CC BY
14
УДК 619:616.98:579.873.21 Т - 07
Ключевые слова: изолят, микобактерии, биохимические свойства, биоматериал, полимеразная цепная реакция, амплификация
Key words: isolate, mycobacterium, biochemical properties, biomaterial, polymerase chain reaction, amplification
Ионина С. В., Тупота Н. Л., Тупота С. Г., Донченко В. Н.
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ МИКОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
THE CHARACTERISTIC OF MYCOBACTERIUM ISOLATED IN WESTERN SIBERIA
ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» СО Россельхозакадемии Адрес: 630501, Новосибирская область, п. Краснообск, а/я 8
Institute of Experimental Veterinary Science of Siberia and the Far East,
Siberian Branch of Russian Agricultural Academy Address: 630501, Russia, Novosibirsk region, Krasnoobsk, P. O. Box 8
Ионина Светлана Владимировна, к. б. н., ст. научн. сотрудник / Ionina Svetlana V., Ph.D., Senior Research Assistant Тупота Наталья Леонидовна, к. б. н., ст. научн. сотрудник / Tupota Natalya L., Ph.D., Senior Research Assistant Тупота Сергей Григорьевич, к. в. н., ст. научн. сотрудник / Tupota Sergej G., Ph.D., Senior Research Assistant Донченко Валерия Николаевна, к. б. н., вед. научн. сотрудник / Donchenko Valeria N., Ph.D., Leading Research Assistant
Аннотация. Изучено 20 изолятов микобактерий, выделенных из биоматериала сельскохозяйственных животных на территории различных природно-географических зон Западной Сибири, определены их основные характеристики и каждый из изолятов отнесен к определенному виду микобактерий. Определены органы-мишени при постановке биологической пробы в отношении изученных культур.
Summary. Twenty mycobacterial species isolated from farm animals within different natural and geographic zones of Western Siberia are studied. Their basic characteristics are defined. And each isolate is identified. Target organs are determined in the process of biological test concerning the studied cultures.
Введение
Борьба с туберкулезом крупного рогатого скота значительно осложняется тем, что часто в благополучных и неблагополучных хозяйствах при проведении плановых туберку-линизаций с использованием внутрикожной туберкулиновой пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих у животных отмечаются положительные реакции. При послеубойном осмотре туш этих животных видимых изменений, характерных для туберкулеза, часто не отмечается.
Это может быть вызвано инфицированием сельскохозяйственных животных не только типичными, но и атипичными ми-кобактериями, также вызывающими иммунологическую перестройку их организма и наличием родственных, аналогичных для различных типов, видов популяций мико-бактерий и их антигенных структур, что и приводит к возникающим положительными реакциями на введение ППД-туберкулина. Это подтверждается тем, что нетуберкулезные микобактерии в последние годы с воз-
растающей частотой обнаруживают в клиническом материале, полученном от больных и с подозрением на туберкулез сельскохозяйственных животных.
Вследствие этого для идентификации атипичных микобактерий, помимо бактериологической диагностики, должны применяться как биохимические методы исследования, основанные на том, что в процессе метаболизма разные виды проявляют различную ферментативную активность, так и генетические. Генотипирование микобактерий, в частности, является важным звеном в проведении высокодостоверных клинико-эпизо-отологических исследований для выявления источника заражения, диагностики инфекции и уточнения причин неблагоприятного течения заболевания [3, 5, 7, 9].
Цель исследований - провести полный комплекс микробиологических и молеку-лярно-генетических исследований изолятов, выделенных на территории различных при-родно-географических зон Западной Сибири, для их идентификации и определения ор-
ганов-мишеней в восприимчивом организме лабораторных животных.
Материалы и методы исследования
Для проведения научных исследований были использованы следующие методы: культуральный, состоящий из посевов суспензий изолятов микобактерий туберкулеза, предпосевной обработки методом седиментации внутренних органов лабораторных животных с последующим посевом полученного осадка на плотную питательную среду Финн-2; биологический, состоящий из заражения беспородных белых мышей суспензией, содержащей микобактерии туберкулеза, с последующим их убоем и взятием биологического материала для определения органов-мишеней [3].
