CC BY
127
Химические науки
Пестовский Ю. С.
ведущий специалист ООО «Эколит», г. Москва
Использование наночастиц золота для определения приона
Пестовский Ю. С.
Открытие прионов тесно связано с открытием и становлением учения о медленных инфекциях, в особенности для тех, которые вызывались «необычными вирусами» [1]. В начале 80-х гг. ХХ-го века эти нечеткие определения были конкретизированы и уточнены, что целиком и полностью связано с успехами в расшифровке природы возбудителей. Американский биохимик S. Prusiner, используя новые подходы к накоплению и очистке инфекционного начала в мозговой ткани зараженных агентом скрепи хомяков, показал, что возбудителем наиболее распространенной в природе трансмиссионной губчатой энцефалопатии — скрепи (заболевание, которое в природе встречается среди овец и коз) является безнуклеи-новый низкомолекулярный (27-30 кДа) сиалогликопро-теин. S. Prusiner предложил для инфекционной единицы наименование «прион». Термин образован от англ. «Proteinacius Infection» [2].
Прион существует в двух формах. Его нормальная, клеточная форма, обозначающаяся как PrPC (от англ. Prion Protein of Cell), обнаруживается в организме всех млекопитающих, включая человека. Кроме того, совершенно неожиданно прионоподобные механизмы были выявлены у иных организмов — у дрожжей Saccharomyces cerevisiae [3] и мицелиального гриба Podospora [4]. Открытие прионов у низших эукариот говорит о том, что эти белки — общебиологическое явление, а не экзотический случай.
Белок PrPC играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма: он участвует в передаче нервных импульсов и, самое главное, определяет поддержание так называемых «циркадианных» ритмов (от лат. cirka — около и dies — день), регулируя суточные циклы активности и покоя в клетках, органах и в организме в целом [1].
В организме людей и животных, страдающих прионны-ми заболеваниями, прионный белок обнаруживается в другой форме, обозначаемой как PrPSc. Подобная аббревиатура обусловлена природным резервуаром инфекционной формы прионов — это овцы и козы с заболеванием «скрепи» (Scrapie) [5,6]. Точный механизм накопления приона в зараженном организме не известен, однако показано, что накопление происходит не в результате синтеза в зараженном организме молекул PrPSc de novo, а вследствие конформационных изменений уже синтезированных нормальных молекул PrPC под влиянием молекул PrPSc [7,8].
Процесс накопления инфекционного приона предусматривает прежде всего необходимость контакта двух молекул. В результате под влиянием одной молекулы PrPSc происходит трансформация контактирующей с ней одной молекулы PrPC в её инфекционную форму. Таким образом, всего в организме образуются две молекулы PrPSc. Следующий этап включает в себя уже влияние двух молекул PrPSc, под воздействием которых сразу образуются ещё две молекулы PrPSc и т.д. Таким образом, процесс накопления инфекционного приона носит лавинообразный характер. Для полной конверсии клеточного белка достаточно следового количества PrPSc («семена») в качестве затравки [9].
Патогенная изоформа PrPSc, богатая P-листами, обладает способностью к самопроизвольной полимеризации в высокоупорядоченные фибриллы, которые в свою очередь и повреждают таламические нейроны, запуская в них апоптоз. Амилоидные фибриллы, образованные патологической изоформой приона, накапливаясь в клет-
ках ЦНС в течение развития заболевания, вызывают увеличение количества астроцитов, истощение дендритов, формирование в коре мозжечка многочисленных вакуолей и амилоидоз. Лечение прионных болезней в настоящее время не разработано.
В целом проблема прионов — это поверхностная часть крупнейшей биологической проблемы. Уникальный механизм передачи конформации между молекулами одного белка представляет собой неизвестное ранее фундаментальное свойство белковых молекул. Скорее всего, в природе существует немало применений этому уникальному свойству...
Реактивы и материалы
В работе использовали реактив Эллмана Fluka (Германия), хлорид полидиметилдиаллиламмония Aldrich (США), полиэ-тиленгликоль-20000 Loba Chemie Fischamend (Германия), хромогенную смесь, содержащую 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), и субстратный буфер, содержащий пероксид водорода, производства ООО «ХимБиоТест» (Россия), твин-20 Aldrich (Германия), мочевину Biosolve (Нидерланды), соли и компоненты буферных растворов Merck (Германия), ICN (США), мембраны Immobilon™ фирмы Millipore (Франция), нитроцеллюлозу Millipore (Франция), алюминиевые тарелочки PerkinElmer (США). Все реактивы использовались без предварительной очистки. Все растворы готовились на воде, удельное сопротивление которой составляет 18.2 МОм/см, полученной с помощью системы очистки воды Milli-Q фирмы Millipore (США).
