CC BY
4
¡гиена и санитария 1/2009
Л ите ратура
1. ГОСТ 51592-2000. Вода. Общие требования к отбору проб. — М., 2000.
2. ГОСТ 51593-2000. Вода питьевая. Отбор проб. -М., 2000.
3. Красовський В. В., Шагун В. Г., Тимченко О. М., Пожил С. I. // Ann. Mechnicov's Inst. — 2005. — N 2. — P. 27-34.
4. Куличенко A. H., Кутырев В. В., Саяпина JI. В. // Тезисы к IV Всероссийской науч.-практ. конф. "Генодиагностика инфекционных заболеваний". — М., 2002. - С.
5. МУ 1.3.1888—04. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III—IV групп патогенности: Метод, указания. — М., 2004.
6. МУК 4.2. 2217—07. Методические рекомендации по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. — М., 2007.
7. Прозоровский С. В., Покровский В. И., Тартаковский И. С. Болезнь легионеров (легионеллез). — М., 1984.
8. Тартаковский И. С., Синопальников А. И. // Клин, микробиол. и антимикроб, тер. — 2001. — Т. 3, № 1. -С. 4-16.
9. Bartlett С. L., Dowel IS. F, Mandell L. А. // Clin. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 31. - P. 347-382.
10. Bergey D. H., Holt J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. — Baltimore, 1984. — Vol. 4.
11. Buesching W. J., Brust R. A., Ayers L. W. Ц J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 17, N 6. - P. 1153-1155.
12. Cianciotto N. P. // Int. J. Med. Microbiol. — 2001. — Vol. 291, N 5. - P. 331-343.
13. Den Boer J. W., Yzerman E. P. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 23, N 12. - P. 871-878.
14. Edelstein P. H. //J. Clin. Microbiol. - 1981. - Vol. 14, N 3. - P. 298-303.
15. Edelstein P. H., Snitzer J. В., Bridge J. A. // J. Clin. Microbiol. - 1982. - Vol. 16, N 6. - P. 1061-1065.
16. Feeley J. C., Gibson R. J., Gorman G. W. et al. I I J. Clin. Microbiol. - 1979. - Vol. 10, N 4. - P. 437-441.
17. Fields B. S., Benson R. F, Besser R. E. // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15, N 3. - P. 506-526.
18. Fox K. F., Brown A. // J. Clin. Microbiol. - 1989. -Vol. 27, N 9. - P. 1952-1955.
19. Health and Safety Commission and Executive, Legionnaire's Disease. The Control of Legionella Bacteria in
Water Systems. Approved Code of Practice and Guidance. - 2000.
20. Helbig J. H., Uldum S. A., Luck P. C., Harrison T. G. // J. Med. Microbiol. - 2001. - Vol. 50, N 6. - P. 509-516.
21. Jimenez-Lucho V., Shulman M., Johnson J. // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32. - P. 3095-3096.
22. Kuiper M. W., Wullings B. A., Akkermans A. D. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, N 11. -P. 6826-6833.
23. Luck P. C., ¡gel L., Helbig J. H. et al. // Int. J. Hyg. Environ. Hlth. - 2004. - Vol. 207, N 6. - P. 589-593.
24. Martinelli F., Caruso A., Moschini L. et al. // Curr. Microbiol. - 2000. - Vol. 41, N 5. - P. 374-376.
25. Monis P. Т., Giglio S., Keegan A. R., Andrew Thompson R. С. Ц Trends Parasitol. - 2005. - Vol. 21, N 7. -P. 340-346.
26. Murdoch D. R. // Clin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 36, N 1. - P. 64-69.
27. RatcliffR. M., LanserJ. A., Manning P. A., Heuzenroeder M. W. I/ J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 6. - P. 1560-1567.
28. Rogers J., Dowsett А. В., Dennis P. J. et al. I I Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol. 60, N 5. - P. 1585-1592.
29. RoigJ., Sabria M., Pedro-Botet M. L. // Curr. Opin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 16, N 2. - P. 145-151.
30. Steinert M., Hentschel U., Hacker J. // FEMS Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 26, N 2. - P. 149-162.
31. Steinert M., Heuner K., Buchrieser C. et al. // Int. J. Med. Microbiol. — 2007.
32. Steinmetz /., Rheinheimer C., Hubnerl., Bitter-Suermann D. Ц J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29, N 2. -p. 346—354.