Биохимические методы исследования ми-кобактерий с использованием следующих тестов: рост на свету и в темноте на наличие пигмента; при 22 °C и 45 °С; на среде с 5 % NaCl; твин-80; редукция нитратов с диметиламинобензальдегидом и определение амидазной активности с мочевиной. Способность микобактерий использовать амиды (мочевину) в процессе метаболизма определяли по методу Такэ. Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Тсукамура, гидролиз твин-80 проводили по модифицированной методике Вайна [1, 4].
Выделение суммарной ДНК из культур проводили, используя метод сорбции на силикагеле с применением набора ДНК-сорб-Б (ЦНИИЭ), согласно прилагаемой инструкции.
Полимеразная цепная реакция для выявления специфической ДНК Mycobacterium spp. проводилась с использованием пары праймеров на фрагмент межгенной последовательности 16S-23S рРНК: 5-ACCTCCTTTCTAAGGGCACC-3' и 5'-GATGCTCGCAACCACTATTCA-3' [10].
А также с использованием пары прай-меров на фрагмент гена mig Mycobacterium avium: 5-CCCGTTCAACGTCAACTTCC-3' и 5-GGGCTCGCCGGTCATCAGGT-3', последовательности которой были опубликованы M. L. Beggs et al., 2000 [6].
Для обнаружения фрагмента гена senX3-regX3 Mycobacterium tuberculosis complex использовали праймеры со следующими последовательностями: 5-GCGCGAGAGCCCGAACTGC-3' и 5-GCGCAGCAGAAACGTCAG -3' [8].
Химический синтез праймеров был осуществлен в ООО «Лаборатория Медиген» (Новосибирск). ПЦР проводили с применением набора лиофилизированных реагентов для ПЦР GenPack PCR Universal, согласно инструкции производителя. Постановку ПЦР осуществляли, используя отработанные и адаптированные к условиям лаборатории параметры амплификации.
Полученные в ПЦР данные анализировали методом электрофореза в 1,5%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В качестве маркера использовали pUC19/Kzo9 I и pBluescript/Msp. Результаты электрофореза учитывали в УФ-свете на трансиллюминаторе с длиной волны 246 нм. Длина полученного в ПЦР фрагмента составила 242 и 225 п.н.
Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР-фрагмента проводили на автоматическом секвенаторе "Beckman CEQ2000XL" (Beckman Coulter, Inc.), ^гласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности для проведения филогенетического анализа были получены из базы данных GenBank. Обработка последовательностей проводилась с использованием специализированных программных пакетов MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США).
Результаты и обсуждение исследований
Для проведения данных исследований были отобраны 20 изолятов, принадлежащих к типичным и атипичным видам микобактерий туберкулеза, которые были выделены в период с 2001 по 2010 год в различных природно-географических зонах Западной Сибири. Вышеуказанные культуры были посеяны на глицериновый картофель Павловского, затем пересеяны на яичную среду Финн-2. Трехнедельные культуры использовали в дальнейшей работе. Все исследованные культуры были положительны в ПЦР с родоспецифическими праймерами.
При проведении культуральных, биохимических и молекулярно-генетических исследований изолятов были получены следующие данные.
Изолят № 1: появление роста на 2-е сутки, мелкие колонии бежевого цвета, отдельные друг от друга, S-форма (слизистые). Образуют пигмент в темноте, проявляют рост при 22 и 45 °С, устойчивы к присутствию в составе сред 5 % №С1 и гидролизуют твин-80. При определении амидазной активности - реакция положительная. Восстанавливает нитраты.
Изолят № 2: появление роста на среде отмечено на 2-е сутки, средние и мелкие колонии бежевого цвета, возвышающиеся над средой, отдельные друг от друга, смешанной ^ и R) формы. Образование пигмента отсутствует в темноте, но происходит на свету, т. е. колонии фотохромогенные. Колонии растут при 22 °С, при 45 °С рост отсутствует. Не устойчив к 5 % №С1, но гидролизует твин-80. При определении амидазной активности - реакция положительная. Не восстанавливает нитраты.
