CC BY
18
УДК 619:616.98:579.873.21 Т-07
Ключевые слова: изоляты, Mycobacterium avium, свойства, VNTR-типирование, филогенетический анализ, полимеразная цепная реакция
Key words: isolate, Mycobacterium avium, properties, VNTR-typing, phylogenetic analysis, polymerase chain reaction Ионина С. В., Дымова М. А., Филипенко М. Л., Донченко Н. А.
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM AVIUM, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
GENETIC DIVERSITY OF ISOIATES OF MYCOBACTERIUM AVIUM CIRCUIATING ON THE TERRITORY OF WESTERN SIBERIA
'ФГБНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» (ФГБНУ ИЭВС и ДВ) Адрес: 630501, Россия, НСО, р. п. Краснообск, а/я 8. Тел. +7 (383) 348-04-95 1Institute of Experimental veterinary Siberia and the Far East, Federal State Scientific Institution Address: 630501, Russia, NSO, Krasnoobsk, P. O. box 8. Tel. +7 (383) 348-04-95 2ФГБУН «Институт Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН» (ИХБФМ СО РАН), Адрес: 630090, Россия, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8. Тел. +7 (383) 363-51-71 2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the Siberian office of the Russian Academy of Sciences, Science Federal State Budgetary Institution Address: 630090, Novosibirsk, Pr. Ak. Lavrentieva, 8. Tel. +7 (383) 363-51-71
Ионина Светлана Владимировна, к. б. н., ст. научн. сотрудник1
lonina Svetlana V., Ph.D. in Biology Science, Senior Scientific Employee1 Дымова Майя Александровна, к. б. н., мл. научн. сотрудник2 Dymova Maya A., Ph.D. in Biology Science, Junior Researcher2 Филипенко Максим Леонидович, к. б. н, зав. лабораторией фармакогеномики2 Filipenko Maxim L., Ph.D. in Biology Science, Head of the Laboratory of Pharmacogenomics2 Донченко Николай Александрович, д. в. н., директор1 Donchenko Nikolay A., Doctor of Veterinary Sciences, Director1
Аннотация. Идентифицировано до вида Mycobacterium avium 22 изолята микобактерий, выделенных из биоматериала сельскохозяйственных животных на территории различных природно-географических зон Западной Сибири и Республики Алтай на основании культуральных, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования. Метод VNTR-типирования можно использовать для быстрой идентификации, генотипирования, выяснения филогенетических связей при проведении эпидемиологических исследований различных патогенов, в том числе изолятов M. avium.
Summary. 22 mycobacterium isolates obtained from biomaterial of live-stock animals in different natural and geographical zones of Western Siberia and the Republic of Altai were identified to the Mycobacterium avium species by applying cultural, biochemical and molecular-genetic research methods. VNTR-typing can be used for rapid identification, genotyping, determining ofphylogenetic connections in epidemiological studies of various pathogens including M. avium isolates.
Введение
В настоящее время возрастает число неблагоприятных экологических факторов, способствующих активности патогенных, а также потенциально патогенных микроорганизмов, в частности Mycobacterium avium complex (MAC) [4]. Члены группы MAC принадлежат к атипичным микобак-териям, которые могут быть найдены в водоемах, пищевых продуктах, окружающей среде и могут являться патогенными для различного вида животных. В частности, M. avium subsp. hominissuis часто является причиной патологии у свиней, которая
приводит к значительному экономическому ущербу в свиноводстве, в то же время он имеет крайне низкую морбидность для других животных. Два других члена MAC группы, M. avium subsp. avium и M. avium subsp. paratuberculosis, являются возбудителями двух важных, часто летальных, заболеваний: туберкулеза птиц и паратубер-кулеза жвачных животных (болезни Джонса), соответственно. Кроме того, как и другие возбудители, M. avium subsp. avium и M. avium subsp. hominissuis способны инфицировать крупный рогатый скот, оленей, кабанов, коз и лошадей.
