CC BY
35
Химические науки
Пестовский Ю.С.
соискатель ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет», г. Иваново
Использование золота для повышения интенсивности сигнала нитрогруппы в спектре гигантского комбинационного рассеяния
Пестовский Ю.С.
Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) обладает очень высокой чувствительностью и в ряде случаев позволяет обнаруживать одиночные молекулы [1]. Получение конъюгатов антител с ГКР-активными наноструктурами привело к возникновению нового типа иммуноанализа, который на несколько порядков превосходит по чувствительности широко применяемый в настоящее время иммуноферментный анализ. Использование нано-структурированных подложек позволяет достигать настолько значительных эффектов ГКР, что возможно проведение анализа без использования красителей путем наблюдения за изменениями спектра ГКР иммобилизованного белка, возникающими вследствие конформационных изменений, вызванных его связыванием с молекулами аналита [2].
Покрытие наночастицами наноструктурированных поверхностей придает им ГКР-активность. Использование данного подхода было продемонстрировано на примере определения иммунокомплексов, адсорбированных на поверхности кремниевых нанопроводов, покрытых монослоем наночастиц серебра [3].
Дальнейшее повышение чувствительности анализа может быть достигнуто путем одновременного использования подложек с иммобилизованными наночастицами и агрегатов наночастиц с иммобилизованным на их поверхности красителем и антителами [4] или даже простого нанесения второго слоя наночастиц на поверхность образцов после реализации биоспецифических взаимодействий [5].
Таким образом, использование спектроскопии ГКР в качестве метода регистрации биоспецифических взаимодействий открывает возможности повышения чувствительности анализа на несколько порядков. Дальнейшее повышение чувствительности может быть достигнуто при проведении иммуноанализа на поверхности наноструктур золота. Обычно для получения таких наноструктур используют обработку исходной поверхности различными физическими методами, например, травлением ионным пучком. Более перспективным представляется другой подход, связанный с формированием наноструктур золота из раствора наночастиц, сопровождающимся их агрегацией. В данном случае наноструктуры формируются путем самоорганизации, обладающей намного более разнообразными возможностями.
Реактивы и материалы
В работе использовали аминопропилтриэтоксисилан Merck (Германия), наночастицы золота средним диаметром 15 нм производства ИБФРМ (Саратов), концентрация раствора наночастиц 1.6 • 10 частиц/мл; 5,5 -дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (ДТНБ) Fluka (Германия), хлорид полидиметилдиаллиламмония Aldrich (США), соли и компоненты буферных растворов Merck (Германия), ICN (США), мембраны Hybond™ фирмы GE Healthcare (США), Immobilon™ фирмы Millipore (Франция), нитроцеллюлозу Millipore (Франция). Все реактивы использовались без предварительной очистки. Все растворы готовились на воде, удельное сопротивление которой составляет 18.2 МОм/см, полученной с помощью системы очистки воды Milli-Q фирмы Millipore (США).
Методика
Для модификации аминогруппами образцы стекла выдерживали под слоем аминопропилтриэтоксисилана без растворителя в эксикаторе над прокаленным силикагелем
Химические науки
в течение 2 часов, затем поверхность промывали водой до полного удаления образовавшегося твердого слоя или непрореагировавшего вещества и высушивали в потоке воздуха. После модификации поверхности сразу проводили иммобилизацию наночастиц. Исходный раствор наночастиц золота разбавляли водой в 5 раз. Образцы выдерживали под слоем раствора в течение 30 минут во влажной камере. Затем образцы промывали водой и высушивали в потоке воздуха.
При обработке образцов полиэлектролитом его концентрация составляла 10.98 мг/мл.
Спектры поглощения стеклянных образцов получали на двухлучевом кюветном спектрофотометре Shimadzu UV-1800. Перед поиском максимумов поглощения производили сглаживание спектров. Спектры поглощения раствора наночастиц золота получали на планшетном спектрофотометре Bio-Rad xMark.