Изолят № 3: появление роста на среде отмечено на 5-е сутки, колонии светлого цвета, слившиеся между собой, S-форма. Образование пигмента отсутствует и на свету, и в темноте - колонии нефотохромо-генные. Колонии растут при 22 °С и 45 °С. Не устойчив к 5 % №С1, гидролиз твин-80, амидазная активность и редукция нитратов -отрицательные.
Изолят № 4: появление роста на 2-е сутки, колонии светло-бежевые, слившиеся между собой, S-форма. Нефотохромогенные. Колонии растут при 22 °С, при 45 °С рост отсутствует. Не устойчив к 5 % №С1. Гидролизует твин-80. Амидазная активность и восстановление нитратов - отрицательные.
Изолят № 5: появление роста на среде отмечено на 4-е сутки, слизистые ^-формы) колонии, неправильной формы, слившиеся между собой и отдельные друг от друга, светло-бежевого цвета. Образуют пигмент в темноте, растут при 22 °С и 45 °С. Изолят устойчив к 5 % №С1 и осуществляет гидролиз твин-80. Амидазная активность отсутствует. Редукция нитратов - положительная.
Изолят № 6: начинает расти на 2-е сутки в виде крупных слизистых (S-форма) колоний неправильной формы выраженного бежевого цвета. Колонии нефотохромогенные, хорошо растут при 22 °C и 45 °C. Изолят устойчив к воздействию 5 % NaCl и обеспечивает гидролиз твин-80. Амидазная активность и редукция нитратов - отрицательная.
По результатам секвенирования и филогенетического анализа данный изолят был отнесен к Mycobacterium avium str. 104. Фрагмент нуклеотидной последовательности задепонирован в базе данных GenBank, и ему присвоен номер JN089335.
Изолят № 7: появление роста на среде отмечено на 5-е сутки, колонии светлого цвета, слившиеся между собой, S-форма. Образование пигмента отсутствует и на свету, и в темноте - колонии нефотохромогенные. Колонии растут при 22 °C и 45 °C. Не устойчив к 5 % NaCl, гидролиз твин-80, амидазная активность и редукция нитратов - отрицательные.
По результатам секвенирования и филогенетического анализа данный изолят был отнесен к Mycobacterium avium str. 104. Фрагмент нуклеотидной последовательности задепонирован в базе данных GenBank, и ему присвоен номер JN089338.
Изолят № 8: появление роста отмечено на 2-е сутки, средней величины колонии, отдельные друг от друга, возвышающиеся над поверхностью среды, и колонии, сливающиеся между собой и образующие сплошной налет. Колонии светло-бежевого цвета, S и R формы. Не образуют пигмент. Изолят растет при 22 °C, при 45 °C рост отсутствует. Не обладает устойчивостью к 5 % NaCl, амидазной активностью и способностью к восстановлению нитратов. Гидролиз твин-80 - положительный.
Изолят № 9: первичный рост на среде отмечен на 2-е сутки, оранжевые колонии, слившиеся между собой S-формы, образующие пигмент и на свету, и в темноте, т. е. ско-тохромогенные. Растут при 22 °C, при 45 °C рост отсутствует. Изолят обладает устойчивостью к 5 % NaCl, способностью гидроли-зовать твин-80 и восстанавливать нитраты, а также амидазной активностью.
По результатам секвенирования и филогенетического анализа данный изолят также был отнесен к Mycobacterium avium str. 104. Фрагмент нуклеотидной последовательности задепонирован в базе данных GenBank, и ему присвоен номер JN089340.
Изолят № 10: первичный рост отмечен на 2-е сутки, колонии, слившиеся между собой в виде сплошного налета, выраженного бежевого цвета, слизистые (S-форма). Образование пигмента отсутствует. Колонии хорошо растут при 22 °C и 45 °C. Изолят не устойчив к воздействию 5 % NaCl, не обладает амидазной активностью и не восстанавливает нитраты. Гидролиз твин-80 - положительный.
