CC BY
172
Современные технологии в лечении азооспермии методом микродиссекции ТЕСЕ в программе ЭКО-ИКСИ. Обзор литературы. Часть I
К.м.н. И.И. ВИТЯЗЕВА*, к.м.н. С.В. БОГОЛЮБОВ, акад. РАН и РАМН И.И. ДЕДОВ
The role of modern technologies in the management of azoospermia using microdissection TESE in the framework of the ECF-ICSI program. A literature review. Part I.
I.I. VITYAZEVA, S.V. BOGOLYUBOV, I.I. DEDOV
ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ, Москва
Рассматриваются современные методы лечения бесплодия у мужчин с обструктивной и необструктивной азооспермией. Анализируются критерии и прогностические факторы успешного получения сперматозоидов с помощью инвазивных манипуляций на яичках. Особое внимание уделяется результатам исследования состояния AZF-региона Y-хромосомы, а также с синдромом Клайнфельтера. Приведена современная классификация биоптатов яичка, позволяющая на основании гистологических данных разграничивать различные формы нарушения сперматогенеза.
Ключевые слова: вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), об-структивная азооспермия (ОА), необструктивная азооспермия (НОА), AZF-делеции, микро-ТЕСЕ.
The present review is focused on the modern methods for the treatment of male infertility related to obstructive and unobstructive azoospermia. The criteria and prognostic factors for obtaining spermatozoa by means of invasive manipulations on the testicles are considered. Special attention is given to the results of investigations into the state of the AZF-region of Y-chromosome and of the studies of patients presenting with Klinefelter's syndrome. The modern classification of testicular biopsies is presented that allows to discriminate between different forms of compromised spermatogenesis.
Key words: assisted reproductive technologies, extracorporeal fertilization (ECF), azoospermia, AZF deletions, microTECE.
1. Введение
Азооспермия является наиболее тяжелой формой патозооспермии и характеризуется отсутствием сперматозоидов в эякуляте при не менее чем двухразовом исследовании центрифугированной семенной жидкости. Азооспермия выявляется у 1% всего мужского населения и у 10—15% инфертильных мужчин. Различают азооспермию двух типов — об-структивную (ОА) и необструктивную (НОА); возможно также их сочетание [1, 2].
При ОА сперматозоиды в семенных канальцах яичек вырабатываются, но из-за непроходимости какого-либо участка семявыносящих протоков не попадают в эякулят. Нарушение проходимости се-мявыносящих протоков может быть обусловлено травмой, урогенитальными инфекциями, операциями на органах мошонки, вазорезекцией с целью мужской контрацепции, а также некоторыми генетическими синдромами, например, муковисцидо-зом. Повышенная частота мутаций гена муковисци-доза отмечается и у пациентов с тяжелой формой олигоспермии (снижение объема эякулята) и НОА. В настоящее время идентифицированы более 1800 мутаций или полиморфизмов гена муковисцидоза —
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) и около 250 из них могут предрасполагать к нарушению сперматогенеза и/или оплодотворяющей способности сперматозоидов [3].
Внедрение в 1992 г. микрохирургического метода интрацитоплазматической инъекции единичного сперматозоида в ооцит (ICSI, ИКСИ) в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) открыло новую перспективу помощи супружеским парам с тяжелым мужским фактором бесплодия [4, 5]. Первая беременность в программе ЭКО после ИКСИ с использованием эпидидимальных сперматозоидов при ОА была описана P. Temple-Smith и соавт. [6] в 1985 г. Для извлечения сперматозоидов выделяли придаток яичка под общей анестезией.
Этот способ получения сперматозоидов практиковался большинством специалистов вплоть до разработки менее травматичных операций: ПЕСА — чрескожная аспирация сперматозоидов из придатка яичка и ТЕСА — чрескожная аспирация сперматозоидов из ткани яичка. Для извлечения сперматозоидов при ПЕСА использовали полую тонкую иглу 21-25G с присоединенной силиконовой трубочкой и 20,0 мл шприцем для создания вакуума.
© Коллектив авторов, 2012 66
*e-mail: [email protected]
Первые беременности после ТЕСА-ИКСИ те-стикулярными сперматозоидами от мужчин с ОА наблюдались в 1993 г. [7, 8]. Экстракция сперматозоидов из ткани яичка (ТЕСЕ) при ОА впервые была произведена P. Devroey и соавт. [9] в 1994 г. Затем было описано использование ТЕСЕ и при НОА [10, 11].
В попытках обнаружить нужное количество сперматозоидов для оплодотворения при ТЕСЕ часто производили множественную биопсию всего яичка [12, 13], что могло вызвать повреждение его ткани вплоть до атрофии и, тем самым, ограничить лечение одной попыткой ЭКО [14].
Применение c 1997 г. тонкоигольной биопсии вместо открытой c целью получения сперматозоидов для ИКСИ несколько уменьшает повреждение ткани яичек [15]. Однако в трудных случаях НОА (при очень скудном сперматогенезе) тонкоигольная биопсия значительно реже обнаруживает очаги сперматогенеза, чем открытая. Основным фактором, определяющим успех в каждой конкретной клинической ситуации, является количество исследуемой тестикулярной ткани [16, 17].
По мнению R. Hauser и соавт. [18], не существует какого-либо участка или зоны в яичке, в котором с наибольшей вероятностью можно было бы обнаружить сперматозоиды; поэтому авторы рекомендуют не одиночную, а множественную биопсию, подчеркивая, что часто сперматозоиды присутствуют только в одном из биоптатов. Кроме того, не менее чем в 15% случаев предварительная диагностическая биопсия яичек не позволяет предвидеть успешность последующих манипуляций [18].
P. Schlegel [19] показал, что отдельные очаги нормального сперматогенеза довольно часто обнаруживаются с помощью операционного микроскопа; тем самым, можно удалять лишь очень малые участки семенных канальцев, не повреждая остальную ткань яичка. Прямое использование операционного микроскопа является большим преимуществом микрохирургической ТЕСЕ, но далеко не всегда позволяет количественно оценить гистологическое распределение сперматогенеза.
