CC BY
72
УДК 619:616.98:578.894
Новый ультразвуковой метод обнаружения прионного протеина в режиме реального времени, проводимый
с применением плазминогена
К. Негредо, Э. Монкс, Т. Свиней, Veterinary Sciences Centre, School of Agriculture, Food Science and Veterinary Medicine (г. Дублин, Республика Ирландия)
Ключевые слова: губкообразная энцефалопатия, диагностика, прион, ультразвук
Сокращения: ЦНС — центральная нервная система; ППЧ — покрытые плазминогеном частицы; СУ — скорость ультразвука; ЗУ — затухание ультразвука
Введение
Прионные болезни — нейродегенеративные патологии человека и животных, возникающие в результате аккумуляции в ЦНС устойчивой к протеазе формы (РгРк<я) мембранного гли-копротеина (РгРС), называемой прионом [28]. Превращение РгРС в РгР5с происходит за счет конформационной трансформации [5, 25], в результате которой белок приобретает новые физико-химические свойства. В то время как РгРС присутствует в клетках в мономерной форме и быстро разрушается протеиназой К, инфекционная изоформа РгРк<ж формирует агрегаты, которые не растворяются в детергентах и проявляют повышенную устойчивость к протеиназе К [1, 20].
Современные методы диагностики ГЭ основаны на иммунологическом обнаружении прионного белка с помощью специфических антител. Невозможность дифференцирования этими методами РгРС и РгРк<ж диктует необходимость предварительной обработки тестируемых проб протеиназой К. Такая обработка негативно сказывается на чувствительности диагностических тестов, т.к. не все модификации РгРк<я проявляют одинаковую резистентность к протеиназе К. С целью повышения чувствительности методов диагностики ГЭ испытывали аптамеры нуклеиновых кислот [31], антитела к ДНК [34], специфические моноклональные антитела [13, 26] и плазминоген [9]. Плазминоген — профермент плазмы крови, участвующий в лизисе фибрина [27]. С помощью намагниченных частиц с ковалентно прикрепленным плазми-ногеном удалось обнаружить РгРС у многих видов животных [9, 17]. Чтобы добиться прикрепления к плазминогену РгРС, понадобились специальные условия, при которых ускоряется формирование фибрилл [32].
Ультразвуковая спектроскопия с высоким разрешением — новый недеструктивный аналитический метод, результаты которого учитывают в режиме реального времени. Она основана на оценке структуры и состава тестируемого материала по изменению поведения ультразвуковых волн при его прохождении. Ультразвуковая спектроскопия позволяет измерять одновременно 2 параметра — СУ и ЗУ, которые чувствительны к изменениям внутримолекулярных взаимодействий и организации молекул. ЗУ определяет величину потери энергии при сдавливаниях и расширениях, сопутствующих прохождению ультразвуковых волн, и тем самым позволяет судить о структурной организации материалов. Ультразвуковая СУ служит мерой плотности и эластичности материалов и дает информацию о структуре субстанций. Посредством ультразвукового сканирования можно одновременно анализировать структуру материалов и происходящие в них химические изменения (например, процесс образования агрегатов и геля в
пищевых коллоидах, конформационные изменения полимеров и биополимеров, образование мицелл [2, 3, 4, 14, 33], а также течение химических реакций [15, 24]). Преимуществами данного метода являются возможность тестирования разных материалов (в т.ч. непрозрачных, что не позволяет делать оптическая спектроскопия), отсутствие необходимости их предварительной обработки, высокое разрешение при измерении СУ, позволяющее выявлять вещества в очень низкой концентрации.
Целью нашей работы стало изучение взаимодействия плазминогена с PrPRes и создание чувствительной ультразвуковой системы выявления приона в пробах головного мозга овец, больных скрепи.
Методы
Ковалентное прикрепление плазминогена к парамагнитным частицам. 100 мкг плазминогена человека (Sigma) ко-валентно связывали с парамагнитными активированными тозилом частицами (M-280 Dynabeads, 2 мл), ресуспенди-рованными в 1 мл 0,1M боратного буферного раствора (pH 9.5). После 48-часовой инкубации при 4 °C частицы дважды (по 5 мин) промывали фосфатно-буферным раствором с 0,1 % бычьего сывороточного альбумина. Свободные тозиловые радикалы блокировали посредством инкубирования частиц в 0,2 M трис-буферном растворе (pH 8.5), содержавшем 0,1 % (w/v) бычьего сывороточного альбумина, 24 ч при 20 °C. Затем частицы 1 раз промывали фосфатно-буферным раствором (pH 7.4) с 0,1 % (w/v) бычьего сывороточного альбумина и доводили их взвесь до конечной концентрации 2х109/мл в том же буферном растворе с 0,02 % азида натрия. Суспензию ППЧ хранили при 4 °C.