Изолят № 11: первичный рост отмечен на 3-и сутки, мелкие колонии, отдельные и слившиеся между собой, светло-бежевого цвета, смешанной S и R-формы. Колонии не образуют пигмента. Растут при 22 °C, при 45 °C рост отсутствует. Изолят обладает устойчивостью к 5 % NaCl. Гидролиз твин-80 отрицательный, амидазная активность и редукция нитратов - отрицательные.
На основании филогенетических исследований изолят был отнесен к Mycobacterium avium subsp. avium.
Изолят № 12: первичный рост колоний отмечен на 6-е сутки, колонии бежевого цвета, крупного и мелкого размера, отдельные друг от друга, S-формы, не образующие пигмента. Растут при 22 °C, при 45 °C рост отсутствует. Изолят обладает устойчивостью к 5 % NaCl, способностью гидролизовать твин-80 и редуцировать нитраты. Амидазная активность - отрицательная.
Изолят № 13: рост на среде отмечен на 2-е сутки в виде сплошного налета бледно-желтого цвета S-формы, не образующего пигмента. Растут при 22 °C, при 45 °C рост отсутствует. Изолят не обладает устойчивостью к 5 % NaCl и способностью восстанавливать нитраты. Гидролиз твин-80 и амидаз-ная активность - положительные.
Изолят№ 14: первичный рост колоний отмечен на 15-е сутки, мелкие светло-бежевые колонии, отдельные друг от друга, R-формы, не образуют пигмента. Не растут при 22 °C и 45 °C. Изолят не обладает устойчивостью
к 5 % NaCl и способностью восстанавливать нитраты, гидролиз твин-80 - отрицательный. Обладает амидазной активностью.
Изолят № 15: первичный рост колоний отмечен на 12-е сутки, мелкие светло-бежевые колонии, отдельные друг от друга, R-формы, не образуют пигмента. Не растут при 22 °C и 45 °C. Изолят не обладает устойчивостью к 5 % NaCl и способностью восстанавливать нитраты, гидролиз твин-80 - отрицательный. Обладает амидазной активностью.
При постановке ПЦР на фрагмент гена senX3-regX3 Mycobacterium tuberculosis complex был получен положительный результат и установлено, что изолят относится к M. bovis.
Изолят № 16: рост на среде появился на 6-е сутки, мелкие и средние колонии, бежевого цвета, по консистенции - ближе к S-форме, образуют пигмент на свету и в темноте, т.е. скотохромогенные. Растут при 22 °C и 45 °C. Изолят устойчив к воздействию 5 % NaCl, обладает амидазной активностью и способностью восстанавливать нитраты. Гидролиз твин-80 - отрицательный.
Изолят № 17: рост отмечен на 2-е сутки в виде слившихся между собой колоний, образующих сплошной налет на поверхности среды, светло-бежевого цвета S-формы, пигмент отсутствует. Растут при 22 °C и 45 °C. Изолят обладает способностью гидролизо-вать твин-80, амидазной активностью. Способность восстанавливать нитраты проявляется на 60 %. Неустойчив к 5 % NaCl.
Изолят № 18: первичный рост отмечен на 10-е сутки, отдельные друг от друга, светло-бежевого цвета, R-форма, не образуют пигмент. Не растут при 22 °C и 45 °C. Изо-лят не обладает устойчивостью к 5 % NaCl и способностью восстанавливать нитраты, гидролиз твин-80 - отрицательный. Обладает амидазной активностью.
Изолят № 19: первичный рост был отмечен на 3-и сутки, колонии оранжевого цвета, сливаются между собой, образуя сплошной налет на поверхности среды, имея S-форму и образуя пигмент на свету и в темноте. Растут при 22 °C и 45 °C. Изолят устойчив к воздействию 5 % NaCl, обладает способностью гидролизовать твин-80 и восстанавливать
нитраты. Амидазная активность - отрицательная.
Изолят 20: первичный рост отмечен на 10-е сутки, колонии, слившиеся между собой в виде сплошного налета, S-формы. Пигмент не образовывали ни на свету, ни в темноте, но со временем могли приобретать желтую окраску. Наблюдали отсутствие роста при 22 °С и 45 °С. Наблюдалась положительная реакция гидролиза твин-80, культура не устойчива к 5 % NaCl, обладает амидаз-ной активностью, а способность восстанавливать нитраты проявляется на 60 %.
