CC BY
189
КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
использование пенто1 в процедуре интрацитопл; инъекции СПЕРМИЯ (ICSI)
УДК 616.69—008.6:615.256 Поступила 12.04.2010 г.
АА Одинцов, к.м.н., зав. отделением вспомогательных репродуктивных технологий1;
И.Н. Кучков, к.б.н., научный сотрудник2- 3;
И.В. Черкашина, к.б.н., младший научный сотрудник2;
Т.Е. Потемина, д.м.н., зав. кафедрой патологической физиологии4
приволжский областной медицинский центр ФМБА России, Н. Новгород;
2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина;
3Центр репродукции и генетики человека «Имплант», Харьков, Украина;
4Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород
Цель исследования — изучить возможность использования стимулятора подвижности спермиев пентоксифиллина для проведения процедуры интрацитоплазматической инъекции спермия (ICSI) эпидидимальными (PESA) и тестикулярными (TESE) спермиями при дискинезии.
Материалы и методы. Стимуляция подвижности сперматозоидов достигалась добавлением к образцам пентоксифиллина в конечной концентрации 3,5 ммоль/л.
Результаты. Установлено, что использование пентоксифиллина приводит к появлению местнокачающихся клеток как в случае PESA (16,2%), так и при TESE (14,8%). Отмечен высокий уровень оплодотворения ооцитов стимулированными спермиями. Высказывается мнение о целесообразности использования пентоксифиллина для проведения ICSI при получении неподвижных сперматозоидов.
Ключевые слова: спермии человека, пентоксифиллин, ICSI, PESA, TESE.
English
Use of pentoxyphilline in a spermia intracytoplasmatic injection (ICSI) procedure
AA Odintsov, c.m.s., head of the lacertus reproductive technology department1;
I.N. Kuchkov, c.b.s., scientific worker2- 3;
I.V. Cherkashina, c.b.s., junior scientific worker2;
T.E. Potyomina, M.D., head of a pathologic physiology chair4
1 Volga regional medical center of the FMBA of Russia, N. Novgorod;
2 Institute of the cryobiology and cryomedicine problems of the Ukraine NAS, Kharkov, Ukraine;
3 Center of the «Implant» human reproduction and genetics, Kharkov, Ukraine;
4 Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod
Aim of investigation is a study of the pentoxyphilline spermia mobility stimulator use possibility for a spermia intracytoplasmatic injection procedure (ICSI) with the epididymal (PESA) and testicular (TESE) spermias at a dyskinesia.
Materials and methods. A stimulation of the spermatozoon mobility was achieved by addition to the pentoxyphilline samples in a terminal concentration of 3.5 mmol/l.
Results. It is established, that a pentoxyphilline use leads to the locally-swaying cell appearance both in a case of PESA (16.2%) and at the TESE (14.8%). A high level of the oocyte fertilization with the stimulated spermias is marked. An opinion of the pentoxyphilline use expediency for the ICSI at the immobile spermatozoon receipt is presented.
Key words: human spermias, pentoxyphilline, ICSI, PESA, TESE.
Для контактов: Потемина Татьяна Евгеньевна, тел. раб. 8(831)465-46-58, тел. моб. +7 903-602-21-08; e-mail: potemin@pisem.net. Использование пентоксифиллина в процедуре интрацитоплазматической инъекции спермия (ICSI) СТМ J 2010 - 3 53
КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
В случаях тяжелых форм мужского бесплодия беременность может быть получена с помощью сложной микроманипуляционной операции — интрацитоплазматической инъекции спермия прямо в яйцеклетку (ICSI) [1]. Разработка этого метода расширила возможности лечения мужского бесплодия, продемонстрировав отличные показатели беременности у тех пар, которые раньше, без использования донорской спермы, были обречены на бездетность. Показаниями для ICSI служат: низкие концентрация и подвижность сперматозоидов в эякуляте, сочетанная патология спермы, клинически значимое наличие антиспермальных антител в эякуляте, неудовлетворительное оплодотворение ооцитов in vitro или его отсутствие в предыдущей попытке экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), получение спермиев с помощью хирургических операций в процедурах PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration), TESA (Testicular Sperm Aspiration) или TESE (Testicular Sperm Extraction). В каждом из этих случаев констатируется нарушение морфофункциональных свойств клеток, обнаруживаются даже образцы с полностью неподвижными спермиями. Невозможность определить подвижные спермии в эякуляте сильно затрудняет проведение процедуры ICSI, так как неподвижные клетки могут оказаться нежизнеспособными.