Методика
Измерения оптических плотностей проводили с использованием планшетного спектрофотометра с вертикальным ходом оптического луча ANTHOS HT1. Спектры поглощения получали на планшетном спектрофотометре Bio-Rad xMark.
Спектры комбинационного рассеяния получали на спектрометре innoRam фирмы B&WTek, Inc. Длина волны возбуждающего лазера (рис. 1) составляет 785 нм, диаметр луча 0.1 мм (собственные измерения). Измерения проводили при следующих параметрах: мощность лазера 10%, время накопления
1.5 с, усреднение по 10 спектрам. Перед получением каждого спектра вручную при времени накопления 1 с без усреднения настраивали резкость так, чтобы интенсивность максимума в спектре (в области 1325 — 1345 см-1), была наибольшей. В случае если интенсивность максимума была больше предельной для ПЗС-матрицы прибора, подбирали соответствующее время накопления; полученные данные нормировали на время накопления 1.5 с в предположении линейной зависимости интенсивности спектральных максимумов от времени накопления (правомерность такой нормировки доказана нами экспериментально). Обработку спектров осуществляли в программе GRAMS Research 3.01A Level II. Из найденных интенсивностей максимума вычитали уровень базовой линии, который находили вручную для каждого спектра.
Для получения конъюгата наночастиц золота с красителем, в качестве которого использовался реактив Эллмана, к 500 мкл раствора наночастиц диаметром 45 нм (pH 4.42), полученных цитратным способом, добавляли 1000 мкл насыщенного водного раствора данного реактива. Реакцию проводили при комнатной температуре в защищённом от света месте в течение 7 часов. Затем наночастицы отделяли центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 мин и ресуспендировали в 200 мкл воды.
785 нм
Рисунок 1. Проведение измерений методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния при использовании алюминиевых образцов.
Уравнение реакции имеет следующий вид:
02^ N02
2Аи+ '2
Для получения конъюгата наночастиц золота с антителами и красителем к аликвоте замороженного раствора антител к приону с концентрацией 2 мг/мл в 20 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, доведённой до комнатной температуры, добавляли 80 мкл карбонатного буферного раствора. 500 мкл раствора наночастиц с иммобилизованным красителем центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин. Наночастицы ресуспендировали в 488 мкл карбонатного буферного раствора (pH 9.08, 0.005 М, К+). К раствору наночастиц добавляли 12.5 мкл полученного раствора антител. Раствор перемешивали на мешалке БррепёогТ с частотой 1400 об/мин при комнатной температуре в течение 45 мин. К раствору добавляли 26.31 мкл 1% водного раствора полиэтиленгликоля. Раствор перемешивали с частотой 1400 об/мин при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин. Наночастицы ресуспендировали в 200 мкл раствора, состоящего из 190 мкл карбонатного буферного раствора и 10 мкл 1% водного раствора полиэтиленгликоля. Полученный раствор конъюгата хранили в холодильнике. Схема процесса приготовления конъюгатов проиллюстрирована на рис. 2. Оптическая плотность раствора в максимуме поглощения (532 — 534 нм) составляла 0.44.
✓ Лр
Рисунок 2. Получение конъюгатов наночастиц золота с реактивом Эллмана и антителами.
Сравнение спектров поглощения наночастиц с иммобилизованным реактивом Эллмана после перевода в карбонатный буферный раствор, после иммобилизации антител и после иммобилизации полиэтиленгликоля свидетельствует о смещении максимума поглощения в длинноволновую область, что свидетельствует об успешной иммобилизации всех рассматриваемых компонентов на поверхности наночастиц [10].
Для проверки возможности высокочувствительного определения полученных конъюгатов 2 мкл раствора, содержащего их в различных концентрациях, наносили на нитроцеллюлозу, и после высыхания растворов снимали спектры гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).