Спектры комбинационного рассеяния получали на спектрометре innoRam фирмы B&WTek, Inc. Длина волны возбуждающего лазера составляет 785 нм, диаметр луча 0.1 мм (собственные измерения). Измерения проводили при следующих параметрах: мощность лазера 10%, время накопления 1.5 с, усреднение по 10 спектрам. Перед получением каждого спектра вручную при времени накопления 1 с без усреднения настраивали резкость так, чтобы интенсивность максимума в спектре была наибольшей. Если интенсивность максимума была больше предельной, подбирали соответствующее время накопления; полученные данные нормировали на время накопления 1.5 с в предположении линейной зависимости интенсивности спектральных максимумов от времени накопления (правомерность такой нормировки была доказана экспериментально). Обработку спектров осуществляли в программе GRAMS Research 3.01A Level II. Из найденных интенсивностей максимума вычитали уровень базовой линии, который находили вручную для каждого спектра.
Для иммобилизации красителя к 500 мкл раствора полученных цитратным способом наночастиц золота диаметром 45 нм (8.97-10 M, pH 4.42) добавляли 1000 мкл раствора ДТНБ. Реакцию проводили при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 7 часов. Затем наночастицы отделяли центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 мин и ресуспендировали в 200 мкл воды.
Результаты и обсуждение
Для проведения иммуноанализа с использованием спектроскопии ГКР в качестве метода регистрации обычно используют наночастицы с иммобилизованным красителем. Для данной цели была проведена иммобилизация ДТНБ на поверхность наночастиц золота, имеющих средний диаметр 45 нм. Известно, что наночастицы золота такого размера имеют максимальную ГКР-активность [6].
В литературе описана методика иммобилизации ДТНБ на поверхности наночастиц золота, требующая проведения процесса в этиловом спирте [7, 8]. Однако используемые наночастицы в этих условиях нестабильны. В этой связи иммобилизацию проводили в водном растворе. Процесс проводили в различных буферных растворах, а также в воде без добавления дополнительных компонентов. Было также исследовано влияние концентрации ДТНБ в растворе.
Из приведенных на рис. 1 данных видно, что при проведении процесса в воде без добавления солей при использо-
вании насыщенного раствора ДТНБ наблюдается высокая интенсивность сигнала, определяемого с низкой погрешностью. Несмотря на то, что при использовании некоторых солей интенсивность сигнала оказывается выше, его низкая воспроизводимость не позволяет применять такие препараты наночастиц. В этой связи в дальнейшем иммобилизацию ДТНБ на поверхность наночастиц проводили в насыщенном водном растворе без добавления дополнительных компонентов.
При проведении процесса в цитратном буферном растворе и трис-буфере наночастицы дестабилизируются, что выражается в появлении черного или красноватого осадка, который не удается ресуспендировать. Кроме того, оптическая плотность раствора в максимуме поглощения составляет 0.059 при проведении процесса в цитратном буферном растворе и 0.063 — в трис-буфере, в то время как при проведении процесса в присутствии карбоната натрия оптическая плотность составляет 0.199, в натрий-фосфатном буферном растворе 0.242, а в воде 0.585. Однако при ресуспендировании немодифицированных наночастиц в тех же буферных растворах в отсутствие ДТНБ наночастицы остаются стабильными даже после нескольких месяцев хранения. Кроме того, немодифицированные наночастицы стабильны в 1 М №С1, а наночастицы с иммобилизованным из насыщенного водного раствора ДТНБ в нем агрегируют. Следовательно, дестабилизация наночастиц в цитратном буферном растворе и трис-буфере связана с наличием на их поверхности ДТНБ.
с (А61 А), 1 М
Рисунок 1. Влияние условий иммобилизации ДТНБ на поверхность наночастиц золота размером 45 нм на интенсивность основного характеристического максимума красителя.
Цвет столбцов соответствует присутствию дополнительных компонентов: в отсутствие солей (черный); натрий-фосфатный буфер; цитрат и карбонат натрия; трис-буфер; цитрат натрия (светло-серый).
Иммобилизация на поверхность модифицированного аминогруппами стекла наночастиц золота размером 15 нм, взаимодействовавших с 10-5 М цистеином в течение 6 часов,
7000
при времени иммобилизации 30 мин приводит к появлению от 2 до 5 максимумов поглощения, лежащих в интервале 515 — 643 нм. Таким образом, наличие на поверхности наночастиц золота иммобилизованного цистеина дестабилизирует их. Следовательно, этот процесс является общим для иммобилизации соединений, содержащих меркаптогруппу или дисульфидную связь, на поверхность наночастиц золота различных размеров. Итак, наблюдавшаяся дестабилизация наночастиц золота при иммобилизации ДТНБ не объясняется экспериментальными погрешностями.
