CC BY
112
обзор литературы
УдК 616.9-022.369-078:575
молекулярно-генетические исследования в лабораторной диагностике и мониторинге возбудителей госпитальных инфекций
М. В. Кузнецова12, Е. Г. Плотникова2, Т. И. Карпунина', Э. С. Горовиц',
В. А. Демаков2
'Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, 2Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь
В статье представлена значимость использования молекулярно-генетических методов в лабораторной диагностике и мониторинге возбудителей гнойно-септических инфекций. Охарактеризованы наиболее востребованные технологии и приведены примеры возможности их использования для идентификации изолятов, определения факторов патогенности и детерминант антибиотикорезистентности бактерий. Подчеркивается, что в эпидемиологической практике наряду с традиционным фенотипиче-ским анализом обязательным является использование методов молекулярного типирования.
Ключевые слова: госпитальные инфекции, генетические методы, молекулярная эпидемиология.
В последние десятилетия внутриболь-ничные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), приобретают все большую актуальность, что обусловлено их широким распространением и возрастающей социально-экономической значимостью [21, 24]. Система микробиологического мониторинга является одним из существенных звеньев в изучении госпитальных инфекций. Она включает сравнительный динамический анализ данных бактериологического обследования пациентов, персонала и объектов внутрибольничной среды, при котором решающее значение отводится эпидемиологически значимым свойствам изолируемых микроорганизмов: степени патогенности и антибиотикочувствительности [11, 16]. Принципиально важным аспектом таких исследований является контроль формиро-
вания и распространения госпитальных штаммов, способных к длительной персис-тенции в условиях стационара, становясь фактором риска внутрибольничного инфицирования. Традиционные методы идентификации и типирования возбудителей гнойно-септических инфекций (ГСИ) базируются на изучении фенотипических характеристик изолятов. Учитывая широкое представительство УПМ в составе нормофлоры человека и их убиквитарность, такой подход далеко не всегда позволяет адекватно решать поставленные задачи. Так как геном бактерий представляет собой наиболее фундаментальный «элемент идентичности» клеток, в последние годы наблюдается тенденция к более широкому привлечению молекулярно-генетиче-ских методов для определения источника и степени родства изучаемых штаммов.
Использование этих методик позволяет не только точно идентифицировать изоляты, но и определять специфичные факторы пато-генности, выявлять детерминанты антибио-тикорезистентности, проводить внутривидовое типирование штаммов [8]. Молекулярные технологии сегодня — это комплекс высокоспецифичных тестов, основанный на использовании различных методологических подходов, отличающихся по технологии обработки дНК. Кратко остановимся на основных направлениях и наиболее востребованных технологиях генетического анализа.
Идентификация возбудителей ГСИ.
Наиболее простой и востребованной молекулярной технологией идентификации возбудителей ГСИ в настоящее время считается полимеразная цепная реакция (ПЦР) [10]. Принцип метода заключается в обнаружении небольшого фрагмента дНК (несколько сот пар оснований), специфичного только для данного микроорганизма. В основе ПЦР лежит природный процесс: репликация дНК — комплементарное достраивание дНК-матрицы, осуществляемое с помощью фермента дНК-полимеразы. В результате автоматической регуляции температурного режима в термоциклере происходит экспоненциальное увеличение количества копий (амплификация) специфического фрагмента дНК (если искомый возбудитель присутствует в образце), которое может быть детектировано методом электрофореза или непосредственно в реакционной пробирке при использовании флюоресцентных «маркеров» для ПЦР «в реальном времени» («RealTime PCR»).
ПЦР осуществляют с использованием праймеров, комплементарных специфической последовательности дНК, встречающейся только у определенного вида микроорганизмов. Такой подход используют для детекции одного из основных возбудителей
ГСИ хирургических и акушерских стационаров — Staphylococcus aureus. Коагулаза продуцируется всеми штаммами золотистого стафилококка и определение этого белка является принципиальным клинико-микробиологическим критерием для его идентификации [37]. Молекулярно-диагно-стический набор, предложенный Государственным научным центром Российской Федерации «ГосНИИгенетика», основанный на амплификации полиморфного участка (З'-повторяющиеся элементы), находящегося в кодирующей части гена коагулазы (позиции 1513—2188), может быть использован для выявления коагулазоположительных штаммов S. aureus (www.tapotili.ru).