НОА диагностируется при нарушении созревания или отсутствия сперматозоидов в ткани яичка, т.е. при тестикулярной недостаточности, которая встречается у 10% бесплодных мужчин и диагностируется у 60% мужчин с азооспермией. Причинами тестикулярной недостаточности могут быть генетические нарушения (аномалии половых хромосом, транслокации и мутации в AZF зоне Y-хромосомы), крипторхизм, перекрут яичка, воздействие репро-токсикантов (радиоактивного облучения, химиотерапии и отравления токсинами) [20—24].
Несмотря на отсутствие сперматозоидов в эякуляте у мужчин с НОА, у некоторых из них можно
получить сперматозоиды из ткани яичек, поскольку иногда сохраняются отдельные мелкие очаги активного сперматогенеза. Теоретической основой попыток получения сперматозоидов для ИКСИ из яичек мужчин с очевидным отсутствием сперматогенеза явились более ранние гистологические исследования тестикулярных биоптатов у фертильных и бесплодных мужчин, где зрелые сперматиды (сперматозоиды) случайно находили в биоптатах яичек мужчин с НОА. Таким образом, существует, по-видимому, некий минимальный порог сперматогенеза, для того чтобы сперматозоиды попадали в эякулят [25, 26].
Распределение сперматогенеза в паренхиме яичка было показано в работе S. Silber [27], который проанализировал 103 случая НОА: при НОА, обусловленной герминативной недостаточностью, в каждом семявыносящем канальце присутствует в среднем от 0 до 3 зрелых сперматозоидов, тогда как у мужчин с нормальным сперматогенезом и ОА — от 17 до 35 зреющих клеток. Первое число представляет собой количественный порог сперматогенеза, только выше которого сперматозоиды могут попадать в эякулят. Как при тестикулярном «картировании» путем множественных биопсий (я=15), так и при микрохирургическом удалении смежных полосок тестикулярной ткани (я=43) обнаруживалось диффузное количественное распределение сперматогенеза. Микрохирургический подход к получению сперматозоидов обеспечивал минимальное количество извлекаемой ткани. Под местной анестезией часто удается извлекать меньшее количество канальцев с сохранившимся сперматогенезом. Даже тогда, когда для нахождения сперматозоидов приходится удалять большое количество ткани, микрохирургическая ТЕСЕ предотвращает вторичное повреждение яичек, так как сохраняет их кровоснабжение, уменьшает болевые ощущения и атрофию вследствие повышенного тестикулярного давления, и, поэтому, сохраняет возможность будущих попыток нахождения сперматозоидов.
Ранние сообщения о ТЕСЕ у небольшого числа пациентов характеризовались высокой (до 80%) частотой получения сперматозоидов (SRR — sperm retrieval rate), однако в последующих операциях ТЕСЕ SRR оказывалась значительно меньшей (около 50%) [10, 12, 28, 29].
2. Критерии успеха инвазивных манипуляций на яичках
Оптимальный метод получения достаточного числа подвижных сперматозоидов для ИКСИ (и, по возможности, криоконсервации оставшихся сперматозоидов для последующих попыток) должен быть минимально травматичным. Учитывая, что во многих случаях НОА сохраняются только отдельные очаги сперматогенеза, множественная мультифо-кальная биопсия при ТЕСЕ должна увеличивать
SRR. Однако удаление большого объема тестику-лярной ткани в некоторых случаях приводит к атрофии яичек [30, 31]. С другой стороны, тонкоигольная аспирация менее инвазивна, хотя ее эффективность при НОА сомнительна. По данным трех проспективных исследований, ТЕСЕ более эффективна, чем тонкоигольная аспирация, хотя в настоящее время нет достаточных оснований для рекомендации какого-либо одного хирургического метода лечения [16, 17, 23, 32].
В последнее десятилетие стали применять дополнительные неинвазивные методы исследования (такие, как цветное допплеровское сканирование) для предварительного выбора регионов яичек с более интенсивным кровоснабжением, где выявляется более активный сперматогенез у больных с НОА. Для определения успеха последующей ТЕСЕ C. Foresta и соавт. [33] проводили допплеровское картирование яичек у 55 пациентов с НОА без AZF-делеций и с нормальным кариотипом. Средний возраст пациентов колебался от 26 до 42 лет. Визуально яичко разделяли по вертикали на пять равных частей и биопсию начинали с области максимальной перфузии. Если не было обнаружено достаточного количества подвижных сперматозоидов, процедуру переносили на противоположное яичко. Процедура ТЕСЕ была проведена на 82 яичках в участках как с хорошим, так и с плохим кровоснабжением. Нахождение сперматозоидов составляло 38 и 14% соответственно (OR=3,55; />=0,001).
J. Har-Toov и соавт. [34] разработали метод выполнения УЗ-допплерографии в 7 ортогональных сечениях с последующей 3D-реконструкцией изображения яичек у 24 пациентов с НОА и вывели индекс васкуляризации (TVI) для участков, в которых с большой долей вероятности могли быть обнаружены сперматозоиды. Прогноз по TVI в 74,8% случаев оправдался. Положительный прогноз имел место в 72%, отрицательный — в 75,6% случаев, специфичность и чувствительность составили 89,8 и 47,3% соответственно. Энергетическая УЗ-допплерография яичка при НОА, а также TVI, по мнению авторов, являются надежными и информативными методами оценки очагов сперматогенеза, которые позволяют уменьшить степень повреждения ткани яичка и повысить вероятность получения жизнеспособных сперматозоидов для ИКСИ, но, однако, этот метод очень трудоемок.
По данным D. Jezek и соавт. ]35], при ТЕСЕ сперматозоиды могут быть обнаружены у 77% мужчин с НОА, причем с повышением уровня ФСГ в сыворотке вероятность нахождения сперматозоидов снижается, но даже при значительно повышенном уровне ФСГ сперматозоиды можно найти практически в 50% случаев.
Обнаружение сперматозоидов при НОА является ключевым этапом успешного лечения. В боль-
шинстве исследований успехом считалось обнаружение, по меньшей мере, одного сперматозоида. Там, где обнаруживали достаточное количество сперматозоидов, учитывали также их морфологию и подвижность [29]. Не менее важными показателями являются осложнения хирургического извлечения сперматозоидов. Однако для репродуктологов наступившие беременности в результате ИКСИ тести-кулярными сперматозоидами и рождение здоровых детей является более значимым результатом.