Известно, что стимуляторы подвижности — кофеин и пентоксифиллин — улучшают оплодотворяющую способность, повышают криорезистентность спермиев и частоту наступления беременности [2, 3].
Цель исследования — изучение возможности применения пентоксифиллина в процедуре ICSI с использованием эпидидимальных и тестикулярных сперматозоидов.
Материалы и методы. Проведено 47 манипуляций ICSI, в 26 из которых использовались спермии, полученные после процедуры PESA, и в 21 — после процедуры TESE. Во всех случаях в образцах фиксировали неподвижные клетки.
Эпидидимальные сперматозоиды получали микрохирургически из проксимальной области головки придатка. Их аспирировали непосредственно из вскрытого канальца в инсулиновый шприц, заполненный 0,25 мл среды Menezo B2, оценивали подвижность и концентрацию спермиев в аликвоте и центрифугировали в двуслойном градиенте Percoll (80—40%).
Тестикулярные сперматозоиды выделяли из яичек в ходе открытой хирургической процедуры у пациентов с обструктивной азооспермией. Пробу переносили в чашку Петри, содержащую среду Menezo B2, и оценивали под инвертированным микроскопом на предмет наличия спермиев. После удаления фрагментов тестикулярной ткани образцы центрифугировали в двуслойном градиенте Percoll (80—40%).
Стимуляция подвижности сперматозоидов достигалась добавлением к образцам пентоксифиллина в конечной концентрации 3,5 ммоль/л [4].
Подготовку ооцитов проводили по стандартной процедуре контролируемой овариальной стимуляции, применяемой в программе ЭКО [5]. В работе использовали среды ф. MediCult (Дания). Выделение ооцитов
осуществляли трансвагинально под контролем ультразвука. Клетки кумулюса удаляли после инкубации ооцит-кумулюсных комплексов в среде с гиалурони-дазой SynVitro®Hyadase ф. MediCult (Дания) повторяющейся аспирацией и выталкиванием через поликарбо-натные гибкие капилляры уменьшающегося диаметра Cook® Flexipets® (США). ICSI выполнялось на морфоло-гически-интактных ооцитах с экструзией первого полярного тельца. В работе использовали микроманипулятор ф. Narishige (Япония). Инъецированные ооциты исследовали через 16—18 ч на предмет наличия пронуклеусов. Оплодотворение считали нормальным при наличии двух отчетливых пронуклеусов, содержащих нуклеолы.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью U-теста Манна—Уитни и описательной статистики набора средств анализа данных компьютерной программы Microsoft Excel 2007. В качестве критерия достоверности различий принимали уровень 95% (р<0,05).
результаты и обсуждение. Для проведения процедуры ICSI предпочтительнее использовать подвижные спермии, так как это значительно увеличивает результативность процедуры. В случаях полной неподвижности спермиев, часто наблюдаемых при PESA, TESE или после отогрева замороженных образцов, как правило, применяют тесты на жизнеспособность. Показано [6], что подвижные клетки удалось обнаружить в образцах после 24 ч культивирования в питательной среде. Существующие тесты для определения жизнеспособности спермиев (окрашивание эозин-нигрозином, гипоосмотический тест), которые регламентированы Всемирной Организацией Здравоохранения [7], не позволяют использовать такие клетки в дальнейшем из-за повреждения спермиев [8].
Пентоксифиллин (3,7-диметил-1,5-оксогексилксан-тин) является ингибитором фосфодиэстеразы из группы метилксантинов. Он препятствует распаду циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), который играет ключевую роль в подвижности спермиев [9]. Во вспомогательных репродуктивных технологиях пенток-сифиллин широко применяется при подготовке эякулята для искусственной инсеминации спермой мужа или донора при низких показателях подвижности клеток. Пентоксифиллин является фармакопейным препаратом и широко используется в медицине как спазмолитическое средство.
Добавление препарата к суспензии спермиев в конечной концентрации 3,5 ммоль/л позволило получить достаточный процент местнокачающихся клеток во всех образцах (рис. 1). Колебательные движения клеток появлялись через 5 мин инкубации и в течение 30 мин стимулирующий эффект пентоксифиллина проявлялся полностью. В некоторых случаях отмечалась прогрессивная подвижность спермиев. Нами не установлено достоверной разницы в количестве клеток с колебательным движением, полученных при процедуре PESA — 16,2% или TESE — 14,8%.