В литературе приведен ряд случаев, когда Mycobacterium avium subsp. avium и M. avium subsp. hominissuis вызывали развитие туберкулезной инфекции у людей [6]. Считается, что до 3 % заболеваний туберкулезом у человека вызваны этими видами микобактерий. Особую опасность они представляют для больных с иммунодефицитами (особенно со СПИДом), вызывая генерализованные поражения (у 40-50 % пациентов). За последние 10 лет повсеместно отмечается рост числа заболеваний, вызываемых MAC, в США, Японии, России и ряде стран Европы. Лечение поражений, вызванных Mycobacterium avium complex, представляет серьезную проблему из-за устойчивости к химиотерапии ввиду естественной резистентности большинства культур MAC к антибактериальным и, часто, к противотуберкулезным препаратам.
Микробиологические методы идентификации атипичных микобактерий основаны на определении скорости роста, формы, пигментообразования на свету и в темноте, цвета колоний на плотных питательных средах, а также биохимических свойств микроорганизмов. Так, для выделения микобакте-рий часто используется метод седиментации, который основан на расслоении дисперсных систем под действием силы тяжести с отделением дисперсной фазы в виде осадка и жидкодисперсной, в которой накапливаются высвобожденные микобактерии [1]. В качестве генетических маркеров используются 16S - 23S rDNA район, число и позиции ин-серционных элементов IS900, IS901, IS1245, IS1311, варьирующие по числу тандемные повторы (VNTR) и короткие повторенные тандемные последовательности (SSR) [5]. Также были найдены инсерционные элементы, характерные именно для MAC -IS MAP02 и IS MAP04 [8].
Сравнительный анализ методов типиро-вания показал, что наиболее дискриминирующими методами являются SSR-анализ и VNTR-типирование (variable number tandem repeats - варьирующее число тандемных повторов). Например, в работе [7] индекс дискриминации Симпсона для SSR-типирования составил 0,967 (для всех 11 локусов SSR) и 0,885 (для всех 8 локусов MIRU). И хотя
дискриминирующая способность SSR метода намного выше VNTR-типирования, более жесткие требования к разрешающей способности электрофоретического анализа продуктов амплификации ограничивают широкое использование данного метода на практике. Поэтому простым методом определения и типирования M. avium complex является MIRU-VNTR-типирование с использованием описанных ранее четырех полиморфных локусов: VNTR 292, X3, 47, 7. Это простой, быстрый, недорогой в исполнении метод, результаты которого могут быть переведены в числовой формат и, таким образом, облегчат сравнение таковых с уже имеющимися, депонированными в базах данных.
Целью данного исследования являлось изучение разнообразия изолятов M. avium, циркулирующих на территории Западной Сибири и Республики Алтай, полученных из биологического материала (лимфатические узлы и паренхиматозные органы инфицированных животных) с использованием микробиологических, культуральных методов и метода VNTR-типирования по описанным ранее четырем полиморфным локусам (VNTR 292, X3, 47, 7).
Материалы и методы исследования
Изоляты M. avium. Для проведения данных исследований были отобраны 22 изоля-та, выделенных из лимфатических узлов и паренхиматозных органов инфицированных животных (крупный рогатый скот, свиньи, марал и голубь) и принадлежащих к атипичным видам микобактерий туберкулеза, которые были изолированы в период с 2001 по 2010 гг. в различных природно-географи-ческих зонах Западной Сибири и Республики Алтай. Вышеуказанные культуры были посеяны на глицериновый картофель Павловского, затем пересеяны на яичную среду Финн-2. Трехнедельные культуры использовали в дальнейшей работе.