Тестируемый материал. Пробы мозжечка 5 здоровых и 5 больных скрепи овец получили в Центральной ветеринарной исследовательской лаборатории (г. Абботстоун). Возраст больных животных (2 баранов и 3 овцематок) варьировал от 2 до 4 лет. Скрепи диагностировали у них гистологическим и им-муногистологическим методами. 20%-е гомогенаты проб, приготовленные на 5%-м растворе сахарозы, хранили при - 20 °C. Перед тестированием их концентрацию снижали до 2; 5 и 10 % добавлением соответствующих количеств холодного 0,1 M фосфатного буферного раствора (pH 7.4) с 0,5 M NaCl, 0,1 % саркозила в присутствии или без протеиназы К. После того как предварительные исследования показали преимущества исследования менее концентрированных проб, стали проводить реакцию только с 2%-ми гомогенатами. При наличии в буферном растворе протеиназы К (5 мкг/мл) пробы инкубировали 20 мин при 37 °C. Процесс останавливали добавлением ингибитора протеаз (Pefabloc, Sigma) до конечной концентрации 4 мМ. В той же концентрации Pefabloc добавляли в гомогенаты мозга, которые не обрабатывали протеиназой К. Ультразвуковая спектроскопия. Взаимодействие PrPRes с плазминогеном оценивали в режиме реального времени по СУ и ЗУ на ультразвуковом спектрофотометре HR-US 102 (Ultrasonic Sci. Ltd) при температуре 25 °C, которую поддер-
живали с помощью водяной циркуляционной бани Haake F8 (Karlsruhe, Германия). Частота ультразвуковых волн составляла 5 000, 8 000 и 11 400 МГц, а максимальные уровни ошибки при оценке величин СУ и ЗУ — 0,2 мм/с и 0,1 % соответственно. Пробы гомогенатов мозжечка тестировали в объеме 900 мкл, предварительно выдержав 20 мин при 25 °C. Каждую из них вносили в измерительную и референтные ячейки прибора. Затем к ним добавляли по 10 мкл взвеси ППЧ (2х107). Реакционную смесь перемешивали с постоянной скоростью 700 об/мин. На протяжении 3...4 ч отмечали изменения СУ и ЗУ в обеих ячейках — различия показаний регистрировали и подвергали математической обработке. В тех же условиях проводили контрольное тестирование проб, в которые добавляли частицы без плазминогена. Все измерения проводили 2.3-кратно. Первоначально анализировали оба показателя, а потом лишь СУ, поскольку по ЗУ не удавалось дифференцировать пробы, содержащие PrPRes, от проб с одним только PrPc.
Результаты
Тестирование необработанных протеиназой К гомогенатов. При исследовании гомогенатов головного мозга больных скрепи овец изменения СУ в инкубационный период теста происходили в 3 стадии (рис. 1). Вначале она повышалась, достигая максимального значения приблизительно за 40 мин, в течение почти 90 мин оставалась без существенных изменений и затем резко снижалась за 10.20 мин до исходного уровня. Изменения СУ смеси гомогенатов головного мозга здоровых овец с ППЧ количественно и качественно отличались (р < 0,05, рис. 1). В течение 4 ч этот показатель постепенно, но незначительно повышался. Сходные результаты получили при исследовании проб головного мозга здоровых и больных скрепи овец, в которые не добавляли ППЧ (рис. 1). Это доказывало возможность идентификации PrPSc в гомогенатах мозга овец апробированным методом.
Тестирование обработанных протеиназой К гомогенатов.
Для подтверждения специфичности показаний теста провели анализ изменения СУ тех же проб мозжечка после обработки протеиназой К (рис. 2). Отметили укорочение второй стадии реакции, когда данный показатель оставался стабильным. Как следствие, вначале СУ в течение 70 мин повышалась с большей амплитудой, чем без обработки ткани протеиназой К, а затем резко снижалась, достигая в течение 10 мин исходного уровня. Пробы головного мозга здоровых овец вели себя одинаково как после обработки протеиназой К, так и без нее: изменений СУ, наблюдавшихся при взаимодействии плазминогена с пробами мозга больных скрепи овец, не наблюдали (р > 0.05).