33. Thacker IV.'L., Plikaytis В. В., Wilkinson H. W. // J. Clin. Microbiol. - 1985. - Vol. 21, N 5. - P. 779-782.
34. Tossa P., Deloge-Abarkan M., Zmirou-Navier D. et al. // BMC Publ. Hlth. - 2006. - Vol. 6. - P. 112.
35. Uzel A., Ucar F, Hames-Kocabas E. E. // APMIS. -2005. - Vol. 113, N 10. - P. 664-669.
36. Wittwer С. Т., Reed G. H., Gundry C. N. et al. // Clin. Chem. - 2003. - Vol. 49, N 6, Pt 1. - P. 853-860.
37. Yanez M. A., Carrasco-Serrano C., Barbera V. M., Catalan V. //Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, N 7. - P. 3433-3441.
Поступила 10.12.07
С Н. В. ДУДЧИК, 2009 УДК 614.72:615.91-07»
Н. В. Дудчик
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБИОТЕСТИРОВАНИЯ ПРИ ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ
ГУ Республиканский научно-практический центр гигиены, Минск, Беларусь
Антропогенное химическое загрязнение окружающей среды — одна из важнейших эколого-гигиенических проблем современности. Высокий уровень химической нагрузки на среду обитания и человека отмечается прежде всего на территориях с развитой энергетической, химической, деревоперерабатывающей и другими отраслями промышленности. По мнению ряда авторов, такие регионы испытывают значительные многофакторные химические нагрузки, что приводит к ухудшению состояния окружающей среды и здоровья населения. Результаты микробиологических, почвенно-экологических, гидробиологических исследований показали критическое значение микробиоты в поддержании экологического
равновесия, обмена веществ в природе, биодеградации химических токсикантов разной природы. Показано, что биохимические, физиологические и генетические свойства про- и эукариотических микроорганизмов позволяют рассматривать их в качестве перспективных альтернативных тест-моделей при разработке системы оценки токсичности и биологического действия потенциально опасных химических веществ или их сложных смесей, а также оценки контаминации объектов окружающей среды. Преимуществами таких методов являются низкая стоимость, получение быстрого ответа на токсическое воздействие, возможность оценки большого числа проб, работа с небольшими объемами проб, портативность,
воспроизводимость результатов, возможность большого выбора тест-организмов. Сформировались и уже достаточно широко используются в литературе термины "мик-робиотестирование" и "микробиотесты" ("микротесты") [1-13].
Биотестирование как метод оценки биологического действия и токсичности объектов среды, химических веществ и их смесей может использоваться при проведении токсикологической оценки промышленных, сточных, бытовых, сельскохозяйственных и других объектов с целью выявления потенциальных источников загрязнения, при проведении оценки степени токсичности отходов, оценке стимулирующего и ингибирующего действия биологически активных добавок на микроорганизмы, выявлении антибиотической активности добавок технологического назначения, выявлении влияния компонентов полимерных материалов на сапрофитную микрофлору, при проведении экологической экспертизы новых материалов, при корректировке и установлении предельно допустимых сбросов веществ, поступающих в окружающую среду и в ряде других исследований.
В качестве критериев индикации токсичности при проведении микробиотестов предложено использовать выживаемость/смертность тест-организмов, особенности роста и накопления биомассы, интенсивность размножения (время генерации клеток, средняя скорость роста), культурально-морфологические изменения отдельных клеток и колоний, активность ряда ферментов и др. [1-13].
В методическом плане оценка токсичности химических веществ, их многокомпонентных смесей, а также объектов окружающей среды представляет сложную аналитическую задачу, для решения которой необходимо учитывать характерные особенности исследуемого объекта. Объекты окружающей среды (сточные воды, растительный материал, пробы почвы и др.) являются одними из наиболее сложных объектов тестирования вследствие многокомпонентное™ химического состава, значительной и многовидовой микробной обсемененности, структурной неоднородности. Проведение тестирования требует отработки, унификации и гармонизации параметров проведения эксперимента практически на всех этапах (подготовка пробы, тестирование на микроорганизмах, оценка полученных результатов), т. е. разработки и стандартизации методов токсикологии при работе с микробными тест-системами.
Цель работы — обоснование методологических подходов для разработки метода определения степени токсичности химических веществ и объектов окружающей среды на основе биотестирования с использованием им-педансной технологии.
Материалы и методы
В работе использовали штамм микроорганизма Azo-tobacter sp.BMM-74; компоненты питательных сред агар, глюкоза, маннит для микробиологических исследований (Россия), карбонат кальция, сульфат магния, хлористый кальций, сульфат железа (III) — х. ч. В работе использовали микробиологический анализатор Bactometer М64 NT и стандартное оборудование микробиологических лабораторий.
