 мкл декстрана. Добавляли по 500 мкл изопропилового спирта и оставляли при +4оС на 40-60 мин.
Центрифугировали 15 мин при максимальных оборотах. Супернатант отбрасывали и промывали 2 раза 70%-м этанолом. Оставшийся осадок содержал выделенную ДНК, пригодную для дальнейших манипуляций.
Также была использована модификация данной методики, заключающаяся в том, что вместо экстракции фенолом и хлороформом применяли сорбцию ДНК на стекле согласно наставлению к набору для выделения ДНК, предлагаемому ООО «Лаборатория Медиген». Перед выделением ДНК из микобактерий таким способом материал предварительно обрабатывали лизирующим буфером для лучшего высвобождения ДНК из клеток.
Выделение микобактериальной ДНК из биоматериала проводили, основываясь на принципе седиментации дисперсных систем под действием силы тяжести с отделением дисперсной фазы в виде осадка, необходимого для обогащения жидкодисперсной части гомогенизата микобактериями туберкулеза, высвобожденных из тканей органов. Для этого ткани органов разрезали ножницами на кусочки и заливали 6%-м раствором щавелевой кислоты в соотношении 1:6, прикрывали фильтровальной бумагой и выдерживали 20-30 мин. После этого кислоту сливали, а биоматериал трижды промывали стерильной дистиллированной водой, растирали пестиком, добавляя стерильный песок до гомогенной массы. Гомогенизат разбавляли физиологическим раствором 1:5, взбалтывали и проводили седиментацию в течение 5 мин.
Чтобы освободиться от большого количества примесей проводили вторичную седиментацию. Для этого жидкодисперсную часть взвеси, полученную после седиментации в ступке, переносили в бактериологические пробирки, где и проводили вторичную седиментацию в течение 3 мин. Жидкодисперсную часть, полученную в пробирках, центрифугировали при 3500 оборотах в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок использовали для выделения микобактериальной ДНК.
Подбор праймеров. Для работы праймеров были подобраны такие фрагменты молекулы ДНК, которые отличались генетической консервативностью и присутствовали только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене. Анализ последовательностей белков и генов, депонированных к настоящему времени штаммов микобактерий, проводили с использованием международных баз данных при помощи компьютерных программ PC-gene, Aligment-serves, CLUSTAL.
Компоненты полимеразной цепной реакции (ПЦР). Реакционная смесь для проведения ПЦР содержала в 25 мкл: 10*буфер рН 8,8, 2,5 мкл смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 5 мкл смеси праймеров, 0,5 мкл Тад-полимеразы, объем пробы доводили деионизованной (или поставляемой в наборе) водой. Исследуемую ДНК вносили в количестве 2,5 мкл. На поверхность наслаивали 1 каплю (20-25 мкл) минерального масла для ПЦР.
Второй вариант соотношения компонентов реакции соответствовал Протоколу проведения ПЦР для набора реагентов GenePak PCR Core.
Полимеразную цепную реакцию для выявления Mycobacterium tuberculosis - специфической ДНК, проводили с использованием пар праймеров 5'-CGCCTAGGCTCAAACTGCTG-3' и 5'-CAATACCCGGCGGATCTACC-3'. Параметры ПЦР (Терцик, ДНК-Технология, Москва): 95°С х 5 мин (1 цикл), 95°С х 30 с, 50°С х 30 с, 72°С х 1 мин (40 циклов), 72°С х 5 мин. При использовании такого режима амплификации получали искомый фрагмент в 80 п.н.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для выявления M.avium complex - специфической ДНК, проводили с использованием пар праймеров, синтезированных на район гена IS 1245: 5'-
CCCGTTCAACGTCAACTTCC-3' и 5'-GGGCTCGCCGGTCATCAGGT -3'. Параметры ПЦР (Терцик, ДНК-Технология, Москва): 95°С х 5 мин (1 цикл), 95°С х 30 с, 68°С х 2 мин, 72°С х 5 мин (30 циклов), 72°С х 4 мин. При использовании такого режима амплификации получается искомый фрагмент в 373 п.н.