Обсуждение
Проведенные эксперименты подтвердили ранее сделанные наблюдения [9, 17] относительно того, что плазминоген способен селективно связывать PrPRes, и показали возможность использовать данный феномен для диагностики при-онных инфекций посредством дифференциации изоформ прионного белка. Эти наблюдения не согласуются с данными В. Эллис и соавт. [7], Ц. Риоу и соавт. [29], Дж.А. Комблатта и соавт. [12] и М. Кукциолони и соавт. [6], которые сообщали о реагировании плазминогена с рекомбинантным прионным протеином и очищенным PrP^ Эти различия, вероятно, обусловлены неодинаковыми детергентными условиями, в которых проводилась реакция. Еще раньше было высказано предположение о том, что предпочтительное связывание плазми-ногеном определенных изоформ прионного белка зависит от их физического состояния в растворах детергентов [17, 29]. М.В. Фишер и соавт. [9], а также М. Майссен и соавт. [17] отмечали, что PrPRes, склонный к образованию агрегатов, сильнее связывается с плазминогеном, чем растворимая форма PrP^ И. Шейкд и соавт. [19] считают, что селективное
связывание РгРк<ж плазминогеном происходит в условиях воздействия детергентов, которые ускоряют образование агрегатов РгРк<я. Мы готовили гомогенаты мозжечка овец в буферном растворе с саркозилом — анионным детергентом, ускоряющим образование прионным белком агрегатов [7, 12]. Скорее всего, условия проведения наших опытов способствовали взаимодействию плазминогена с РгРк<я и образованию последним агрегатов. Отсутствовали признаки влияния на результаты реакции эндогенного плазминогена (все пробы головного мозга больных скрепи овец реагировали положительно).
Характер изменений СУ обработанных и необработанных протеиназой К гомогенатов головного мозга больных скрепи животных свидетельствовал о связывании плазминогеном прионного белка и его преципитации. Интенсивность таких изменений, уровень связывания прионного белка и время, необходимое для его преципитации при исследовании разных проб, было неодинаковым. Невозможно сделать окончательные выводы о кинетике процесса связывания плазминогеном прионного белка, поскольку не были точно известны концентрация РгРк<я и количество сайтов связывания на поверхности частиц с плазминогеном. Однако уровень связывания РгРк- и амплитуда изменений СУ были выше и проявлялись быстрее в интактных пробах по сравнению с обработанными протеиназой К. Преципитация комплексов РгРС, напротив, происходила быстрее в обработанных протеиназой К пробах. Эти результаты свидетельствуют о различной способности связываться с плазминогеном обработанных и необработанных протеиназой К агрегатов прионного белка. Наблюдавшуюся вариабельность СУ можно объяснить возникновением двух типов агрегатов, которые могли быть весьма сходными по размерам, но различались структурно и по количеству доступных поверхностных групп.
Плазминоген — протеин сыворотки крови, способный взаимодействовать с разными субстратами, которые содержат терминальные остатки лизина [22, 27]. Механизмы связывания плазминогеном РгР5с не ясны, а их изучению препятствует отсутствие информации о структуре РгРк<ж. Однако установлено, что во взаимодействии плазминогена с агрегатами РгРк<ж участвует лизин [9]. Молекула протеина приона овцы содержит несколько кластеров остатков лизина на своей поверхности (104, 107, 109, 113, 188, 197 и 207) и подвижном хвосте (25, 26 и 29). Последний быстро разрушается протеиназой К [10]. Возможно, что этот фермент не только разрушает в агрегатах РгР5с реактогенные лизиновые сайты, но также индуцирует конформационные изменения, которые могут маскировать такие сайты. Как следствие, агрегаты конформационно измененного прион-ного белка могут проявлять пониженную реактогенность с плазминогеном.
Изменением при обработке протеиназой К структуры агрегатов прионного белка и соответствующего снижения их афиннитета к плазминогену можно объяснить различия изменения СУ обработанных и необработанных этим ферментом гомогенатов головного мозга овец. Уровень изменений СУ таких систем определяется эластичными свойствами вновь образуемых протеиновых комплексов и, следовательно, числом взаимодействий между агрегатами прионного белка и частицами, покрытыми плазминогеном. В системе с необработанным протеиназой К прионным белком быстро формируются и стабилизируются их связи с плазминогеном. В системе с обработанным протеиназой К прионным белком, частично утратившие реактогенность агрегаты медленно соединяются с плазминогеном, формируя комплексы с пониженной стабильностью. Такая модель позволяет объяснить причины ускоренного процесса связывания плазминогеном интактного прионного белка по сравнению с обработанным протеиназой К.