Среда AI (на 1000 мл воды): глюкоза 10 г, маннит 10 г, СаС031 г, MgS04 0,2 г, СаС12 0,02 г, FeCl3 0,02 г, pH 7,2-7,4. Для получения плотной среды добавляли 1,5—2% агара. Автоклавирование производили при 12 ГС в течение 20 мин.
Результаты и обсуждение
В настоящее время в лабораторной практике при оценке токсичности наиболее широко используется рос-
товой бактериальный тест. При проведении ростового теста определяют оптическую плотность клеточной суспензии тест-штамма микроорганизма с внесенным анализируемым образцом (контроль) и клеточной суспензии тест-штамма микроорганизма без введения анализируемого образца (опыт), сравнивают полученные данные и оценивают токсическое действие анализируемого образца [6].
Однако оптический принцип детекции роста тест-штаммов микроорганизмов, используемый при проведении ростового бактериального теста, имеет ограничения при анализе непрозрачных, темно-окрашенных, негомогенных образцов, что в значительной степени затрудняет, а в некоторых случаях делает невозможным анализ о&ьектов окружающей среды. Данный способ детекции обладает низкой чувствительностью, что приводит к необходимости длительного времени проведения испытаний.
Ранее было показано, что для оценки токсичности и биологического действия потенциально опасных химических веществ может быть успешно применена детекция параметров роста и развития популяции тест-микроорганизмов в условиях стационарной культуры с использованием импедиметрического микробиологического анализатора [1,2].
Изучение роста тест-микроорганизмов на начальных этапах их развития в стационарной культуре является следствием прямой зависимости численной характеристики популяции от особенностей ее начального роста. Для оценки токсичности целесообразно определение продолжительности лаг-фазы кривой роста тест-штамма микроорганизма.
Для обоснования методологических подходов и разработки метода определения токсичности и биологического действия химических веществ на основе биотестирования с использованием импедансной технологии были отобраны чувствительные штаммы микроорганизмов из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научная коллекция типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института микробиологии HAH Беларуси: Arthrobacter ureafaciens БИМ В-6, Rho-doccus rhodochrous БИМ В-95, Streptomyces griseoviridis БКР В-264.
Разработанный метод определения токсичности и биологического действия химических веществ и объектов окружающей среды основан на определении продолжительности лаг-фазы роста тест-микроорганизмов в условиях стационарной культуры в присутствии изучаемого отхода и без него (контроль) с использованием микробиологического анализатора. Увеличение продолжительности лаг-фазы указывает на токсический эффект изучаемого вещества.
Метод апробирован при определении токсичности разных классов отходов с использованием тест-штамма Azotobacter sp.EHM-74.
Для культивирования штамма Azotobacter sp.BHM-74 использовали среду AI, состав которой предварительно оптимизировали, что позволило использовать среду для получения рабочей культуры тест-штамма и проведения импедиметрических исследований.
Тест-штамм хранили при температуре 5 ± ГС под слоем стерильного вазелинового масла на плотной питательной среде.
Для приготовления рабочих культур штамм отсеивали на питательную среду AI и инкубировали в термостате при оптимальных температурах 28—30°С в течение 24— 48 ч. Культуру тест-штамма суспендировали в физиологическом растворе, используя стандарт мутности на 5 ед. Содержание клеток тест-штамма в инокуляте доводили до 10* КОЕ/мл. При необходимости подтверждение содержания клеток в рабочей культуре проводили путем высева на соответствующие агаризованные среды.
гиена и санитария 1/2009
120 -,
80 -
40 -
—г-12
—г-16
—I-1-г
20 24 28
Типичный график роста Azotobacter sp. БИМ-74 в контроле (1 — без внесения отхода) и опыте (2 — с внесением лигнинсодержащего отхода).
По оси абсцисс — время детекции роста тест-штамма, ч; по оси ординат — электрохимические изменения среды, %.
Изучаемые объекты асептически вносили в приготовленную среду в соотношениях 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:100 и т. д., тщательно перемешивали по всему объему среды.
Объекты со значительной микробной контаминацией стерилизовали автоклавированием при 1 атм в течение 20 мин.
Приготовленную среду разливали в рабочие ячейки модуля прибора по 1,5 мл, инокулировали 0,1 мл рабочей суспензии тест-штамма. Контролем служили ячейки модуля, в которых внесена культуральная среда, не содержащая отходы и инокулированная 0,1 мл рабочей суспензии тест-штамма. Исследования проводили не менее чем в двух повторноетях для каждой концентрации отходов в течение 24 ч.