3. Прогноз получения сперматозоидов до операции
Отрицательное психологическое влияние безуспешной процедуры обнаружения сперматозоидов в яичках заставило многих исследователей выявлять прогностические факторы до оперативного вмешательства. Однако до сих пор классификация H. Levin [36], основанная только на предварительных гистологических данных, позволяла предвидеть лишь вероятность обнаружения сперматозоидов (чувствительность 86%, специфичность 93%), причем только при Сертоли-клеточном синдроме (СКС) (точность 0,83), но не при остановке созревания (точность 0,55) [37]. Другие факторы, ассоциированные с вероятностью обнаружения сперматозоидов, включают клинические параметры: возраст пациента при орхиопексии по поводу крипторхизма, перенесенный в анамнезе орхит, синдром Клайнфельтера, суммарный объем яичек (гипогонадизм), микроде-леции в AZF зоне Y-хромосомы и отсутствие сперматозоидов при диагностической биопсии яичек [26, 29, 38].
L. Tiepolo и соавт. [39] выявили de novo делеции длинного плеча Y-хромосомы у 6 мужчин с азооспермией. Авторы предположили существование локуса, ответственного за сперматогенез и назвали его AZF-регионом. В последующем P. Vogt и соавт. [40] определили три неперекрывающихся между собой субрегиона Y-хромосомы — AZFa, AZFb и AZF^
Микроделеции факторов азооспермии на длинном плече Y-хромосомы — наиболее часто встречающиеся генетические изменения при азооспермии и тяжелой форме олигозооспермии; они являются одной из главных причин мужского бесплодия. Частота встречаемости микроделеций AZF-региона у мужчин с бесплодием варьирует от 1,0 до 35,0%. При НОА такие микроделеции выявляются у 15—25% мужчин, при патозооспермии тяжелой степени — у 7—10%. Возможными причинами столь сильного расхождения могут быть разные критерии отбора пациентов, а также различное количество используемых маркеров для ДНК анализа. Наиболее часто микроделеции обнаруживаются в субрегионе AZFc — до 72%, в субрегионе AZFb — 15—16% случаев, в субрегионе AZFa — в 5—6%. Комбинация микроделе-ций во всех субрегионах встречается почти у 14— 17% пациентов. У подавляющего числа мужчин с микроделециями AZF-локуса верифицируется пер-
вичное бесплодие и в 80—85% — азооспермия. Клиническая картина может дополняться отсутствием одного яичка (монорхизм), неопущением одного или двух яичек [41, 42].
Наличие микроделеций в Y-хромосоме может являться прогностическим фактором успешности мультифокальной биопсии яичка. Так, R. Brandell и соавт. [43] в 1998 г. показали, что у мужчин с AZFb-делециями, в том числе при сочетании с AZFc- и AZFa-делеций, мультифокальная биопсия яичек не обнаруживала сперматозоиды ни в одном случае; в двух случаях были найдены круглые сперматиды, оплодотворение которыми в протоколах ЭКО-ИКСИ оказалось безуспешным. В биоптатах у этих пациентов определялась остановка сперматогенеза (ОС) и СКС. Напротив, при наличии у мужчин с азооспермией только AZFc-делеций были получены сперматозоиды, которые успешно использовались для ИКСИ. Гистологически в биоптатах у этих пациентов определялся гипосперматогенез. Таким образом, предварительное (до биопсии) определение де-леций в AZF-регионах Y-хромосомы позволяет прогнозировать результативность биопсии яичка.
До сих пор не найдено клинических и/или гормональных различий между пациентами с AZF-микроделециями и без них. C. Foresta и соавт. [44] предположили, что AZF-микроделеции, влияя на зародышевые клетки герминального эпителия семенных канальцев, не изменяют функцию клеток Сертоли. Обследовали 102 бесплодных пациентов, 27 из которых были с Yq-микроделециями, а 75 — с идиопатическим бесплодием. У пациентов с Yq-микроделециями был более низкий уровень ФСГ и более высокие концентрации ингибина В в плазме, чем у пациентов без микроделеций. Более того, пациенты c делециями, затрагивающими специфические гены половых клеток, обладали более высокой концентрацией ингибина В, чем пациенты с деле-циями всех экспрессируемых генов. Таким образом, те или иные изменения половых клеток только частично влияют на функцию клеток Сертоли. Гормональный статус мужчин без микроделеций свидетельствует о том, что в таких случаях причина, которая вызвала дефект сперматогенеза, могла также повредить и клетки Сертоли. Продукция ингибина В у пациентов с Yq-делециями была примерно на 70% выше, чем у пациентов без делеций, при этом функциональная взаимосвязь между уровнями ФСГ и ингибином В была сохранена. Это исследование проливает свет на многофакторные механизмы, лежащие в основе дефектов сперматогенеза, где клетки Сертоли могут функционировать нормально или быть повреждены в зависимости от основной причины, определявшей первичное повреждение ткани яичек.
Поскольку пациентам с Y-микроделециями в подавляющем большинстве случаев требуется лече-
ние методом ИКСИ, вопрос о том, какой тип ми-кроделеции имеет наибольшую прогностическую ценность в отношении наличия сперматозоидов в эякуляте и/или в ткани яичка, представляется наиболее важным. До сих пор соотношение генотип-фенотип остается неясным: аналогичные изменения яичек могут быть вызваны различными типами микроделеций, а идентичные микроделеции могут вызывать различные повреждения семенных канальцев. Даже для мужчин с азооспермией локализации микроделеций не могут быть использованы в качестве определяющего прогностического параметра до микроТЕСЕ—ИКСИ. Абсолютно отрицательное прогностическое значение имеют только делеции всего комплекса AZFa,b^, который неизменно связан с отсутствием сперматозоидов. Ми-кроделеции в зонах AZFa или AZFb, вероятно, имеют перспективное прогностическое значение, но для проверки этого необходимы дальнейшие исследования [45].