По результатам секвенирования и филогенетического анализа данный изолят также был определен как к Mycobacterium arupense. Фрагмент нуклеотидной последовательности задепонирован в базе данных GenBank, и ему присвоен номер JQ029962.
Общие данные культуральных и биохимических свойств каждого из изученных изоля-тов, представлены в таблице 1.
Для проведения биологической пробы для каждого изолята были взяты 12 беспородных белых мышей. Заражение проводили путем введения в хвостовую вену 0,5 мл суспензии микобактерий, разведенной по стандарту мутности 105МЕ. Через 14 дней проводили убой 6 мышей, через 30 дней - еще 6. У каждого животного исследовали органы на наличие изменений, характерных для туберкулеза, и брали легкие, печень и селезенку с целью определения органов-мишеней при помощи проведения культурального метода исследования.
Органы обрабатывали методом седиментации и проводили посевы полученных суспензий на питательную среду Финн-2. Учет появления роста колоний проводили через каждые 2 дня в течение первой недели, затем 1 раз в неделю в течение дальнейших 3 месяцев.
При обработке биоматериала от мышей, убитых через 14 дней после заражения с целью определения органов-мишеней, получены следующие результаты: рост колоний при посеве суспензий, полученных при обработке селезенки, отмечен в 79 % посевов; при посеве печени - в 91 %; при посеве легких - в 60 %.
При обработке биоматериала от мышей, убитых через 30 дней после заражения с целью определения органов-мишеней, получены следующие результаты: рост колоний при посеве суспензий, полученных при обработке селезенки, отмечен в 68 % посевов; при посеве печени - в 50 %; при посеве легких - в 23 %.
На основании проведения комплекса культуральных, биохимических и молеку-лярно-генетических исследований 20 изолятов, выделенных из различных природ-но-географических зон Западной Сибири, данные культуры отнесены к следующим видам микобактерий туберкулеза: изолят № 1 - M. flavescens; изолят № 2 - M. kansasii; изолят № 3 - M. avium; изолят № 4 -M. gastrii; изолят № 5 - M. flavescens; изолят № 6 - M. avium; изолят № 7 - M. avium; изо-лят № 8 - M. avium; изолят № 9 - M. avium; изолят № 10 - M. paratuberculosis; изолят № 11 - M. avium; изолят № 12 - M. fortuitum; изолят № 13 - M. gastrii; изолят № 14 -M. bovis; изолят № 15 - M. bovis; изолят № 16 - M. phlei; изолят № 17 - M. terrae; изолят № 18 - M. bovis; изолят № 19 - M. triviale, изолят № 20 - M. arupense.
Заключение
Таким образом, использование при выделении и идентификации микобактерий не только культурального метода, но и комплекса биохимических и молекулярно-гене-тических методов исследования, позволило провести более полную идентификацию ми-кобактерий, выделенных на обширной территории Западной Сибири.
Определение органов-мишеней при попадании в восприимчивый организм лабораторных животных (белые мыши) типичных и атипичных микобактерий показало, что выделение культур через 14 дней после заражения из печени происходит в 1,15 раза чаще, чем из селезенки, и в 1,5 раза чаще, чем из легких. Аналогичный показатель при выделении культур через 28-30 дней указывает на то, что рост культур из селезенки происходит в 1,4 раза чаще, чем из печени, и в 3 раза чаще, чем из легких. Следовательно, органами мишенями, в которых происхо-
Таблица 1.