При проведении выявления токсичности исследуемых объектов предложенным способом основным критерием является регистрация импедиметрических характеристик питательной среды при температуре 28—30°С. Поэтому критическим (принципиальным) моментом является выбор среды культивирования. Основным требованием к среде культивирования является обеспечение качественной кривой роста тест-штамма бактерий, имеющей стабильную базовую линию, выраженную фазу быстрого роста культуры и высокое значение изменений электрохимических показателей среды [1, 2]. Только в этом случае может быть осуществлена регистрация роста тест-штамма, лежащая в основе предложенного метода оценки токсичности и биологического действия химических веществ (см. рисунок).
Оценка степени ингибирования роста тест-штаммов основывается на сравнении параметра времени детекции /¿^(Impedance Detection Time) в контроле (IDTt) и опыте (IDT2), полученных с помощью программного обеспечения бактометра.
Степень ингибирования (I) рассчитывали по формуле:
/= ULLi
IDT2'
Для расчета степени ингибирования берутся средние арифметические значения IDTX и ЮТг не менее чем из двух повторностей.
Согласно результатам проведенных исследований, коэффициент ингибирования /составил 0,9—0,2, что определялось как свойствами образца, так и чувствитель-
ностью тест-штамма. В нескольких модельных экспериментах тестируемые органосодержащие отходы полностью ингибировали рост тест-штаммов микроорганизмов.
Таким образом, чувствительность метода позволяет надежно определить степень токсичности образца. Исследование может быть дополнено изучением культу-рально-морфологических изменений отдельных клеток и колоний микроорганизма. Разработанный метод может быть рекомендован для определения токсичности отходов разных классов при осуществлении мониторинга и контроля токсичности промышленных отходов.
Применение принципов импедансной технологии является весьма перспективным при разработке экспресс-методов определения токсичности и биологического действия химических веществ и объектов окружающей среды путем тестирования на чувствительных штаммах микроорганизмов в режиме реального времени. Возможна разработка принципиальных схем проведения тестирования, которые могут служить основой для модификации с использованием различных тест-микроорганизмов в зависимости от цели исследования и выполняться как в количественном, так и в качественном вариантах. Основными критериями при проведении теста предложено использовать такие объективные показатели, как время детекции, а также график изменения электрохимических показателей при росте тест-микроорганизмов.
Заключение
Используемый в настоящее время бактериальный ростовой тест весьма длителен, на результаты теста могут существенным образом влиять возможные механизмы адаптации тест-культур к за1рязнению, поэтому он не дает однозначных результатов. Нами предложен импеди-метрический метод оценки токсичности химических веществ с использованием тест-штамма Azotobacter sp.BHM-74. Разработанный метод апробирован при определении токсичности разных классов отходов. Для оценки токсичности предложено использовать коэффициент /, определяющий степень ингибирования скорости роста тест-штаммов, и формула для его расчета. Преимуществами импедиметрических методов являются низкая стоимость, получение быстрого ответа на токсическое воздействие, возможность оценки большого числа проб, работа с небольшими объемами проб, воспроизводимость результатов, а также возможность выбора тест-организмов.
J1 итература
1. Дудчик Н. В. // Здоровье и окружающая среда: Сборник науч. трудов. Вып. 5. ГУ Республиканский на-уч.-практ. центр гигиены / Под ред. С. М. Соколова. — Барановичи, 2005. — С. 138—143.
2. Дудчик Н. В.. Мельникова JI. А., Котеленец А. И., Клочкова О. П. // Материалы 4-го Международного конгресса по управлению отходами Вэйс Тэк-2005, Москва, 31 мая — 3 июня 2005. — С. 66—67.
3. Еськов А. П., Каюмов Р. И., Соколов А. Е. // Токси-кол. вестн. — 2003. — № 5. — С. 25—28.
4. Смурое А. В. // Экологическая диагностика: Сборник научных трудов / Под ред. В. В. Клюева. — М., 2000. - С. 391-404.
5. Тарасов В. Н. // Успехи соврем, естествознания. — 2003. - № 3. - С. 91-92.
6. Холоденко В. П., Чугунов В. А., Жиглецова С. К. и др. // Рос. хим. журн. - 2001. — Т. 45, № 5-6. -С. 135-141.
7. Alexander M. // Environ. Sei. Technol. — 2000. — Vol. 34. - P. 4259-4265.
8. Eismann F., Montuelle B. // Rev. Environ. Contain. Toxicol. - 1999. - Vol. 159. - P. 41-93.
9. Но К. Т. // Pollut. Bull. - 2002. - Vol. 44, N 4. -P. 286-293.
