CC BY
65
© БАКШЕЕВА С.С.
УДК 575.191:616.211:614.87
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА RAPD - ПЦР ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ S. AUREUS, КОЛОНИЗИРУЮЩИХ СЛИЗИСТУЮ ОБОЛОЧКУ НОСА У ДЕТЕЙ,
НАХОДЯЩИХСЯ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОГО ПРЕССИНГА
С. С. Бакшеева
Красноярский государственный медицинский университет им. проф.
В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; НИИ
эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, директор - академ.
РАМН А. Л. Гинцбург.
Резюме. В статье представлены результаты молекулярногенетического титрования штаммов Staphylococcus aureus, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа у детей, посещавших одну общеобразовательную школу. Показано, что большее количество геновариантов штаммов S. аигеш (65%) имеют высокую степень сходства штаммов, что свидетельствует об их родственном происхождении.
Ключевые слова: S. aureus, молекулярно-генетические методы, дети.
Бакшеева Светлана Сергеевна - к.б.н., доцент кафедры микробиологии КрасГМУ; е-mail: dixi-1972@ya.ru.
Аветисян Лусине Ремуальдовна - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи; е-mail: lusavr@mail.ru.
Чернуха Марина Юрьевна - д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи; е-mail: chernukha@gamaleya.org.
В последние годы в разных областях микробиологии и эпидемиологии широко используются молекулярно-генетические методы, которые в отличие от фенотипических методов исследования, основанных на выявлении фенотипических признаков, экспрессируемых генами микроорганизмов, представляют собой исследование структуры ДНК. Возможности методов, изучающих фенотипические признаки микроорганизмов (бактериологические, биохимические, серологические и др.), ограничены вследствие способности микроорганизмов изменять экспрессию соответствующих генов в ответ на влияние различных факторов окружающей среды. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, молекулярно-генетические методы отличаются универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации и высокой воспроизводимостью. Эти методы, благодаря своей высокой чувствительности и специфичности, в сочетании с традиционными методами, открывают новые возможности для исследования свойств, источников и путей передачи разных возбудителей [1,3,4]
Цель исследования: изучение генетическое разнообразие штаммов Staphylococcus aureus , колонизирующих слизистую оболочку носа у детей, находящихся в условиях техногенного прессинга.
Материалы и методы
Изучено 20 штаммов Staphylococcus aureus, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа у детей 7 -11 лет, посещавших одну общеобразовательную школу, расположенную в экологически неблагополучном районе города Красноярска.
Выделение и идентификацию стафилококков проводили общепринятыми методами [2]. При определении видовой принадлежности штаммов использовали микротесты фирмы «Lachema» (Чехия»).
Генотипирование штаммов золотистого стафилококка проводили с целью более точного субвидового типирования и определения степени генетического родства (выявление клональности) штаммов, выделенных от резидентных бактерионосителей - детей, проживающих в экологически неблагополучном районе. Генотипирование проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером, размером 10 нуклеотидов Sh1 (Short 1) - AATCGGGCTG («Синтол»), имеющим хорошую разрешающую способность [5].
Построение дендрограммы проводили с помощью программного обеспечения TreeCon for Windows v.1.3. b на основе метода невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages) с использованием коэффициента генетического различия между двумя кластерами вычисляется как среднее расстояние между всеми парами объектов в них [5].
Результаты и обсуждения
В результате типирования была получена электрофоретическая картина RAPD-ПЦР 20 штаммов S. Aureus (рис.1), на основе которых была построена дендрограмма (рис.2) с помощью программного обеспечения TreeCon. Установлено наличие 6 генотипов среди исследованных 20 штаммов S. aureus.
Общепринято, что если показатель степени генетического родства равно
0,8 и выше, то это характеризует высокую степень генотипического сходства исследуемой выборке штаммов, если 0,6-0,8 - умеренно; 0,4-0,6 -низкий; если сравниваемые штаммы имеют показатель ниже чем 0,4, то фактически они являются генотипически не родственными.
М 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К+ М
Рис. 1. RAPD-ПЦР штаммов S. aureus, выделенных от детей, проживающих в условиях техногенного прессинга.
В 1 генотип входили 8 штаммов под № 13,18,7,9,5,4,3,1 (индекс генетического сходства 1). В результате амплификации образовалось 9 ампликонов длиной от 300 до 1500 нп (нуклеатидные пары) и выше.
У штаммов, относящихся ко 2 генотипу (№2 16,17,19,11,14) при изучении электрофоретических профилей выявлены 6 ампликонов, длиной от 400 до 1500 нп и выше (гомология 100%).
В 6 генотип входили 4 изолята (№2 6,8,10,15), которые образовали по 6 ампликонов длиной от 500 до 1500 нп и выше.
Степень генетического родства у 1 и 2 генотипов составляет 85 % (то есть высокая степень генетического родства). У 3 генотипа степень генетического родства с 1 и 2 генотипами составляет 40 % (низкая степень родства).
Как видно из дендрограмм, большее количество геновариантов штаммов S. aureus (65%) имеют высокую степень сходства штаммов, что свидетельствует об их родственном происхождении. Это позволяет предположить, что источником распространения золотистого
стафилококка в данном детском коллективе являются один-два ребенка бактерионосителя. При этом имеет место воздушно-капельный путь
передачи инфекции. Данная закономерность может быть использована в целях профилактики распространения воздушно-капельных инфекций в организованных детских коллективах (выявление и санация носителей).
Рис. 2. Дендрограмма штаммов S. aureus.
Таким образом, молекулярно-генетические методы, основанные на амплификационной технологии (RAPD-ПЦР), позволяют эффективно решать задачи по молекулярно-генетическому типированию штаммов золотистого стафилококка, выделенных от резидентных бактерионосителей, с целью установления уровня их внутривидовых вариаций.
RAPD-PCR FOR GENOTYPING S.AUREUS, WHICH COLONIZING NASAL MUCOSA IN CHILDREN UNDER TECHNOGENIC LOAD
S.S. Baksheeva
Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-
Yasenetsky
Abstract. The paper presents molecular and genetic typing of Staphylococcus aureus form mucosa of frontal nasal cavity in children form single school. It was found out that the most strain’s genotypes of S. aureus (65%) had a high similarity, giving evidence about their relative origin.
Key words: S. aureus, molecular and genetic methods, children
Литература
1. Аветисян Л.Р. Эпидемиологические и
микробиологические аспекты колонизации кишечника детей первого года жизни условно-патогенными микроорганизмами: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2008. - 22с.
2. Справочник по микробиологическим и
вирусологическим методам исследования / Под ред. М.О. Биргера. - М., 1982. - С. 125-129.
3. Шагинян И. А., Тарасевич И.В. Молекулярная
эпидемиология: предмет, цель и задачи новой науки // Матер. 1Х съезда Всероссийского научно-практического общества
эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2007. - Т.-1. - С.41-42.
4. Шагинян И.А., Першина М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций //Журн. микробиол. -1997. - № 4. - С. 54-59.
5. Lee W. Riley. Molecular epidemiology of infectious diseases. Principles and pratices // ASM Press. - 2004. - № 5. - P. 106-112.