Три AZF локуса Y-хромосомы представляют собой геномную нишу для генов сперматогенеза. По мнению P. Navarro-Costa и соавт. [46], наиболее дистальная область длинного плеча Y-хромосомы — AZFc локус — является основным генератором крупных изменений и одним из наиболее динамично развивающихся регионов человеческого генома. Внутрихромосомный механизм гомологичной рекомбинации является основным драйвером для AZFc генетического разнообразия. В частности, перестановки, влияющие на часть генов, наиболее вероятно могут привести к появлению фенотипиче-ских проявлений нарушенного сперматогенеза. Некоторые перестановки представляют собой фактор риска или являются причиной нарушения сперматогенеза. Обнаружение различных подтипов этих делеций имеет значение для прогнозирования потенциального успеха извлечения сперматозоидов из ткани яичек. H. Sadeghi-Nejad и соавт. [45] проанализировали в общей сложности 78 статей по НОА в сочетании с AZF-делециями и пришли к выводу, что мужчины с азооспермией и AZFc-делециями могут иметь сперматозоиды, извлекаемые из ткани яичек при микроТЕСЕ и используемые для интра-цитоплазматической инъекции в программах ЭКО. Тем не менее они будут передавать эти делеции своему мужскому потомству [46].
В литературе имеются противоречивые данные о связи между азооспермией пациентов с синдромом Клайнфельтера (СК) и полиморфизмом AZF-фактора. L. Hadjkacem-Loukil и соавт. [47] обследовали 29 пациентов с азооспермией и 13 фертильных мужчин. Классические микроделеции были обнаружены у 6 из 9 пациентов с СК (67%). Делеции Gr/Gr и b2/b3 являются частичными делециями AZFc-региона. Один пациент с СК без классических ми-кроделеций имел Gr/Gr делецию. Такие делеции
были выявлены и у 4 из 18 пациентов с азооспермией без хромосомных аномалий. Кроме того, две Ь2/ Ь3 и одна AZFc-делеция были определены в этой группе. Все пациенты с СК имели повышенный уровень ФСГ и ЛГ в плазме, но нормальную концентрацию тестостерона. При биопсии яичек с ми-кроделециями Y-хромосомы был обнаружен СКС. В группе фертильных мужчин не были выявлены ни микроделеции Y-хромосомы, ни частичные AZFc-делеции. Сделан вывод, что популяция пациентов с СК может включать пациентов с Y-микроделецими, и скрининг на данные делеции должен быть частью диагностики, особенно в случаях, связанных с вспомогательными репродуктивными технологиями. По мнению J. Choe и соавт. [48], рутинный скрининг классических AZF-делеций у пациентов с СК не является необходимым. Авторы нашли, что классическая AZF-делеция у пациентов с кариотипом 47,XXY не играет роли в генетической предрасположенности к СК. Обследовали 95 пациентов с СК и азооспермией, среди которых 91 пациент имел чистую форму СК (47,XXY), остальные 4 мужчин были мозаиками (47,XXY/46,XY). Для определения наличия микроделеций Y-хромосомы (sY84, sY129, sY134, sY254, sY255) использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Микроделеции Y-хромо-сомы не были обнаружены ни у одного из 95 пациентов с СК, или у 93 обследованных фертильных мужчин. Уровень ФСГ у пациентов с СК был выше, чем у фертильных мужчин (38,2±10,3 мМЕ/мл против 5,4±2,9 мМЕ/мл, _р<0,001), а уровень тестостерона — ниже (1,7±0,3 нг/мл против 4,3±1,3 нг/мл, ^<0,001). Дальнейшие исследования, включающие анализ частичных AZFc-делеций (например, gr/gr или Ь2/Ь3), необходимы для уточнения механизма, лежащего в основе тяжелых нарушений сперматогенеза у пациентов с СК.
Анализ делеций Y-хромосомы чаще используют для генетического консультирования, а их результаты не рассматривают как имеющие прогностическую значимость. Анализ микроделеций типа AZFa, AZFb или AZFс был предложен в качестве потенциального прогностического исследования в отношении получения сперматозоидов у мужчин, проходящих лечение методом микроТЕСЕ. Делеции AZFc (и частично AZFb) связаны с успешным обнаружением сперматозоидов примерно в 50% случаев, а в случае наличия у пациента полной делеции AZFb вероятность нахождения зрелых сперматозоидов практически равна нулю. Прогностическое значение делеций в AZF-зоне Y-хромосомы в случаях тяжелой олигозооспермии также имеет большое клиническое значение, если учесть тот факт, что прогрессивное снижение числа сперматозоидов у мужчин с AZFc-делециями может приводить к азооспермии. В этих случаях заранее проведенная крио-консервация сперматозоидов позволит в будущем
избежать применения таких инвазивных методов, как микроТЕСЕ—ИКСИ [38].
Генетические аномалии, включая частичные делеции Y-хромосомы, обычно выявляются у мужчин с НОА. Недавние исследования показали, что наличие делеций в AZFc-регионе, по всей видимости, не влияют на вероятность получения сперматозоидов и не оказывают существенного влияния на оплодотворение и наступление беременности. R. ВгапёеП и соавт. [43] выяснили влияние частичных делеций Y-хромосомы на вероятность получения сперматозоидов с помощью микроТЕСЕ. Было проведено 80 попыток микроТЕСЕ у пациентов, которые имели частичные микроделеции. Из 80 мужчин у 9 (11%) были выявлены частичные делеции Y-хромосомы. У 2 пациентов с азооспермией и AZFc-делецией сперматозоиды были извлечены, и после ИКСИ наступали клинические беременности. У 7 мужчин имелись делеции, включающие AZFb-регион (3 мужчин имели изолированные AZFb-делеции, 1 — AZFa-, AZFb- и AZFc-делеции, а 3 — AZFb- и AZFc-делеции). Ни у одного из них сперматозоиды не были получены при помощи микроТЕСЕ; этот результат существенно отличался от общего числа получения сперматозоидов: 64% (47/73) (р=0,001). Таким образом, можно предположить, что присутствие AZFb-делеций является неблагоприятным прогностическим фактором для микроТЕСЕ. Мужчины с AZFb-делециями должны знать об этом, прежде чем будут соглашаться на ми-кроТЕСЕ—ИКСИ. Такие варианты, как оплодотворение спермой донора, усыновление или откладывание лечения до улучшения результатов, также должны рассматриваться в качестве альтернативы.