Вторым по важности этиологическим агентом стафилококковых инфекций человека является S. epidermidis. В ряде исследований продемонстрирована успешная идентификация ДНК S. epidermidis из различных клинических образцов методом ПЦР, и этот метод диагностики в настоящее время можно рекомендовать в качестве быстрого и эффективного теста для рутинного использования [44]. Идеальной «мишенью» для выявления стрептококков группы А оказался ген mf стрептококкового митогена, не имеющий значительной гомологии с известными стрептококковыми генами и являющийся специфическим «маркером» только этой группы бактерий [46]. В России разработана тест-система «ДиаГен-GAS» для выявления дНК стрептококков группы А методом ПЦР, которая разрешена к использованию в лабораторной практике (приказ МЗ РФ № 213, прил. 2, от 14.06.2000 г.) [14]. Также показана возможность использования ПЦР при идентификации культур стрептококков группы А, основанная на определении генов (speA, speB, speC), кодирующих их токсины [36]. Детектировать S. pneumoniae можно путем амплификации видоспецифичного консерватив-
ного участка, кодирующего транспептидазу (pbp2B) [32].
Помимо стафилококков и стрептококков существенную роль в этиологии ГСИ играют грамотрицательные бактерии. Для выявления Pseudomonas aeruginosa предложены прай-меры детекции algD-гена, кодирующего GDP-дегидрогеназу, участвующую в продукции альгината у этого вида бактерий [41]. Возможна одновременная амплификация («multiplex-PCR») генов oprI и oprL, экс-прессирующих синтез двух липопротеи-нов наружной мембраны, маркирующих P. aeruginosa [30]. На сегодняшний день успешно используются специфические прай-меры и к такому проблемному «неферментеру», как Acinetobacter baumannii [29].
Чаще для идентификации возбудителей ГСИ используют универсальные прай-меры, которые позволяют амплифициро-вать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы (Pseudomonas, Klebsiella и др.). Мишенью для ПЦР в этом случае, как правило, являются рибосомные гены (гены 16S и 23S рРНК), которые имеют сходную структуру у различных прокарио-тических микроорганизмов. Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет выявлять ДНК большинства видов бактерий [10, 25, 33, 35, 39].
Для детекции патогенных грибов, например рода Candida или Aspergillus, предложены праймеры к генам 18S и 28S рРНК [45]. Для более точной идентификации возбудителей проводится анализ секвенированных нуклеотидных последовательностей, ампли-фицированных с помощью как специфических, так и универсальных праймеров. Анализ осуществляется с использованием международных баз данных GenBank (http:/www.ncbi. nlm.nih.gov), EzTaxon (http://www.eztaxon.org),
а также ряда компьютерных программ, например аШШ № [47], TREECON [49].
Методы, разработанные на основе ПЦР, представляют особый интерес для идентификации труднокультивируемых и некульти-вируемых возбудителей инфекционных заболеваний. Кроме того, ПЦР успешно применяется для идентификации возбудителей ГСИ в больничной среде, так как бактериологический метод, используемый для этого (приказ МЗ РФ № 345 от 26.11.97 г.), может быть неэффективным из-за низкой концентрации возбудителя или формирования им биопленок, атипичных покоящихся форм, не выявляемых традиционными культуральными методами.