Для проведения иммуноанализа образец гидрофилизован-ной метанолом мембраны диаметром 3 см (диаметр рабочей части 1 см) закрепляли внутри воронки (рис. 3), снизу подключенной к вакуумному насосу, и последовательно выдерживали с прионом, с 5% раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере и с антителами против приона, конъюгированными с пероксидазой. Использовался 50 нг/мл раствор приона в 0.2 М ацетатном буфере (pH 4.41), содержащем 8 М мочевины. Длительность каждой стадии составляла 30 мин. Все растворы добавлялись в объеме 200 мкл. В начале каждой стадии проводили вакуумирование в течение менее 1 с. После стадии взаимодействия с прионом систему вакуумиро-вали до полного удаления его раствора. После стадии взаимодействия с бычьим сывороточным альбумином мембрану промывали РБ8Т (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0.2% твина-20) под вакуумом 1 раз, после стадии взаимодействия с антителами 3 раза. Для предотвращения испарения растворов воронку закрывали сверху. Используемые растворы антител готовили разбавлением фосфатно-солевым буферным раствором концентрированного раствора в глицерине. В контрольных экспериментах отсутствовала стадия взаимодействия с прионом.
После всех перечисленных стадий мембрану выдерживали в проявляющем растворе в течение 10 мин и затем промывали водой для остановки ферментативной реакции.
Для приготовления проявляющего раствора, используемого при проведении иммуноферментного анализа на мембране, смесь 30 мг тетрагидрохлорида 3,3'-диаминобензидина и 10 мг 4-хлорнафтола-1 растворяли в 5 мл этилового спирта, доводили объем до 50 мл добавлением фосфатно-солевого буферного раствора и добавляли 50 мкл 30% Н202. В полученный раствор погружали мембрану.
Реакции, протекающие при пероксидазном окислении указанных восстановителей, к настоящему времени не исследовались, известно только, что их конечным продуктом являются нерастворимые полимеры. На основе данных по окислению бензидина [11] и нафтола [12] можно предположить, что первой стадией является димеризация:
Н2№
пероксидаза
■ЫН2
I
Н,№
Н2ыы
Н2:ыы н2
При исследовании влияния обработки алюминия хлоридом полидиметилдиаллиламмония на его способность адсорбировать прион образцы обрабатывали 100 мкл 10.98 мг/мл водного раствора хлорида полидиметилдиаллиламмония в течение 10 мин и затем промывали водой, после чего адсорбировали прион.
После адсорбции приона образцы обрабатывали 5% раствором бычьего сывороточного альбумина и конъюгатом антител с пероксидазой. Условия эксперимента были теми же, какие использовались в методике для мембран, однако все растворы наносились в объеме 90 мкл. Промывка производилась путем многократного встряхивания образца, погруженного в РВ8Т В контрольных экспериментах отсутствовала стадия взаимодействия с прионом. Проявка осуществлялась путем 10-минутной выдержки в 100 мкл раствора, содержащего ТМБ, пероксид водорода и субстратный буфер. Затем была измерена оптическая плотность 30 мкл раствора, взятого с поверхности каждого образца, при 405 нм. При варьировании условий адсорбции приона на поверхность алюминия к 30 мкл проявляющего раствора добавлялось 30 мкл концентрированной соляной кислоты и измерялась оптическая плотность при 450 нм.
Пероксидазное окисление ТМБ протекает следующим образом:
Н3СС
Нз
Н2Ы
ын7
Н3С
пероксидаза
СН3 Н2О2
ОН-
Н3СС
Нз
Н2ы
Н3С
Н3С
СН3
рН < 1
СН3
ЫН:
'ЫН2
Н2ы
:ЫН2
Н3С
СН3
2
Н
Н2О2
Н
Н2-Ы
2
С1
пероксидаза
/ ч КЛ
Н2О2 Н2О
С1
При определении приона на поверхности алюминия (рис. 4) с использованием спектроскопии ГКР были проверены различные разведения конъюгата водой (в 2, 4, 8 раз, а также неразбавленный). Взаимодействие с прионом и бычьим сывороточным альбумином проводилось в течение 1 часа, с 50 мкл конъюгата — в течение 2 часов. Для разведения в 4 раза была также проверена продолжительность взаимодействия с конъюгатом 30 и 60 мин.
Рисунок 3. Лабораторная установка для проведения иммуноанализа на мембране.
Рисунок 4. Проведение иммуноанализа на поверхности алюминия.
Г» .
1
ПНІ 1
ЛИ 1 1
г 1 1 , Iі , і *1,1 1 л / \ 1
ЦІ ^ ' ~1
Рисунок 5. Спектры ГКР нитроцеллюлозы с нанесёнными конъюгатами (в области характеристического максимума - сверху); с нанесёнными немодифицированными наночастицами золота (снизу).