4. Применение метода микроТЕСЕ у мужчин с синдромом Клайнфельтера
СК представляет собой наиболее часто встречающуюся форму мужского гипергонадотропного ги-погонадизма. Этот синдром диагностируется у 10— 12% мужчин с азооспермией. Распространенность СК колеблется от 1/500 до 1/1000 в общей мужской популяции и возрастает до 3—4% среди бесплодных мужчин. По данным австралийских авторов [49— 51], распространенность СК составляет 223 на 100 000 мужчин, причем около 50% случаев остаются без верификации. Таким образом, можно предположить, что СК встречается значительно чаще, чем считалось ранее, и этот факт подчеркивает необходимость своевременной диагностики данной патологии. Спектр фенотипов взрослых пациентов с СК очень широк и колеблется от явного гипогонадизма до нормально вирилизированных мужчин. Из-за отсутствия явных симптомов заболевания только у 10% пациентов диагноз устанавливается в препубер-татном периоде.
Заболевание связано с врожденным нерасхождением хромосом и преобладанием нарушений на
ранних стадиях мейотического деления оогенеза (в 2/3 случаев), либо сперматогенеза (в '/3 случаев). В результате генотип 47,XXY имеют большинство пациентов. Однако от 3 до 20% мужчин с СК являются мозаиками 46,XX/47,XXY. Если при таком варианте патологии репродуктивная функция сохранена, то необходимо помнить, что частота сперматозоидов с дисомией половых хромосом (XX и XY) на порядок превышает долю анеуплоидных по половым хромосомам сперматозоидов в образцах эякулята пациентов с нормальным кариотипом 46,XY. При FISH-анализе сперматид и сперматозоидов частота дисомных гамет существенно выше, чем в контрольной группе (8,09% против 0,11%) [52—54].
Обычно СК клинически проявляется лишь после полового созревания. Из-за изменчивости фенотипа, а также выявления основных симптомов (андрогенной недостаточности, бесплодия) лишь в репродуктивном возрасте СК диагностируется относительно поздно. Часто диагноз устанавливают только при обращении супружеской пары для оценки фертильности в связи с отсутствием беременности. Почти постоянным клиническим проявлением СК при немозаичной (полной) форме являются уменьшенные и плотные яички и азооспермия, а в некоторых случаях — криптозооспермия (единичные сперматозоиды в осадке после отмывки и центрифугирования эякулята) и/или андрогенная недостаточность. Низкий или нормальный уровень тестостерона и высокий уровень ЛГ и ФСГ свидетельствуют о том, что все пациенты с СК нуждаются в компенсации гипогонадизма и назначения медикаментозной терапии с перипубертатного возраста [54].
Раньше мужчин с немозаичной формой СК (47,XXY) считали абсолютно бесплодными. При гистологическом исследовании ткани яичек у них определяются обширные поля клеток Лейдига и ги-алинизированные, а в некоторых случаях и склеро-зированные семенные канальцы с редкими очагами незаконченного сперматогенеза. Появление современных вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) обусловило возможность лечения бесплодия у этой группы пациентов [55].
В 1998 г. впервые появились сообщения о нескольких случаях успешного лечения бесплодия у мужчин с немозаичной формой СК. За последние 15 лет зарегистрировано более 100 детей с нормальным кариотипом, рожденных от мужчин с СК [56—58].
В работе J. Schiff и соавт. [56] описаны результаты 54 процедур микроТЕСЕ у 42 мужчин с СК. Средний возраст пациентов на момент операции составлял 32,8 года. Средний возраст партнерш был 33,2 года. Средний объем яичек мужчин с СК — 2,5 мл с каждой стороны. Средние уровни ФСГ и тестостерона — соответственно 33,2 МЕ/л (норма 1,0—8,0 МЕ/л) и 9,8 нмоль/л (норма 8,2—27,2 нмоль/л). Все
пациенты с уровнем тестостерона в сыворотке менее 15,6 нмоль/л первоначально получали гормональное лечение: 19 пациентов принимали только тестолактон (50—100 мг перорально 2 раза в день), 13 — получали тестолактон (50—100 мг перорально 2 раза в день) в сочетании с инъекциями чХГ (1500 МЕ внутримышечно 2 раза в неделю). Ингибитор ароматазы (анастрозол 1 мг/сут) получали 5 мужчин, а в сочетании с чХГ — 1 пациент; кломифен цитрат (25 мг/сут) получали 3 пациента, 1 пациенту проводилось лечение рФСГ в течение 6 мес до микроТЕСЕ. У всех пациентов, получавших анастро-зол и кломифен цитрат, были выделены пригодные для дальнейшей работы сперматозоиды. У пациентов, принимавших один тестолактон или тестолак-тон с чХГ, сперматозоиды были получены у 74 и 54% соответственно. Следует отметить, что из 6 мужчин с нормальным уровнем тестостерона гаметы были получены только у 4. После лечения уровень тестостерона составлял 17,0 нмоль/л (р<0,001). Сперматозоиды, пригодные для ИКСИ, были получены во время 39 (72,2%) из 54 процедур микроТЕСЕ и у 29 (69,0%) из 42 мужчин в день пункции фолликулов (или на день раньше) у партнерши. Из 39 циклов ЭКО переносы эмбрионов (ПЭ) были осуществлены в 33. Наступило 18 клинических беременностей и родился 21 живой ребенок с нормальным кариоти-пом. Ни одной беременности не было достигнуто в последующих программах ЭКО с применением размороженных тестикулярных сперматозоидов. Таким образом, генетический риск для потомства пациентов с СК не превышает таковой для потомства с НОА и нормальным кариотипом [59].