10. Lappalainen J. // Chemosphere. - 1999. - Vol. 38. — P. 1069-1083.
11. Markwiese J. T. // Rev. Environ. Contam. Toxicol. — 2001. - Vol. 168. - P. 43-98.
12. Tauriainen S. // Biosens. Bioelectron. — 1998. — Vol. 13, N 9. - P. 931-938.
13. Ulitzur S., Lahav Т., Ulitzur N. A novel and sensitive test for rapid determination of water toxicity // Environ. Toxicol. J. - 2002. - Vol. 17, N 3. - P. 291-296.
Поступила 09.10.07
Методология и практика социально-гигиенического мониторинга
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2009 УДК 614.7:616-058
Ю. И. Мусийчук, О. П. Ломов, В. М. Кудрявцев
ЭКСПЕРТИЗА ЗНАЧИМОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ОБЩЕСТВЕННОГО ЗДОРОВЬЯ
Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург
Под общественным здоровьем понимается интегральное состояние здоровья всех индивидуумов популяции, отражающее физическое, психическое и социальное благополучие (или неблагополучие) людей, осуществляющих свою жизнедеятельность в рамках какой-либо общности (например, социальной, профессиональной, территориальной и др.). Особенно актуально изучение общественного здоровья в России в связи с критическим состоянием, ведущим к депопуляции нации, что является угрозой жизненно важным национальным интересам.
Несмотря на меры, предпринимаемые на государственном уровне, остаются серьезные проблемы в сфере здравоохранения и области санитарно-эпидемиологического благополучия. Сравнительная оценка уровня общественного здоровья актуальна в связи с необходимостью выделения некоторых регионов страны в зону повышенного контроля и проведения соответствующих мероприятий (принятия управленческих решений). Одним из реальных механизмов управления состоянием общественного здоровья в настоящее время является социально-гигиенический мониторинг. О некоторых проблемах его реализации на уровне субъектов федерации мы уже писали на страницах этого журнала [2].
Учитывая многофакторность понятия "общественное здоровье", в настоящее время продолжаются попытки его интегральной оценки [1,6]. Нами разработан методологический подход к комплексной оценке состояния здоровья населения при проведении социально-гигиенического мониторинга. Он основан на интегральных показателях состояния здоровья населения, рассчитываемых по значениям объединенных в группы частных показателей и заданным пороговым уровням их оценки [3]. Проанализирован опыт реализации данного метода при комплексной оценке состояния здоровья населения Санкт-Петербурга на примере уровня заболеваемости населения некоторых районов города (4]. Для расчета обобщенных показателей состояния здоровья населения
Таблица 1
Шкала значимости показателей
Лингвистическая оценка
Оценка в баллах
Очень большая важность Большая важность Существенная важность Несущественная важность Важность очень мала
9 или 10 7 или 8 5 или 6 3 или 4 1 или 2
использовали линейную свертку взвешенных оценок частных показателей. При этом полагали, что вес (значимость) соответствующего частного показателя в оценке обобщенного может определяться в результате экспертизы (экспертного оценивания), состоящей из ранжирования частных показателей по степени их влияния на значение обобщенного показателя.
При обсуждении с экспертами в области организации здравоохранения, токсикологии, гигиены и других профилактических дисциплин результатов применения данного метода к системе указанных показателей высказывались разные мнения относительно значимости частных показателей здоровья населения при расчете обобщенных. Это, по-видимому, связано с особенностями субъективного восприятия экспертами сущности показателей, обусловленного учетом ими множества факторов (см., например, [5]).
Для объективного анализа мнений экспертов по данному вопросу нами разработана методика определения значимости отдельных показателей общественного здоровья, объединенных в группы, и значимости указанных групп. Объектом исследования являлась система из 50 показателей общественного здоровья населения, объединенных в 5 групп [3]: демографические (10 показателей), экологические (12), экологически обусловленные (6), общей заболеваемости, в том числе социально-обусловленной (11), социально-экономические (11). Экспертам предлагали в соответствующих анкетах оценить уровень значимости каждого показателя в группе частных показателей, а также группы показателей в целом с использованием порядковой шкалы, представленной в табл. 1.
В анкетировании приняло участие 29 экспертов Санкт-Петербурга (кандидаты и доктора медицинских наук, врачи высшей квалификации). На основе получен-
Таблица 2
Оценка значимости групп частных показателей
Группа
Оценка (М ± т)
Вес
Демографические показатели 8,6 ± 1,8 0,22 Экологические показатели 7,1 ± 1,6 0,18 Экологически обусловленные показатели здоровья населения 7,5 ±1,7 0,19 Показатели общей заболеваемости, в
том числе социально-обусловленной 8,3 ± 1,9 0,21
Социально-экономические показатели 8,1 ± 1,6 0,2