Выделение изолятов из биологического материала. Для выделения микобактерий из биологического материала использовали метод седиментации, из внешней среды - метод А. П. Аликаевой. Органы разрезали на кусочки, помещали в ступку и заливали 6%-й
соляной кислотой в соотношении 1 : 6, выдерживали 20-30 минут. После этого кислоту сливали, а материал трижды промывали стерильной дистиллированной водой и растирали с добавлением стерильного песка до гомогенной массы. Гомогенизат разбавляли физиологическим раствором в соотношении 1 : 15, взбалтывали и проводили первичную седиментацию в течение 5 минут. С целью освобождения от большого количества примесей, оставшихся в жидкодисперсной части, проводили вторичную седиментацию, состоящую в том, что жидкодисперсную часть взвеси, полученную после седиментации в ступке, переносили в бактериологические пробирки и выдерживали в течение 3 минут. Жидкодисперсную часть, полученную в пробирках, центрифугировали при 3 500 оборотах в течение 20 минут. Надо-садочную жидкость сливали, а из осадка проводили посев на 4-5 пробирок с плотными питательными средами. Через 30 суток учитывали количество пробирок, в которых отмечен рост микобактерий туберкулеза, и число загрязненных проб. Чистоту посевов контролировали микроскопией мазков, окрашенных по Цилю - Нильсену. Для проведения исследований в лаборатории туберкулеза сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВС и ДВ Россельхозакадемии в последнее время активно используется данный метод обработки биоматериала вследствие его диагностической эффективности и 100%-й чистоты посевов. Метод А. П. Али-каевой для обработки проб внешней среды состоял в следующем: почву предварительно измельчали и помещали в ступку, заливали 4%-м раствором едкого натрия (№ОН)
в соотношении 1 : 2, растирали пестиком 1520 минут, фильтровали через двойной слой марли в стерильные пенициллиновые флаконы и ставили на 20 минут в термостат при 37 °С, затем центрифугировали 15 минут при 3 000 об./мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 10%-й раствор серной кислоты, встряхивали 10 минут и центрифугировали 20 минут при 5 000 об./мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадка делали посевы и мазки.
Для исследования проб воды брали 200 мл жидкости, центрифугировали при 3 000 об./ мин. в течение 15 минут. Осадок растворяли в 5 мл физиологического раствора, доливали 10 мл 12%-й серной кислоты, и через 5 минут центрифугировали в вышеуказанном режиме. Надосадочную жидкость сливали, из осадка делали посевы и готовили мазки.
Биохимические тесты. Биохимические методы исследования микобактерий включали в себя следующие тесты: наличие пигмента при росте микобактерий на свету и в темноте; рост при 22 °С и 45 °С; рост на среде с 5 % №С1; гидролиз твин-80; редукция нитратов с диметиламинобензальдегидом и определение амидазной активности с мочевиной [2].
Олигонуклеотидные праймеры. Дезокси-рибонуклеотидные праймеры синтезированы в Институте химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ СО РАН). Нуклеотидная последовательность использованных праймеров приведена в таблице 2.
VNTR-типирование. VNTR-типирование проводили согласно ранее описанной методике [9]. Для VNTR-типирования локусов (VNTR 292, Х3, 47, 7) проводили ПЦР в ко-
Таблица 1.
Структура праймеров
Название праймера/зонда Нуклеотидная структура
Av-47u Av-47R 5'-CGTTGCGATTTCTGCGTAGC-3' 5'-GGTGATGGTCGTGGTCATCC-3'
Av-7u Av-7r 5'^АСААШАААССТАССТШТС-3' 5'-GTGAGCTGGCGGCCTAAC-3'
АУ-Х3и AV-X3R 5'-AACGAGAGGAAGAACTAAGCCG-3' 5'-TTACGGAGCAGGAAGGCCAG-3'
АУ- 292и АУ 292R 5'-CTTGAGCAGCTCGTAAAGCGT-3' 5'-CTGTATGAGGAAGTCTATTCATGG-3'
нечном объеме 20 мкл, содержащем 65 мМ трис-HCl (рН 8,9); 16 мМ (NH4)2SO4; 1,8 мМ MgCl2; 0,05 % Твин 20; 0,2 мМ дНТФ; 1 мкМ соответствующие олигонуклеотидные праймеры, 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, 1-10 нг геномной ДНК M. avium. Структуры олигонуклеотидных праймеров приведены в таблице 1. Реакцию выполняли на ампли-фикаторе «iCycler» («Bio-Rad», США) с начальной денатурацией при 96 °С / 3 мин., далее в течение 33 циклов с денатурацией при 95 °С / 10 с., отжигом при 60 °С / 10 с. и элонгацией при 72 °С / 20 с. Число копий тандем-ного повтора рассчитывали в зависимости от размера ПЦР фрагмента и фланкирующей области (таблица 2).