К 2009 г. та же группа исследователей провела в общей сложности 91 процедуру микроТЕСЕ у 68 мужчин с немозаичной формой СК на фоне различных видов предоперационной гормональной подготовки. Успешно получены сперматозоиды у 45 (66,0%) пациентов. Было высказано предположение о том, что увеличение возраста и отсутствие эффекта предоперационной терапии являются плохими прогностическими факторами в отношении получения качественных сперматозоидов. После проведенной терапии у мужчин с уровнем тестостерона >250 нг/дл (>8,7 нмоль/л) вероятность получения сперматозоидов, процент оплодотворения и наступления клинической беременности были выше, чем у мужчин с уровнем тестостерона <250 нг/дл [60]. I. Маё§аг и соавт. [61] исследовали 21 пациента с немозаичной формой СК. Сперматозоиды были обнаружены у 9 (45%) пациентов. Средний объем яичек составлял 7,8±2,5 мл (что представляется большим объемом для СК) у мужчин с положительным результатом микроТЕСЕ и 5,6±1,2 мл у пациентов с отрицательным результатом; соответствующие уровни тестостерона были 3,5±1,2 (12,2±4,2 нмоль/л) и 1,7±0,8 нг/мл (5,9±2,8 нмоль/л). Уровни ФСГ и ЛГ в сыворотке су-
щественно не различались между группами. После теста с чХГ средний уровень тестостерона в сыворотке составил 16,0±6,3 нг/мл (55,6±21,8 нмоль/л) у мужчин, у которых были получены сперматозоиды, и 6,7±5,6 нг/мл (23,7±19,4 нмоль/л) у тех, у которых сперматозоиды получены не были.
М. МаШищ и соавт. [62] провели анкетирование голландских мужчин с СК и их партнерш, а также родителей мужчин до 18 лет и показали, что большинство из них (90%) и их партнерш (74%) хотят иметь детей и позитивно относятся к микроТЕСЕ в программе ИКСИ. Аргументами против микроТЕСЕ является возможный риск врожденных пороков развития или задержка развития ребенка.
Таким образом, процедура микроТЕСЕ — эффективный метод получения сперматозоидов у мужчин с СК. Мужчины с гипергонадотропным гипого-надизмом, которые реагируют на гормональную терапию, возможно, имеют больше шансов на благоприятный исход лечения бесплодия. Объем яичек, уровень тестостерона и результаты теста с чХГ являются важными прогностическими факторами у данной группы пациентов. У пациентов, участвующих в программе микроТЕСЕ—ИКСИ, повышается уровень самооценки, что благоприятно влияет на психологический комфорт супружеской пары.
5. Гистологическая классификация
Согласно современным рекомендациям, НОА диагностируется только на основании гистологического анализа, поскольку клинические и эндокринные параметры не всегда позволяют точно разграничить ОА и НОА [10, 12, 63—65]. Это очень важно, поскольку без предварительного отбора пациентов гистологически сперматозоиды можно обнаружить практически во всех случаях ОА, но только в 50% случаев НОА [12].
В последнее время подчеркивается важность унификации критериев патологии биоптатов яичек и в 2007 г. была предложена новая классификация:
1) нормальный тестикулярный биоптат — только в случаях полного сперматогенеза во всех био-псийных образцах и нормальной ткани семенных канальцев;
2) гипосперматогенез — все этапы сперматогенеза присутствуют, но выражены в той или иной степени. Это определение также включает в себя ситуации, когда в отдельных канальцах присутствуют только клетки Сертоли. Наличие всех этапов спер-
матогенеза до стадии сперматид второго порядка (Sd2) указывает на способность яичек вырабатывать сперматозоиды;
3) остановка развития зародышевых клеток — остановка развития на определенном этапе, чаще всего на стадии сперматогониев или первичных сперматоцитов. Остановка сперматогенеза встеча-ется редко. Если хотя бы небольшое количество сперматид визуализируется в одном из семенных канальцев, а остальные канальцы содержат только сперматоциты, диагноз «Остановка развития зародышевых клеток» не должен использоваться; ситуация должна быть классифицирована как выраженный (тяжелый) гипосперматогенез;
4) Сертоли-клеточный синдром — этот термин используется только при отсутствии канальцев, содержащих половые клетки.
5) гиалинизация семенных канальцев — канальцы без половых клеток и клеток Сертоли. Обычно сопровождается перитубулярным фиброзом и накоплением вещества базальной мембраны в перитубу-лярном пространстве;
6) карцинома in situ — этот термин используется при наличии преинвазивных злокачественных клеток карциномы in situ, которые обычно присутствуют в том месте, где находятся сперматогонии. В типичном биоптате взрослого мужчины, только клетки Сертоли присутствуют в канальцах с карциномой in situ, но иногда клетки карциномы in situ обнаруживаются и в канальцах с протекающим сперматогенезом;
7) незрелые яички — редкая патология у взрослых мужчин, страдающих бесплодием, но типичная для гипогонадотропного гипогонадизма. Эпителий семенных канальцев содержит незрелые клетки Сертоли и половые клетки (обычно гоноциты или сперматогонии), в канальцах отсутствует просвет, между канальцами нет или очень мало клеток Лей-дига.
Такая классификация позволяет точно сравнивать результаты разных исследований, но создает определенную трудность при анализе уже имеющихся данных [63].
Конфликт интересов — авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Willott G.M. Frequency of azoospermia. Forensic Sci Int 1982; 20: 9—10.
2. Jarow J.P., Espeland M.A., Lipshultz L.I. Evaluation of the azoospermic patients. J Urol 1989; 142: 62.
3. Черньа В.Б. Ген муковисцидоза и нарушение фертильности у мужчин. Андрол и генитал хир 2010; 4: 23—31.
4. Palermo G.D., JorisK.,DevroeyP., VanSteirteghemA.C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet 1992; 340: 17—18.
5. Van Steirteghem A.C., Nagy Z., Joris H., Liu J., Staessen C., Smitz J., Wisanto A., Devroey P. Higher fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1993; 8: 1061—1066.
6. Temple-Smith P.D., Southwick G.J., Yates C.A., Trounson A.O., de Kretser D.M. Human pregnancy by in vitro fertilization (IVF) using sperm aspirated from the epididymis. J In Vitro Fert Embryo Transf 1985; 2: 119—122.
7. Craft I., Benett V., Nicholson N. Fertilising ability of testicular spermatozoa (Letter). Lancet 1993; 342: 864.
8. Schoysman R., Vanderzwalmen P., NijsM., SegalL., Segal-Bertin G., Geerts I., Roosendaal E., Schoysman D. Pregnancy after fertilisation with human testicular spermatozoa. Lancet 1993; 342: 1237.
9. Devroey P., Liu J., Nagy Z., Tournaye H., Silber S.J., Van Steirteghem A.C. Normal fertilization of human oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 1994; 62: 639—641.