Полимеразную цепную реакцию для выявления некоторых клинически значимых атипичных видов микобактерий - специфической ДНК, проводили с использованием пар праймеров, кодирующих повторяющиеся последовательности гена hsp 65: 5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT -3' и 5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT -3'. Параметры ПЦР (Терцик, ДНК-Технология, Москва): 94°С х 5 мин (1 цикл), 94°С х 1 мин, 60°С х 1 мин, 72°С х 1 мин (25 циклов), 72°С х 10 мин. При использовании такого режима амплификации получали искомый фрагмент в 440 п.н.
Определение размера продуктов ПЦР. 10 мкл раствора продукта полимеразной цепной реакции смешивали с 2 мкл буфера для нанесения проб на гель и вносили в «карман» 2% агарозного геля. Маркеры молекулярной массы состояли из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC19 рестрикционной эндонуклеазой Kzo9 I и плазмиды pBlueScript рестрикционной эндонуклеазой Msp I. Анализ считали положительным, если для каждой пары праймеров был получен продукт ПЦР, соответствующий ожидаемому размеру. Изображение геля фотодокументировали с помощью видеосистемы.
Результаты исследований. В опыте по выделению ДНК микобактерий были использованы пробы биоматериала (лимфатические узлы, печень, селезенка) от коров неблагополучного хозяйства Новосибирской области, органы от птиц и полевые культуры микобактерий, выделенные в различное время от коров из хозяйств Новосибирской области. В качестве положительного контроля использовали ДНК M.bovis, M. tuberculosis, M.avium и M. smegmatis, в качестве отрицательного контроля - органы от здоровых животных или
ДНК атипичных микобактерий. Для наработки инфицированного микобактериями биоматериала заражали морских свинок.
После убоя фиксировали видимые изменения внутренних органов и проводили бактериологическое исследование биоматериала.
Из результатов бактериологических исследований следует, что из 11 биологических образцов было выделено на питательных средах 8 изолятов микобактерий. Положительный или отрицательный сигнал при бактериологическом исследовании на наличие или отсутствие микобактерий совпал с результатами ПЦР в девяти и не совпал в двух случаях из одиннадцати исследованных образцов (табл.).
Результаты исследования биоматериала
№ опыта Бактериологическое исследование ПЦР Вид микобактерий
1 + + M. tuberculosis
2 - + M. avium
3 - - -
4 + + M. avium
5 + + M. avium
6 + + M. avium
7 + + Атипичные микобактерии
8 + + M. avium
9 + + M. avium
10 + + M. avium
11 - + Атипичные микобактерии
Несовпадение результатов бактериологического анализа и метода ПЦР можно объяснить незначительным количеством микобактерий, обсеменивших биоматериал, или слабой жизнеспособностью микобактерий, а также возможным обсеменением биоматериала культурами сапрофитной микрофлоры.
Исследования показали эффективность ПЦР-анализа при обнаружении ДНК микобактерий туберкулеза и указывают на целесообразность более широкого применения этого метода в лабораторной диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных.
Применение комбинированных методов исследования позволяет получить более полную максимально достоверную характеристику изолятов.
Литература
1. Молекулярная характеристика полирезистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis из России I Э.В. ГeHepo3oe [и др.] II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2000. - №1. -C. 11-16.
2. Дончєнко, А.С. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота I А.С. Дончєнко, Н.П. OedueHKO, Н.А. Дончєнко. - Новосибирск, 2004. - C. 3.
3. Макаров. В.В. ПЦР в диагностике лейкоза крупного рогатого скота I В.В. Макаров, Д.П. Гринишин II Ветеринария. - 2005. - №4. - С. 9-10.
4. Наставление по диагностике туберкулеза животных: утв. Департаментом ветеринарии Министерства с.х. РФ 18.11.2002 г.
5. Эффективность методов прижизненной диагностики туберкулеза I А.Н. Шаров [и др.] II Ветеринария. -2000. - № 2. - С. 16-18.