Результаты и обсуждение
Для проведения иммуноанализа на поверхность наночастиц золота, связанных с реактивом Эллмана, иммобилизовали антитела к приону. Для исследования стабильности наночастиц в условиях высокой ионной силы к 50 мкл раствора немодифицированных наночастиц, а также наночастиц, связанных с реактивом Эллмана и конъюгатов с антителами, содержащих и не содержащих полиэти-ленгликоля, добавили 50 мкл 1 M №0. Снимали спектры поглощения растворов до добавления соли и через 10 мин после добавления.
В условиях высокой ионной силы происходит резкое смещение максимума поглощения наночастиц, связанных с реактивом Эллмана, независимо от того, связаны ли они с антителами и полиэтиленгликолем, в длинноволновую область, что свидетельствует об агрегации наночастиц. Таким образом, дестабилизирующее влияние реактива Эллмана не компенсируется наличием антител и даже большого избытка полиэтиленгликоля. В случае немодифицированных наночастиц смещения максимума не происходит.
Поскольку взаимодействие антиген-антитело обычно проводится при значениях pH, близких к физиологическим, исследовали возможность перевода конъюгатов в подходящие буферные растворы. Полученные конъюгаты стабильны в карбонатном буферном растворе, как в присутствии, так и в отсутствие полиэтиленгликоля, однако этот буферный раствор нежелателен для проведения иммунореакции. Независимо от наличия полиэтиленгликоля конъюгаты нестабильны в фосфатно-солевом буферном растворе, что выражается в обесцвечивании раствора и появлении чёрного осадка. В отсутствие полиэтиленгликоля конъюгаты нестабильны и в натрий-фосфатном буферном растворе, однако в присутствии 0.5 мг/мл полиэтиленгли-коля раствор устойчив.
В случае однократного нанесения на нитроцеллюлозу раствора полученного конъюгата наночастиц золота с реактивом Эллмана и антителами, разбавленного в 4 раза, характеристический максимум красителя всё ещё надёжно детектируется. На рис. 5 показан спектр ГКР образца нитроцеллюлозы в точке 5-кратного нанесения неразбавленного раствора конъюгата. Интенсивность максимума на этом спектре превышает 40000. Красная окраска при этом визуально не фиксируется, что свидетельствует об очень низкой концентрации конъюгатов в объеме образца. Эти данные подтверждают возможность проведения высокочувствительного анализа с использованием полученных конъюгатов. В спектрах контрольных конъюгатов, полученных из наночастиц без иммобилизованного реактива Эллмана, характеристический максимум не обнаруживается.
Для подтверждения активности используемых антител было проведено определение адсорбированного на мембране Immobilon™ приона методом иммуноферментного анализа. В качестве оптимальной была принята концентрация конъюгатов антител с пероксидазой, не приводящая к заметному окрашиванию контрольной мембраны после проявки, но вызывающая интенсивное окрашивание мембраны с нанесённым прионом. Для иллюстрации полученного результата на рис. 6 приведены гистограммы распределения интенсивности окраски мембраны с прионом и без него по количеству окрашенных пикселов на её фотографии. Сравнение гистограмм свидетельствует о том, что мембрана с прионом имеет более тёмную окраску, обусловленную наличием продуктов окисления диаминобензидина.
а
б
Рисунок 6. Гистограммы распределения интенсивности окраски мембраны по количеству точек для контрольного образца (а) и образца с прионом (б). Максимальное значение интенсивности соответствует белому цвету.
Прионы хорошо адсорбируются на металлическую поверхность, что приводит к заражению используемых для работы с ними инструментов, которое трудно ликвидировать. Поэтому представляется необходимым исследование условий протекания данного процесса. В качестве примера металлической поверхности была выбрана поверхность алюминия. Исследование влияния обработки поверхности алюминия хлоридом полидиметилдиаллиламмония на её адсорбционную способность по отношению к приону методом иммуноферментного анализа показало, что только при адсорбции приона на необработанную поверхность оптическая плотность проявляющего раствора выше, чем в случае контрольного образца. В этой связи в дальнейших экспериментах обработка образцов хлоридом полидиме-тилдиаллиламмония не проводилась.
Для исследования влияния условий адсорбции приона на поверхность алюминия прион адсорбировали из ацетатного буферного раствора в присутствии 2 М и 8 М мочевины, а также из фосфатно-солевого буферного раствора и ацетатного буферного раствора без мочевины, после чего определяли его методом иммуноферментного анализа. Оптические плотности растворов после стадии проявки приведены на рис. 7.