10. Devroey P., Liu J., Nagy Z., Goossens A., Tournaye H., Camus M., Van Steirteghem A., Silber S. Pregnancies after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in nonobstructive azoospermia. Hum Reprod 1995; 10: 6: 1457—1460.
11. Tournaye H., Camus M., Goosens A., Nagy Z., Silber S., Van Steirteghem A.C., Devroey P. Recent concepts in the management of infertility because of non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1995; 10: Suppl 1: 115—119.
12. Tournaye H., Camus M., Vandervorst M., Nagy Z., Joris H., Van Steirteghem A., Devroey P. Surgical sperm retrieval for intracytoplasmic sperm injection. Int J Androl 1997; 20: Suppl 3: 69—73.
13. Tournaye H., Liu J., Nagy P.Z., Camus M., Goossens A., Silber S., Van Steirteghem A.C., Devroey P. Correlation between testicular histology and outcome after intracytoplasmic sperm injection using testicular spermatozoa. Hum Reprod 1996; 11: 127—132.
14. Schlegel P.N., Su L.M. Physiological consequences of testicular sperm extraction. Hum Reprod 1997; 12: 1688—1692.
15. Meniru G.I., Gorgy A., Podsiadly B.T., Craft I.L. Results of percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in two major groups of patients with obstructive azoospermia. Hum Reprod 1997; 12: 11: 2443—2446.
16. Friedler S., Raziel A., Strassburger D., Soffer Y., Komarovsky D., Ron-El R. Testicular sperm retrieval by percutaneous fine needle sperm aspiration compared with testicular sperm extraction by open biopsy in men with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1997; 12: 1488—1493.
17. Rosenlund B., Kvist U., Ploen L., Lundh Rozell B., Sjoblom P., Hillensjo T. A comparison between open and percutaneous needle biopsies in men with azoospermia. Hum Reprod 1998; 13: 1266— 1271.
18. Hauser R., Botchan A., Amit A., Ben Yosef D., Gamzu R., Paz G., Lessing J.B., Yogev L., Yavtz H. Multiple testicular sampling in non-obstructive azoospermia-is it necessary? Hum Reprod 1998; 13: 3081—3085.
19. Schlegel P.N. Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod 1999; 14: 131—135.
20. Jarow J.P., Espeland M.A., Lipshultz L.I. Evaluation of the azoospermic patients. J Urol 1989; 142: 62.
21. Matsumiya K., Namiki M., Takahara S., Kondoh N., Takada S., Kiyohara H., Okuyama A. Clinical study of azoospermia. Int J Androl 1994; 17: 3: 140—142.
22. Palermo G.D., Schlegel P.N., Hariprashad J.J., Ergun B., Mielnik A., Zaninovic N., Veeck L.L., Rosenwaks Z. Fertilization and pregnancy outcome with intracytoplasmic sperm injection for azoospermic men. Hum Reprod 1999; 14: 741—748.
23. Ezeh U.I., Moore H.D.M., Cooke I.D. A prospective study of multiple needle biopsies versus a single open biopsy for testicular sperm extraction in en with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 1998; 13: 2075—2080.
24. Raman J.D., Schlegel P. Testicular sperm extraction with intracytoplasmic sperm injection is successful for the treatment
of nonobstructive azoospermia associated with cryptorchidism. J Urol 2003; 170: 1287—1290.
25. Silber S.J., Rodriguez-Rigau L.J. Quantitative analysis of testicle biopsy: determination of partial obstruction and prediction of sperm count after surgery for obstruction. Fertil Steril 1981; 36: 4: 480—485.
26. Silber S.,Nagy Z., Devroey P., Tournaye H., Van Steirteghem A.C. Distribution of spermatogenesis in the testicles of azoospermic men: the presence or abscence of spermatids in the testes of men with germinal failure. Hum Reprod 1997; 12: 2422—2428.
27. Silber S.J. Microsurgical TESE and the distribution of spermatogenesis in non-obstructive azoospermia. Hum Reprod 2000; 15: 11: 2278—2284.
28. Silber S. What forms of male infertility are left to cure? Hum Reprod 1995; 10: 503.
29. Gil-Salom M., Romero J., Minguez Y., Molero M.D., Remohi J., Pellicer A. Testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection: A chance of fertility in nonobstructive azoospermia. J Urol 1998; 160: 2063—2067.
30. Tash J.A., Schlegel P.N. Histologic effects of testicular sperm extraction on the testicle in men with nonobstructive azoospermia. J Urology 2001; 57: 334—337.
31. Schlegel P.N., Su L.M. Physiological consequences of testicular sperm extraction. Hum Reprod 1997; 12: 1688—1692.
32. Van Peperstraten A., Proctor M.L., Johnson N.P., Philipson G. Techniques for surgical retrieval of sperm prior to ICSI for azoospermia. Cochrane Database Syst Rev 2006; 19: 3: CD002807.
33. Foresta C., Garolla A., Betella A., Ferlin A., Rossato M., Candiani F. Doppler ultrasound of the testis in azoospermic subjects as a parameter of testicular function. Hum Reprod 1998; 13: 3090— 3093.
34. Har-Toov J., Eytan O., Hauser R., Yavetz H., Elad D., Jaffa A.J. A new power doppler ultrasound guiding technique for improved testicular sperm extraction. Fertil Steril 2004; 81: 430—434.
35. Jezek D., Knuth U.A., Schulze W. Successful testicular sperm extraction (TESE) in spite of high serum follicle stimulating hormone and azoospermia: correlation between testicular morphology, TESE results, semen analysis and serum hormone values in 103 infertile men. Hum Reprod 1998; 13: 5: 1230—1234.
36. Levin H.S. Testicular biopsy in the study of male infertility. Hum Pathol 1979; 10: 569—584.
37. Tournaye H., Verheyen G., Nagy P., Ubaldi F., Goosens A., Silber S., Van Steirteghem A.C., Devroey P. Are there any predictive factors for successful testicular sperm recovery in azoospermic patients? Hum Reprod 1997; 12: 80—86.
38. Krausz C., Quinatana-Murci L., Mcelreavey K. Prognostic value of Y deletion analysis: What is the clinical prognostic value of Y chromosome microdeletion analysis? Hum Reprod 2000; 15: 1431—1434.