РВЖ СХЖ №1-2009
25
Колебания СУ и ЗУ, выявленные в наших опытах, указывают на то, что в тестированных системах происходили значительные физико-химические изменения. Величина СУ определяется плотностью и эластичностью среды по отношению к давлению ультразвуковых волн, и этот параметр можно выразить сжимаемостью [30]. Повышение СУ в начале реакции плазминогена с прионным белком указывает на происходящие конформационные изменения и образование комплексов обоих протеинов. Следовательно, изменения СУ могут быть обусловлены как их химическим взаимодействием, так и новыми структурными свойствами образующихся комплексов. Конформационные изменения последних, по всей видимости, ведут к снижению сжимаемости системы и изменению СУ. Сообщалось о том, что конформационное снижение плотности структур сопровождается изменением их реактогенности с аминокислотами и белками, например фибрином [16, 18, 19]. При связывании плазминогеном ли-ганда происходит смена закрытых структур на открытые. Высказывалось предположение о том, что такое конформа-ционное изменение сопровождается уменьшением объема системы за счет повышения площади поверхностей, на которые могут воздействовать растворители, разрыва электростатических связей и снижения размеров пустот [11]. Увеличение контактов протеина с молекулами воды (т.е. повышение гидратации) ведет к значительному изменению СУ. Увеличение количества воды, окружающей растворенные в ней молекулы, обеспечивает повышение СУ растворов за счет снижения сжимаемости системы в целом. В наших опытах те же факторы привели к аналогичным изменениям системы. Снижение компактности молекул белков сопровождается повышением СУ. Интересно, но наиболее постоянные изменения СУ выявили в смесях, содержащих минимальное количество мозга (2 %). По мере развития конформацион-ных изменений белков возникают пустоты в центральных частях их молекул и происходит перегруппировка атомов. Группы атомов, которые находились в глубине молекулы, могут оказаться на ее поверхности, индуцируя в белке изменения водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Рост СУ также может возникать в результате изменения эластичности находящихся в растворе белков при образовании ими комплексов. Данный процесс может вести к росту устойчивости растворов белков к деформации и их эластичности. После формирования протеиновых комплексов среда становится более ригидной и компактной, а в менее эластичной среде повышается СУ. В конечном итоге взаимодействие белков приводит к ускорению восстановления исходных свойств субстрата, что проявляется снижением СУ. По всей видимости, в 2 %-х гомогенатах мозга легче всего выявлять взаимодействия прионного белка с плазминогеном.
Заключение
Проведенное нами исследование показало возможность выявления с помощью ультразвуковой спектроскопии комплексных соединений плазминогена с агрегатами PrPRes и дифференциации изоформ прионного белка. Специфичность взаимодействия плазминогена с PrPRes подтвердили результаты тестирования этим методом обработанных и необработанных протеиназой К гомогенатов мозжечка здоровых и больных скрепи овец. Одно из основных преимуществ данного метода состоит в том, что для его проведения нет необходимости обрабатывать патологический материал протеиназой К.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Bolton D.C., McKinley M.P., Prusiner S.B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science, 1982, 218, 1309—1311.
2. Buckin V.A., Smyth C. High-resolution ultrasonic resonator measurements for analysis of liquids. Seminars of Food Analysis, 1999, 4, 89—105.
3. Buckin V.A., Kudryashov E., O'Driscoll B. An alternative spectroscopy technique for biopharmaceutical applications. Pharm Techn Europe, 2002, 14, 33—37.
4. Buckin V.A., Kudryashov E. Supersonic - high-resolution ultrasonic spectroscopy. Biochemist, 2002, 24, 4, 25—27.
5. Caughey B.W., Dong A., Bhat K.S. et al. Secondary structure analysis of the scrapie-associated protein PrP 27-30 in water by infrared spectroscopy. Biochem, 1991, 30, 7672—7680.
6. Cuccioloni M., Amici M., Eleuteri A.M. et al. Binding of recombinant PrPc to human plasminogen: kinetic and 21 thermodynamic study using a resonant mirror biosensor. Proteins, 2005, 58, 728—734.
7. Ellis V., Daniels M., Misra R., Brown D.R. Plasminogen activation is stimulated by prion protein and regulated in a copper-dependent manner. Biochemistry,
2002, 41, 6891—6896.
8. Epple G., Langfeld K., Baier M. et al. Both lysine-clusters of the NH2-terminal prion-protein fragment PrP23-110 are essential for t-PA mediated plasminogen activation. Thromb Haemost, 2004, 91, 465—472.
9. Fischer M.B., Roeckl C., Parizek P. et al. Binding of disease-associated prion protein to plasminogen. Nature 2000, 408, 479—483.