При подсчете длины ПЦР-продукта для клинических изолятов мы отталкивались от длины фрагмента, содержащего тандемный повтор, в штамме M. avium. Для этого с помощью программы «Tandem Repeats Finder» (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) мы находили структуру повтора и фланкирующие его участки [3]. В случае наличия неполной копии повтора в геноме штамма M. avium (в таблице данные локусы отмечены звездочкой (*)), мы округляли количество повторов до целого числа. Рабочая формула имела вид:
Длина ПЦР-фрагмента = размер локуса в штамме M. avium - (количество повторов в штамме M. avium - количество копий) х (длина повтора).
Выборочно структуру и число копий повторов для каждого локуса верифицировали прямым секвенированием амплифициро-ванных фрагментов ДНК. Генотип каждого изолята отображали как набор из 4 цифр, где каждая цифра 4-значного номера показывала число копий соответствующего тандем-
ного повтора, а именно: VNTR 292, VNTR X3, VNTR 47, VNTR 7.
Результаты и обсуждение исследований
В результате проведенных культуральных и биохимических исследований изученные изоляты были отнесены к микобактериям туберкулеза птичьего вида (M. avium), свойства которых представлены в таблице 3.
Как видно из таблицы, по биохимическим свойствам изоляты практически не отличались друг от друга за исключением роста колоний при различных температурах (22 °C и 45 °С). По культуральным свойствам колонии незначительно различались между собой: цвет был преимущественно светлый или бежевый с характерной S-формой. Колонии были получены либо отдельные (мелкие или крупные), либо наблюдался сплошной газон.
Генетическое разнообразие 22 образцов M. avium было охарактеризовано с помощью VNTR-типирования с использованием 4 полиморфных тандемных локусов (AV7, AVX3, AV47, AV292). Результаты типирования сведены в таблицу 4.
Помимо этого была построена дендро-грамма кластеризации с использованием программы STATISTICA 8 (StatSoft, США) и алгоритма UPGMA (Unweighted pair-group average). Все исследованные образцы вошли в кластеры различного размера, размер которых варьировал от 2 до 5 (см. рис. 1). Индекс дискриминации в данном случае составил 0,86.
Мы выделили шесть кластеров, которые отметили на дендрограмме кластеризации. Кластеризация выборки изолятов M. avium по генетическому полиморфизму соотно-
Таблица 2.
Соотношения длин ПЦР-фрагментов и количества копий в исследуемых полиморфных локусах
Локус M. avium Кол-во повторов в M. avium Длина повтора 1 2 3 4 5 6 7
VNTR-292* 299 3,1 53 193 246 299 352 405 458 511
VNTR-7* 203 2,1 22 181 203 225 247 269 291 313
VNTR-47 217 3 33 151 184 217 250 283 316 349
VNTR-X3* 196 2,2 53 143 196 249 302 355 408 461
Таблица 3.
Культуральные и биохимические свойства изолятов М. аушт
Изоляты Культуральные свойства колоний Пигмент 22 °С 45 °С б л £ о <и Ч <и а о л К Гидролиз твин-80 Амидазная активность Редукция нитратов
на свету в темноте
1 крупные колонии округлой формы бежевого цвета, 8-форма - - + - + - - - -
2 колонии светлого цвета, слившиеся между собой, 8-форма - - - + - - - -
3 крупные 8-форма неправильной формы выраженного бежевого цвета - - - + - - - -
4 сплошной рост и отдельные крупные колонии 8-формы - - + + - - - -
5 мелкие, слившиеся между собой, бежевого цвета, 8-форма - - + + - - - -
6 крупные, 8-форма неправильной формы бежевого цвета - - - + - - - -
7 оранжевые колонии, слившиеся между собой 8-формы - - - + - - - -
8 слившиеся между собой колонии 8-формы - - - + - - - -
9 слившиеся между собой колонии 8-формы - - + - + - - - -
10 отдельные друг от друга колонии 8-формы - - + - + - - - -
11 колонии мелкие, отдельные друг от друга, слизистые бежевого цвета, 8-форма - - - + - - - -
12 колонии мелкие, темно-бежевого цвета, 8-форма - - - + - - - -
13 колонии мелкие округлые, кремового цвета, 8-форма - - + - + - - - -
14 слившиеся между собой колонии 8-формы - - - + - - - -
15 слившиеся между собой колонии 8-формы - - + + - - - -
16 сплошной рост и отдельные крупные колонии 8-формы - - + + - - - -
17 колонии мелкие, отдельные друг от друга, бежевого цвета, 8-форма - - + - + - - - -
18 колонии светлого цвета, слившиеся между собой, 8-форма - - + - + - - - -
19 колонии мелкие, отдельные друг от друга, бежевого цвета, 8-форма - - - + - - - -
20 крупные колонии округлой формы бежевого цвета, 8-форма - - - + - - - -
21 слившиеся между собой колонии 8-формы - - + + - - - -
22 слившиеся между собой колонии 8-формы - - + + - - - -
Таблица 4.