Количество нормально оплодотворившихся ооци-тов различалось в зависимости от типа сперматозои-
54 СТМ J 2010 - 3 А.А. Одинцов, И.Н. Кучков, И.В. Черкашина, Т.Е. Потемина
дов. Самый высокий показатель оплодотворения (62,4%) зафиксирован для эпидидимальных спер-миев и достоверно ниже — для тестикулярных (41,7%). Контролем в этих исследованиях служили сперматозоиды эякулята — 84,2% (рис. 2).
Известно, что для приобретения оплодотворяющей способности спермии должны капацитиро-вать [7]. Посттестикулярное дозревание является сложным, до конца не выясненным биохимическим процессом. При этом ключевую роль в приобретении сперматозоидом фертильных свойств играют энергозависимые процессы ионного транспорта, изменения подвижности жгутика, поверхностной структуры спермия. Все перечисленные процессы для своей реализации требуют цАМФ — макро-эргического субстрата, который является универсальным посредником передачи внутриклеточного сигнала. Добавление пентоксифиллина обеспечивает необходимую концентрацию этого вторичного мессенджера. Мы полагаем, что данный препарат, добавленный к эпидидимальным и тестикулярным спермиям, позволяет запустить in vitro процессы капацитации в них. Использование капацитиро-ванных спермиев для процедуры ICSI более целесообразно и биологически оправдано, так как в условиях оперативного извлечения из репродуктивного тракта сперматозоиды лишены возможности стать форменными элементами эякулята с соответствующим биохимическим окружением семенной плазмы. Следует отметить, что проявившие под влиянием пентоксифиллина способность двигаться спермии могут быть перенесены в среду инкубации без препарата, где снова станут неподвижными. Этот факт не может препятствовать их дальнейшему использованию в процедуре ICSI. Напротив, в этих условиях происходит отмывка от стимулятора и исключение его возможного вредного воздействия на ооцит.
Заключение. Пентоксифиллин — стимулятор подвижности спермиев человека с четко установленным механизмом действия [2] — целесообразно использовать при проведении процедуры интра-цитоплазматической инъекции спермия в случае наличия неподвижных сперматозоидов в образце.
Литература
1. Joris H., Nagy Z.P., Van de Velde H. et al. Intracytoplasmatic sperm injection: laboratory set-up and injection procedure. Human reproduction 1997; 13(Suppl. 2): 76—86.
2. Yovich J.L. Pentoxifylline: actions and applications in assisted reproduction. Human Reproduction 1993; 8(11): 1786—1791.
3. Alvarez J.G. Nurture vs nature: how can we optimize sperm quality? J Androl 2003; 24: 640—648.
4. Лучко Н.А., Грищенко В.И., Кучков И.Н., Калугин Ю.В. Способ повышения подвижности спермиев человека. Патент №31979А Украины, МПК 6 А61К31/52, АО1Ж/02. Опубл. в Б.И., 2000, №7—11, с. 168.
рис. 1. Увеличение подвижности эпидидимальных (PESA) и тестикулярных (TESE) спермиев после внесения 3,5 ммоль/л пентокси-филлина в среду инкубации неподвижных клеток (нулевой уровень)
рис. 2. Исходы ICSI в зависимости от источника получения сперматозоидов
5.
6.
7.
9.
Кулаков В.И., Леонов Б.В., Кузьмичев Л.Н. и др. Лечение женского и мужского бесплодия. М: Изд-во МИА, 2005; 592 с.
Emiliani S., Van den Bergh M., Vannin A.S. et al. Increased sperm motility after in-vitro culture of testicular biopsies from obstructive azoospermic patients results in better postthaw recovery rate. Hum Reprod 2000; 15: 2371—2374.
World Health Organization. WHO Laboratory manual for the examination of human semen and semen-cervical mucus interaction. Cambridge, UK: Cambridge University Press; 1999.
Casper R.F., Meriano J.S., Jarvi K.A. et al. The hypoos-motic swelling test for selection of viable sperm for intracy-toplasmic sperm injection in men with complete astheno-zoospermia. Fertil Steril 1996; 65: 972—976.
Tash J.S., Means A.R. Cyclic adenosine 3',5' monophosphate, calcium and protein phosphorylation in flagellar motility. Biol Reprod 1983; 28: 75—104.
Использование пентоксифиллина в процедуре интрацитоплазматической инъекции спермия (ICSI) СТМ 1 2010 - 3 55