Изучение зависимости интенсивности характеристического максимума ДТНБ от концентрации наночастиц в наносимом на нитроцеллюлозу растворе, выражаемой значением оптической плотности раствора в максимуме поглощения, показало, что форма зависимости близка к сигмоидальной. Это связано с повышенным разбросом измеряемых значений интенсивности при слишком высоких и слишком низких концентрациях наночастиц, что, в свою очередь, вызвано их неравномерным распределением в объеме образца.
На рис. 2 представлен участок этой зависимости в интервале оптических плотностей 0.01 — 0.33. Из этих данных можно видеть, что в рассматриваемом интервале зависимость близка к линейной. Несмотря на то, что при более высоких оптических плотностях интенсивность характеристического максимума выше, большой разброс его значений в различных точках образца не позволяет использовать такие концентрации наночастиц. В этой связи в дальнейшем, если не оговорено особо, использовались растворы наночастиц, имеющие оптическую плотность в максимуме поглощения 0.33.
Спектры ГКР нанесенных на нитроцеллюлозу наночастиц с ДТНБ оказались идентичны до и после прогрева образца при 60°С в течение 10 мин. Таким образом, несмотря на гигроскопичность нитроцеллюлозы, возможное наличие небольшого количества адсорбированной воды не оказывает влияния на спектры ГКР.
Наиболее простым способом приготовления образцов для получения их спектров ГКР является высушивание исследуемых препаратов на поверхности полистирола. Существенным недостатком такой подложки является сложная форма базовой линии, в результате чего спектр ГКР ДТНБ оказывается наложенным на собственный спектр комбинационного рассеяния полистирола. Проблема частично решается нормировкой интенсивности основного характеристического максимума ДТНБ на интенсивность выбранного характеристического максимума полистирола. Другим недостатком высушивания раствора наночастиц является неравномерность высыхания капли, сопровождающегося их невоспроизводимой агрегацией. Это регистрировалось при визуальном контроле образцов методом оптической микроскопии.
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0.00 0.05 0.10
0.15 0.20
Б
0.25 0.30 0.35
Рисунок 2. Зависимость интенсивности сигнала раствора наночастиц золота размером 45 нм с иммобилизованным ДТНБ, нанесенного на нитроцеллюлозу, от оптической плотности раствора в максимуме поглощения.
Для создания наноструктур золота обычно проводят напыление золота на выбранную подложку. При этом необходимо учитывать неприменимость некоторых поверхностей вследствие высокого фона (слюда, кремний, стекло) или легкоплавкости напыленного золота (мембраны НуЪопё™, 1ттоЫ1оп™). Однако при нанесении наночастиц золота с иммобилизованным ДТНБ на нитроцеллюлозу с напыленным слоем золота может наблюдаться усиление ГКР на величину до 47%.
Объемный слой золота малой толщины также обладает некоторой способностью к усилению сигнала в спектре ГКР. Как видно из рис. 3, на спектрах присутствует фон, связанный с флуоресценцией, однако он не препятствует регистрации сигнала красителя.
Рисунок 3. Спектры ГКР наночастиц с иммобилизованным ДТНБ, нанесенных на позолоченный пластик путем высушивания раствора наночастиц различной концентрации: голубой - разведение в 10 раз, розовый - разведение в 20 раз, красный - разведение в 50 раз, зеленый - разведение в 100 раз, синий - поверхность без наночастиц.
Еще одним способом усиления сигнала в спектре ГКР является добавление наночастиц золота, не содержащих иммобилизованного красителя. Для элиминации возможного неравномерного распределения наночастиц в объеме образца были изучены несколько вариантов нанесения частиц — последовательное нанесение и использование заранее смешанных растворов. Для последнего случая была использована как необработанная нитроцеллюлоза, так и пропитанная раствором хлорида полидиметилдиаллилам-мония, содержащим 10 мМ КС1. Результаты эксперимента представлены на рис. 4. Из приведенных данных можно ви-
ПЛГ) ТГ) /^тт ПАТТ Т ТП <^ТТ TtlA Т / Г
4.