Результаты типирования по AV7, AVX3, AV47, AV292 локусам
№ изолята Место изоляции Из какого материала выделен AV7 AVX3 AV47 AV292
1 НСО, Ордынский р-н голубь 2 3 3 2
2 НСО Ордынский р-н КРС 2 3 3 2
3 НСО, Чулымский р-н КРС 2 3 3 0
4 НСО Ордынский р-н КРС 2 3 3 3
5 НСО, Кочковский р-н КРС 2 3 3 2
6 НСО, Карасукский р-н КРС 2 3 3 3
7 НСО Ордынский р-н свинья 2 4 2 2
8 НСО Ордынский р-н свинья 2 3 2 2
9 НСО Ордынский р-н свинья 2 4 3 2
10 НСО, Кочковский р-н свинья 2 3 2 2
11 НСО, Карасукский р-н КРС 2 3 3 2
12 НСО Ордынский р-н КРС 2 3 2 2
13 НСО, Коченевский р-н КРС 2 3 3 3
14 НСО, Карасукскийр-н КРС 2 4 3 2
15 НСО, Кочковский р-н КРС 2 3 3 3
16 НСО Ордынский р-н свинья 2 3 3 3
17 РА, Усть-Канский р-н Марал 2 3 3 2
18 НСО, Карасукский р-н КРС 2 4 2 2
19 НСО Ордынский р-н свинья 2 4 3 2
20 НСО Ордынский р-н свинья 2 3 3 0
21 НСО Ордынский р-н свинья 2 3 3 0
22 НСО Ордынский р-н свинья 2 3 3 0
сится с биохимическими различиями этих же микроорганизмов. Место изоляции возбудителей и вид материала не соответствовали большинству кластеров, за исключением кластера № 5. Индекс Hunter and Gaston при использовании метода VNTR-типирования D = 0,8571, биохимических методов исследования D = 0,671, что свидетельствует о большей диагностической эффективности метода VNTR-типирования. Метод VNTR-типирования (VNTR (анг.) - variable number tandem repeat, полиморфизм числа тандем-ных повторов) - широко используемый подход в изучении ряда патогенных бактерий: Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis, различные виды Salmonella и Mycobacterium. Внутри популяции бактериальных видов вариабельное количество тандемных повторов в локусах обеспечивают генетическое разнообразие. Впервые он был предложен для генотипирования микобактерии туберкулеза,
в геноме которого обнаружили ряд микобак-териальных рассеянных повторенных единиц (МГОЦ) [10]. Данные единицы варьируют по своему размеру от 46-53, 58-101 до 77-101 п. н. и расположены в геноме или как единичные копии, или в составе многократных тандемных повторов. Образование данных локусов связано с репликативными механизмами, которые индивидуальны для каждого локуса. Некоторые VNTR-локусы лежат в открытых рамках считывания, что допускает возможность функционального проявления полиморфизма. Выявление данных полиморфных потенциально функциональных локусов может способствовать увеличению дискриминационной способности метода и в то же время увеличивает вероятность нахождения ассоциации фенотипических признаков микобак-терий с генотипом. Другие VNTR-локусы находят в межгенных областях, таким образом,
Рис. 1. Дендрограмма кластеризации 22 изолятов M. avium, построенная по результатам VNTR-типирования (локусы AV7, AVX3, AV47, AV292). Ось абсцисс - коэффициент различия изолятов. Ось ординат - номера изолятов.