10. Hubbard S.J. The structural aspects of limited proteolysis of native proteins. Biochim & Biophys Acta, 1998, 1382, 191—206.
11. Kornblatt J.A., Kornblatt M.J., Clery C., Balny C. The effects of hydrostatic pressure on the conformation of plasminogen. Eur J Biochem, 1999, 265, 120—126.
12. Kornblatt J.A., Marchal S., Rezaei H. et al. The fate of the prion protein in the prion/plasminogen complex. Biochem Biophys Res Comm, 2003, 305, 518—522.
13. Korth C., Stierli B., Streit P. et al. Prion (PrPSc)-19 specific epitope defined by a monoclonal antibody. Nature, 1997, 390, 74—77.
14. Kudryashov E., Kapustana T., Morrissey S. et al. The Compressibility of Alkyltrimethylammonium Bromide Micelles. J Colloid Interface Sci, 1998, 203, 59—68.
15. Kudryashov E., Smyth C., O'Driscoll B., Buckin V.A. High-Resolution Ultrasonic Spectroscopy for analysis of chemical reactions in real time. Spectroscopy,
2003, 18, 10.
16. Lucas M.A., Fretto L.J., McKee P.A. The binding of human plasminogen to fibrin and fibrinogen. J. Biol. Chem. 1982, 258, 4249—4256.
17. Maissen M., Roeckl C., Glatzel M. Et al. Plasminogen binds to disease-associated prion protein of multiple species. Lancet, 2001, 357, 2026—2028.
18. Markus G. Conformational changes in plasminogen, their effect on activation and the agents that modulate activation rates - a review. Fibrinolysis, 1996, 10, 75—85.
19. Marshall J.M., Brown A.J., Ponting C.P. Conformational studies of Human plasminogen and plasminogen fragments: Evidence for a novel third conformation of plasminogen. Biochemistry, 1994, 33, 3599—3606.
20. McKinley M.P., Bolton D.C., Prusiner S.B. A Protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell, 1983, 35, 57—62.
21. McKinley M.P., Meyer R.K., Kenaga L. et al. Scrapie prion rod formation in vitro requires both detergent extraction and limited proteolysis. J Virol, 1991, 65, 1340—1351.
22. Miles L.A., Dahlberg C.M., Plescia J. et al. Role of cellsurface lysines in plas-minogen binding to cells: identification of ß-enolase as a candidate plasminogen receptor. Biochemistry, 1991, 30, 1682—1691.
23. Naslavsky N., Stein R., Yanai A. et al. Characterization of detergent-insoluble complexes containing the cellular prion protein and its scrapie isoform. J Biol Chem, 1997, 10, 6324—6431.
24. O'Driscoll B., Kudryashov E., Buckin V.A. Future determination of biochemical monitoring using high-resolution ultrasonic spectroscopy. Amer Biotechn Lab,
2004, 1, 26—27.
25. Pan K.M., Baldwin M., Nguyen J. et al. Conversion of ß-helices into ß-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 10962—10966.
26. Paramithiotis E., Pinard M., Lawton T. et al. A prion protein epitope selective for the pathologically misfolded conformation. Nat Med, 2003, 9, 893—899.
27. Plow E.F., Herren T., Redlitz A. et al. The cell biology of the plasminogen system. FASEB J, 1995, 9, 939—945.
28. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases. Science, 1991, 252, 1515—1522.
29. Ryou C., Prusiner S.B., Legname G. Cooperative binding of dominantnegative prion protein to kringle domains. J Mol Biol, 2003, 329, 323—333.
30. Sarvazyan A.P. Ultrasonic velocimetry of biological compounds. Mol Biol, 1983, 17, 916—927.
31. Sayer N.M., Cubin M., Rhie A. et al. Structural determinants of conformationally selective, prion-binding aptamers. J Biol Chem, 2004, 279, 13, 13102—13109.
32. Shaked Y., Engelstein R., Gabizon R. The binding of prion proteins to serum components is affected by detergent extraction conditions. J Neurochem, 2002, 82, 1—5.
33. Smyth C., Dawson K., Buckin V.A. Ultrasonic analysis of heat-induced coagulation in calcium fortified milk. Progr. Colloid Polym Sci, 1999, 112, 221—226.
34. Zou W.Q., Zheng J., Gray D.M. et al. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. PNAS USA, 2004, 101, 1380—1385.
C. Negredo, E. Monks, T. Sweeney. A novel real-time ultrasonic method for prion protein detection using plasminogen as a capture molecule. BMC Biotechnology 2007, 7:43 doi:10.1186/1472-6750-7-43. OA.