39. Tiepolo L., Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet 1976; 34: 2: 119—124.
40. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S., Henegariu O. Hirschmann P., Kiesewetter F., Kohn F.M., Schill W.B., Farah S., Ramos C., Hartmann M., Hartschuh W., Meschede D., Behre H.M., Castel A., Nieschlag E., Weidner W., Grone H.J., Jung A., Engel W., Haidl G. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet 1996; 5: 7: 933—943.
41. Черных В.Б. Микроделеционный анализ AZF-локуса в рамках комплексного клинико-генетического обследования мужчин с азооспермией и олигоспермией: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М 2002; 25.
42. Fu L., Ding X., Shen M., Li C., Nie S., Quan Q. Screening and clinical phenotype analysis of microdeletions of azoospermia factor region on Y chromosome in 1011 infertile men. Hum Reprod 2012; 29: 2: 184—187.
43. Brandell R.A., Mielnik A., Liotta D., Ye Z., Veeck L.L., Palermo G.D., Schlegel P.N. AZFb deletions predict the absence of spermatozoa with testicular sperm extraction: preliminary report of a prognostic genetic test. Hum Reprod 1998; 13: 2812—2815.
44. Foresta C., Moro E., Ferlin A. Prognostic value of Y deletion analysis. The role of current methods. Hum Reprod 2001; 16: 8: 1543—1547.
45. Sadeghi-Nejad H., Farrokhi F. Genetics of azoospermia: current knowledge, clinical implications, and future directions. Part II: Y chromosome microdeletions. J Urol 2007; 4: 4: 192—206.
46. Navarro-Costa P., Gongalves J., Plancha C.E. The AZFc region of the Y chromosome: at the crossroads between genetic diversity and male infertility. Hum Reprod Update 2010; 16: 5: 525—542.
47. Hadjkacem-Loukil L., Ghorbel M., Bahloul A., Ayadi H., Ammar-Keskes L. Genetic association between AZF region polymorphism and Klinefelter syndrome. Reprod Biomed Online 2009; 19: 4: 547—551.
48. Choe J.H., Kim J.W., Lee J.S., Seo J.T. Routine screening for classical azoospermia factor deletions of the Y chromosome in azoospermic patients with Klinefelter syndrome. Asian J Androl 2007; 9: 6: 815—820.
49. Козлова С.И., Демикова Н.С., Семанова Е., Блинникова О.Е. В кн.: Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. М 1996; 305.
50. Herlihy A.S., Halliday J.L., Cock M.L., McLachlan R.I. The prevalence and diagnosis rates of Klinefelter syndrome: an Australian comparison. Med J Aust 2011; 194: 1: 24—28.
51. Forti G., Corona G., Vignozzi L., Krausz C., Maggi M. Klinefelter's syndrome: a clinical and therapeutical update. Sex Dev 2010; 4: 4—5: 249—258.
52. Abdelmoula N.B., Amouri A., PortnoiM.F., SaadA., Boudawara T., Mhiri M.N., Bahloul A., Rebai T. Cytogenetics and fluorescence in situ hybridization assessment of sex-chromosome mosaicism in Klinefelter's syndrome. Ann Genet 2004; 47: 2: 163—175.
53. Андрология. Мужское здоровье и дисфункция репродуктивной системы. Под ред. Э. Нишлага, Г.М. Бере. М: МИА 2005; 185—187.
54. Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. М: Издательство Н-Л 2007; 199.
55. Джонс К. Наследственные синдромы по Дэвиду Смиту: атлас-справочник. Пер. с англ. А.Г. Азова, И.А. Ивановой, А.В. Мишарина и др. М: Изд-во Практика 2011; 70—72.
56. Schiff J.D., Palermo G.D., Veeck L.L., Goldstein M., Rosenwaks Z., Schlegel P.N. Success of testicular sperm extraction [corrected] and intracytoplasmic sperm injection in men with Klinefelter syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 11: 6263—6267.
57. Poulakis V., Witzsch U., Diehl W., de Vries R., Becht E., Trotnow S. Birth of two infants with normal karyotype after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from two men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. Fertil Steril 2001; 76: 1060—1062.
58. Friedler S., RazielA., StrassburgerD., SchachterM., Bern O., Ron-El R. Outcome of ICSI using fresh and cryopreserved-thawed testicular spermatozoa in patients with non-mosaic Klinefelter's syndrome. Hum Reprod 2001; 16: 2616—2620.
59. Nodar F., De Vincentiis S., Olmedo S.B., Papier S., Urrutia F., Acosta A. Birth of twin males with normal karyotype after intracytoplasmic sperm injection with use of testicular spermatozoa for a nonmosaic patient with Klinefelter's syndrome. Fertil Steril 1999; 71: 1149—1152.
60. Ramasamy R., Ricci J.A., Palermo G.D., Gosden L.V., Rosenwaks Z., Schlegel P.N. Successful fertility treatment for Klinefelter's syndrome. J Urol 2009; 182: 3: 1108—1113.
61. Madgar I., Dor J., Weissenberg R., Raviv G., Menashe Y., Levron J. Prognostic value of the clinical and laboratory evaluation in patients with nonmosaic Klinefelter syndrome who are receiving assisted reproductive therapy. Fertil Steril 2002; 77: 6: 1167— 1169.
62. Maiburg M.C., Hoppenbrouwers A.C., van Stel H.F., Giltay J.C. Attitudes of Klinefelter men and their relatives towards TESE-ICSI. J Ass Reprod Genet 2011; 28: 9: 809—814.
63. McLachlan R.I., Rajpert-De Meyts E., Hoei-Hansen C.E., de Kretser D.M., Skakkebaek N.E. Histological evaluation of the human testis-approaches to optimizing the clinical value of the assessment: mini review. Hum Reprod 2007; 22: 2—16.
64. Tournaye H. Gamete source and manipulation. In: Current Practices and Controversies in Assisted Reproduction. Eds. E. Vayena, P.J. Rowe, P. David, P.D. Griffin. Oxford: University Press 2002.
65. Schoor R.A., Elhanbly S., Niederberger C.S., Ross L.S. The role of testicular biopsy in the modern management of male infertility. J Urol 2002; 167: 197—200.