они могут влиять на транскрипцию и, возможно, на трансляцию генов. Стабильность полиморфных тандемных локусов в геноме M. avium еще не изучена, но на модели других микроорганизмов было показано, что локусы стабильны по крайней мере 18 месяцев, поэтому использование VNTR-метода адекватно для эпидемиологических исследований.
Сопоставление результатов использованных в работе тестов показало отсутствие корреляции между результатами генотипи-рования, культуральных и биохимических тестов, что говорит об использовании нами независимых диагностических маркеров, необходимости использования в диагностике микобактериозов традиционных методов, а для быстрой идентификации патогена -генетических методов.
Заключение
Таким образом, проведена идентификация и изучено генетическое разнообразие мико-бактерий, выделенных из биологического материала на обширной территории Западной Сибири и Республики Алтай, на основании проведенных культуральных, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования, позволивших отнести изученные микобактерии к микобактериям птичьего вида. Используемый при проведении генетических исследований метод VNTR-типирования демонстрирует хорошую дискриминационную способность и обладает рядом преимуществ: он быстр, воспроизводим, прост в исполнении, требует небольшого количества ДНК. Все вышесказанные преимущества данного подхода обосновывают актуальность его использования в эпидеми-
ологических широкомасштабных исследованиях генетического разнообразия различных патогенов, в том числе изолятов M. avium.
Список литературы
1. Донченко, А. С. Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей /
B. Н. Донченко. - Новосибирск : Изд-во РАСХН. Сиб. отд., 1994. - 354 с.
2. Новые методы исследования возбудителей ан-тропозоонозов. Туберкулез: методические рекомендации. - Москва, 2003. - 50 с.
3. Benson, G. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences / G. Benson. - Nucleic Acids Res, 1999. - 27:573.-80.
4. Cayrou, C. Genotyping of Mycobacterium avium complex organisms using multispacer sequence typing /
C. Cayrou, C. Turenne, M. a Behr, M. Drancourt // Microbiology, 2010. - 156 (Pt 3):687-94.
5. El-Sayed, A. Evaluation of three molecular methods of repetitive element loci for differentiation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) / A. El-Sayed, A. A. Hassan, S. Natour, A. Abdulmawjood, M. Bülte, W. Wolter, M. Zschöck // J Microbiol. - 2009, 47:253-9.
6. Mijs, W. Molecular evidence to support a proposal to reserve the designation Mycobacterium avium subsp. avium for bird-type isolates and "M. avium subsp. hominissuis" for the human/porcine type of M. avium / W. Mijs, P. de Haas, R. Rossau, T. Van der Laan, L. Rigouts, F. Portaels, D. van Soolingen // Int J Syst Evol Microbiol. - 2002, 52(Pt 5):1505-1518.
7. Nene, V. Genome Mapping and Genomics in Animal-Associated Microbes / V. Nene, C. Kole. -2009:257.
8. Radomski, N. Determination of genotypic diversity of Mycobacterium avium subspecies from human and animal origins by mycobacterial interspersed repetitive-unit-variable-number tandem-repeat and IS1311 restriction fragment length polymorphism typing methods / N. Radomski, V. C. Thibault, C. Karoui, K. de Cruz, T. Cochard, C. Gutierrez, P. Supply, F. Biet, M. L. Boschiroli // J Clin Microbiol. - 48:1026-1034.
9. Skuce, R. A. Discrimination of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria using novel VNTR-PCR targets / R. A. Skuce, T. P. McCorry, J. F. McCarroll, S. M. Roring, A. N. Scott, D. Brittain, S. L. Hughes, R. G. Hewinson, S. D. Neill // Microbiology, 2002. -148(Pt 2):519-528.
10. Supply, P. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis / P. Supply, C. Allix, S. Lesjean, M. Cardoso-Oelemann, S. Rusch-Gerdes, E. Willery, E. Savine, P. de Haas, H. van Deutekom, S. Roring, P. Bifani, N. Kurepina, B. Kreiswirth, C. Sola, N. Rastogi, V. Vatin, M. C. Gutierrez, M. Fauville, S. Niemann, R. Skuce, K. Kremer, C. Locht, D. van Soolingen // J Clin Microbiol., 2006. - 44:4498-4510.