Оптическая плотность
Из приведённых данных можно сделать вывод, что при адсорбции приона в отсутствие мочевины оптическая плотность растворов для образцов с прионом наиболее высока, так как в этих условиях как фибриллизация, так и олигомеризация приона протекают наиболее интенсивно.
На рис. 8 представлены результаты определения приона, адсорбированного на поверхности алюминия, с использованием спектроскопии ГКР при различных концентрациях конъюгата. Из представленных данных можно видеть, что только в случае разведения в 2 раза (оптическая плотность в максимуме поглощения 0.22) образец с прионом обладает более интенсивным характеристическим максимумом, чем образец без приона. Следовательно, концентрация конъюгата, которой соответствует эта оптическая плотность, в случае определения приона на поверхности алюминия является оптимальной. При понижении концентрации конъюгата уменьшается скорость образования иммунокомплексов, а повышение концентрации конъюгата сопровождается повышением концентрации свободного полиэтиленгли-коля, дестабилизирующего иммунокомплексы.
3,0
2,5 -
2,0 -
1,5 -
1,0 -
0,5
0,0
контроль прион/ прион/ прион/ прион/
фосфатно- ацетатный ацетатный ацетатный
солевой буфер буфер 2М буфер 8М
буфер мочевина мочевина
м 500 -
!ч
£
о 400 -о
XI Х2 Х4 Х4 Х4 Х8 30 мин 60 мин 120 мин
Рисунок 8. Интенсивности характеристического максимума алюминиевых образцов с нанесённым прионом, бычьим сывороточным альбумином и конъюгатом наночастиц золота с антителами и реактивом Эллмана, взятым в различных разведениях. Незаштрихованные столбцы соответствуют контрольным образцам (без приона).
Итак, описанные результаты показывают применимость полученных конъюгатов наночастиц золота размером 45 нм с реактивом Эллмана и антителами в иммуноанализе. Способность наночастиц такого размера к значительному усилению сигнала в спектре комбинационного рассеяния иммобилизованного красителя по сравнению с сигналом свободного красителя оказалась достаточной для определения приона в концентрации 50 нг/мл.
Рисунок 7. Определение приона методом иммуноферментного анализа при различных условиях его адсорбции на поверхность алюминия.
При уменьшении концентрации антител в растворе, используемом в качестве исходного для приготовления конъюгатов, чувствительность иммуноанализа падает настолько сильно, что характеристический максимум реактива Эл-лмана в спектре образца с прионом зарегистрировать не удается.
Список использованных источников
1. Зуев В.А. Прионы - новый класс возбудителей инфекционных заболеваний. // Антибиотики и химиотерапия. 1999. №10. С.33-38.
2. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infections particles cause scrapie. // Science. 1982. V.216. P.136-144.
3. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. // Science. 1997. V.277. P.381-383.
4. Wickner R.B., Chernoff Y.O. Prions of fungi: [URE3],[Psi+] and [Het-s] discovered as heritable traits. 1999. P.229-272. In Prusiner S.B. (ed.), Prion biology and diseases. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
5. McKinley M.P., Bolton D.C., Prusiner S.B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. // Cell. 1983. V.35. P.57-62.
6. Prusiner S.B., McKinley M.P., Bowman K.A, Bolton D.C., Bendheim P.E.,Groth D.F.,Glenner G.G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. // Cell. 1983. V.35. P.349-358.
7. Bucciantini M., Giannoni E., Chiti F. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. // Nature. 2002. V.416. P.507-511.
8. Walsh D.M., Klyubin I., Fadeeva J.V. Naturally secreted oligomers of amyloid В protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. // Nature. 2002. V.416. P.535-539.
9. Trieschmann L., Santos A.N., Kaschig K., Torkler S., Maas E., Schatzl H., Bohm G. Ultra-sensitive detection of prion protein fibrils by flow cytometry in blood from cattle affected with bovine spongiform encephalopathy. // BMC Biotechnology. 2005. 5:26.
10. Wigginton K.R. and Vikesland P.J. Gold-coated polycarbonate membrane filter for pathogen concentration and SERS-based detection. // Analyst. 2010. V. 135. P. 1320-1326.
11. Josephy P.D., Eling T.E., and Mason R.P. Co-oxidation of Benzidine by Prostaglandin Synthase and Comparison with the Action of Horseradish Peroxidase. // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. No. 9. P. 5561-5569.
12. Karthikeyan K.G., Chorover J., Bortiatynski J.M. Interaction of 1-Naphthol and Its Oxidation Products with Aluminum Hydroxide. // Environ. Sci. Technol. 1999. V. 33. P. 4009-4015.