Культуральные и биохимические свойства изученных изолятов
Изо-ляты Культуральные свойства Пигмент 22 °С 45 °С Рост на среде с 5% NaCl Гидролиз твин-80 Ами-дазная активность Редукция нитратов
на свету в темноте
№ 1 мелкие колонии бежевого цвета, отдельные друг от друга, 8-форма - - + + + + + +
№2 средние и мелкие, бежевого цвета, отдельные друг от друга, 8 и Я формы + - + - - + - + -
№3 колонии светлого цвета, слившиеся между собой, 8-форма - - + + - - - - -
№4 колонии светло-бежевые, слившиеся между собой, 8-форма - - + - - + - -
№5 8-формы, слившиеся и отдельные друг от друга, светло-бежевого цвета - + + + + + - +
№6 Крупные, 8-форма неправильной формы выраженного бежевого цвета - - + + + + - -
№7 мелкие, слившиеся между собой, бежевого цвета, ближе к Я-форме - - + + - - - -
№8 средние, отдельные друг от друга и сливающиеся между собой в налет, светло-бежевого цвета, 8 и Я формы - - + - - + - -
№9 оранжевые колонии, слившиеся между собой, 8-формы - - + + - - - -
№ 10 слившиеся между собой в виде налета, выраженного бежевого цвета, 8-форма - - + + - + - -
№ 11 мелкие, отдельные и слившиеся между собой, светло-бежевого цвета, 8 и Я-формы - - + - + - - -
№ 12 бежевого цвета, крупного и мелкого размера, отдельные друг от друга, 8-формы - - + - + + - +
№ 13 налет бледно-желтого цвета 8-формы - - + - - + + -
№ 14 мелкие светло-бежевые колонии, отдельные друг от друга, Я-формы - - - - - - + -
№ 15 мелкие светло-бежевые колонии, отдельные друг от друга, Я-формы - - - - - - + -
№ 16 мелкие и средние колонии, бежевого цвета, ближе к 8-форме + + + + + - + +
№ 17 сливаются между собой в сплошной налет, светло-бежевого цвета 8-формы - - + + - + + + -
№ 18 мелкие светло-бежевые колонии, отдельные друг от друга, Я-формы - - - - - - + -
№ 19 оранжевого цвета, образуют сплошной налет на поверхности среды, имея 8-форму + + + + + + - +
№20 колонии желтого цвета, 8-формы - - - - - + + +
дит максимальное накопление микобактерий туберкулеза при экспериментальном заражении белых мышей, являются печень и селезенка, в легких микобактерии накапливаются в меньшей степени.
Список литературы
1. Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий : Метод. рекомендации / Мин. здравоохранения РСФСР. - Ленинград, 1980. - 19 с.
2. Западнюк, И. П. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И. П. Западнюк, В. И. Западнюк, Е. А. Захария, Б. В. Западнюк. - Киев : Вища школа. Головное изд-во, 1983. - 383 с.
3. Кузин А. И. Оздоровление животноводческих хозяйств от туберкулеза / А. И. Кузин. - М. : Россель-хозиздат, 1982. - 103 с.
4. Новые методы исследования возбудителей ан-тропозоонозов. Туберкулез : метод. рекомендации. -М., 2003. - 50 с.
5. Урбан, В. П. Причины аллергических реакций на внутрикожное введение туберкулина у КРС в бла-
гополучных по туберкулезу хозяйствах / В. П. Урбан, Ю. Ю. Данко, В. А. Пескова // Сб. науч. тр. Ленингр. вет. ин-та, 1985. - С. 95-98.
6. Beggs, M. Specific Identification of Mycobacterium avium Complex Isolates by a Variety of Molecular Technigues / M. Beggs, R. Stevanova, K. D. Eisenach // J. Clin. Microbiol. - 2000. - V. 38, № 2. - P. 508-512.
7. Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap / J. Felsenstein // Evolution. - 1985. - V. 39. - P. 787-791.
8. Magdalena, J. Identification of a new DNA region specific for members of Mycobacterium tuberculosis complex / J. Magdalena, A. Vachee, Ph. Supply, C. Locht. // Journal of Clinical Microbiology. - 1998. -V. 36. - № 4. - P. 937-943.
9. Saitou, N. The Neighbor - joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees / N. Saitou, M. Nei // Mol.Biol.Evol. - 1987. - V. 4. - P. 406-425.
10. Xiong, L. Use of PCR and Reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species / L. Xiong, F. Kong. Y. Yang, J. Cheng, G. L. Gilbert // Journal of Clinical Microbiology. - 2006. - V. 44. - № 10. -P. 3544-3550.
T3
к
ш
Ш