5.
деть, что наночастицы размером 15 нм не вызывают дополнительного усиления сигнала, однако наночастицы разме- ^ ром 45 нм обладают такой способностью, которая особенно хорошо проявляется при использовании заранее смешанных растворов, так как при этом не происходит вытеснение одних наночастиц другими. В случае если наночастицы с 7 иммобилизованным красителем наносятся первыми, разброс значений интенсивности сигнала многократно возрастает, так как в этом случае статистический процесс их 8. распределения в объеме образца повторяется дважды.
Рисунок 4. Интенсивность сигнала наночастиц золота в спектрах ГКР при их нанесении на нитроцеллюлозу, обработанную (светлые столбцы) и не обработанную хлоридом полидиметилдиаллиламмония (темные столбцы): (1) наночастицы размером 45 нм с ДТНБ и размером 15 нм; (2) наночастицы размером 45 нм с ДТНБ и без него; (3) наночастицы размером 45 нм с ДТНБ, взятые в удвоенной концентрации.
После нанесения наночастиц на образец, обработанный хлоридом полидиметилдиаллиламмония, их красная окраска отчетливо видна. Не обработанные полиэлектролитом образцы после нанесения наночастиц остаются бесцветными. Следовательно, полиэлектролит вызывает не только агрегацию наночастиц, но и их концентрирование.
Таким образом, соединение в объеме одного образца наночастиц размером 45 нм с иммобилизованным ДТНБ и без него приводит к увеличению сигнала, которое, в отличие от простого повышения концентрации наночастиц, содержащих краситель, не сопровождается увеличением разброса значений интенсивности сигнала в различных точках образца. Описанный эффект, связанный с изменением квантовомеханических свойств наночастиц при их объединении в ансамбль, может быть усилен предварительной обработкой образца полиэлектролитом.
Список использованных источников
1. Yonzon C.R., Stuart D.A., Zhang X., McFarland A.D., Haynes C.L., Van Duyne R.P. Towards advanced chemical and biological nanosensors. // Talanta. 2005. V. 67. No. 3. P. 438-448.
2. Garrett N.L., Vukusic P., Ogrin F., Sirotkin E., Winlove C.P., and Moger J. Spectroscopy on the wing: Naturally inspired SERS substrates for biochemical analysis. // J. Biophoton. 2009. V. 2.
Issue 3. P. 157-166. Химические науки
Zhang M.-L., Yi C.-Q., Fan X., Peng K.-Q., Wong N.-B., Yang M.-S., Zhang R.-Q., and Lee S.-T. A surface-enhanced Raman spectroscopy substrate for highly sensitive label-free immunoassay. // Applied Physics Letters. 2008. V. 92. 043116. Song C., Wang Z., Zhang R., Yang J., Tan X., Cui Y. Highly sensitive immunoassay based on Raman reporter-labeled immuno-Au aggregates and SERS-active immune substrate. // Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 25. P. 826-831.
Han X.X., Kitahama Y., Itoh T., Wang C.X., Zhao B., and Ozaki Y. Protein-Mediated Sandwich Strategy for Surface-Enhanced Raman Scattering: Application to Versatile Protein Detection. // Anal. Chem. 2009. V. 81. P. 3350-3355.
Rule K.L. and Vikesland P.J. Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy for the Rapid Detection of Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia.// Environ. Sci. Technol. 2009. V. 43. P. 1147-1152.
Temur E., Boyaci □ .H., Tamer U., Unsal H., Aydogan N. // A highly sensitive detection platform based on surface-enhanced Raman scattering for Escherichia coli enumeration. Anal. Bioanal. Chem. 2010. 397. 1595-1604.
Tamer U., Boyaci □ .H., Temur E., Zengin A., Dincer □.,
Elerman Y. Fabrication of magnetic gold nanorod particles for immunomagnetic separation and SERS application. // J. Nanopart. Res. 2011. V. 13. No. 8. P. 3167-3176.