Выявление факторов патогенности возбудителей ГСи. Изучение и выявление генетических детерминант вирулентности, наличие которых позволяет сделать вывод о потенциальной патогенности возбудителя ГСИ, также возможно с помощью ПЦР. В настоящее время сериновые протеазы, определяющие способность возбудителей инакти-вировать защитные антитела, обнаружены у многих представителей УПМ. Разработана ПЦР-тест-система для индикации iga-vена, кодирующего протеазу у бактерий различных таксономических групп. Авторы считают, что выявление sIgA-протеазы может быть использовано для прогностической оценки патогенетической значимости госпитальных штаммов [1]. Определены генетические маркеры патогенности условно-патогенных эн-теробактерий: гены ЫуА, ЫуВ, кодирующие гемолизины, sfaG-vен — фимбриальный антиген типа S, спД -ген — цитотоксический некротизирующий фактор, estВ-ген — термостабильный энтеротоксин В, легко выявляемые в ПЦР [6]. Наличие этих генов может свидетельствовать о высоком вирулентном потенциале данных штаммов без проведения сложных биологических проб. У клиниче-
ских изолятов Klebsiella pneumoniae обнаружены гены, контролирующие адгезию возбудителя (papC, papH, sfaG, sfaA, eaeA, fimA-ге-ны), размножение в тканях (г'^-ген) и продукцию токсинов (cnfl, ehx, hly, stx2--гены). Исследователи полагают, что праймеры к этим генам перспективны для детекции некоторых факторов патогенности и у других кишечных бактерий [2, 19].
Разработана генетическая идентификация факторов патогенности как способ диф-ференцировки патогенных и симбиотиче-ских штаммов энтерококков. У клинических изолятов Е. faecalis и Е. faecium определяются гены, контролирующие синтез поверхностных белков, участвующих в процессе адгезии и инвазии, — Esp, Asal, EfaA; цитолизинов — CylA, CylM; желатиназы — GelE; сериновой протеиназы — SprE и феромона — FsrB [3]. Предложено использовать ПЦР для детекции генов, детерминирующих синтез коагулазы, энтеротоксинов A, B, C и токсина синдрома токсического шока у S. aureus [4, 5]. Разработаны праймеры для выявления cepl- и cepR-генов, являющихся компонентами регулятор-ной системы «Quorum sensing», ответственной за экспрессию факторов патогенности B. cepacia [20].
выявление лекарственной устойчивости возбудителей ГСи. Глобальной проблемой современной клинической практики является повсеместный рост устойчивости возбудителей госпитальных инфекций к хи-миопрепаратам. В последнее время методы на основе ПЦР все чаще используются для выявления антибиотикорезистентности отдельных видов. Примером эффективных разработок в данной области может служить использование ПЦР для выявления гена mecA, кодирующего белок, синтез которого обусловливает устойчивость к метициллину и всем другим бета-лактамным антибиотикам у стафилококков. Так, в случае получения
сомнительных результатов при использовании фенотипического отбора метициллин-резистентных золотистых стафилококков (МРСА) предложено определение гена mecA методом ПЦР, признанным в настоящее время «золотым стандартом» для идентификации МРСА [27, 38].
Среди большого круга проблем, связанных с резистентностью к антибиотикам госпитальной микрофлоры, наиболее значимой является полирезистентность ряда грамотри-цательных бактерий, обусловленная синтезом этими бактериями бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) [15, 18]. Одним из основных классификационных критериев данных ферментов является характер локализации генов, кодирующих эти белки: хромосомный или в составе подвижных генетических элементов (плазмид и транспозонов). Его определение имеет большое практическое значение в связи с тем, что локализация генов бета-лактамаз на мобильных носителях приводит к быстрому распространению последних среди клинически значимых микроорганизмов [22].
Для выявления известных бета-лактамаз ПЦР используется в качестве самостоятельного диагностического метода, либо с привлечением дополнительных методов анализа соответствующих ПЦР-продуктов (ПЦР-ПДРФ — полиморфизм длины рестрик-ционных фрагментов ДНК; ПЦР-SSCP — кон-формационный анализ одноцепочечных фрагментов ДНК). Предложены праймеры для детекции генов бета-лактамаз класса А (ТЕМ, SHV, CTX) и класса С (DHA, FOX, CMY и ACT-1) [17]. Представлен метод диагностики и типирования бета-лактамаз расширенного спектра СТХ-М-типа, основанный на использовании ПЦР с праймерами, позволяющими амплифицировать внутренние фрагменты генов всех известных в настоящее время ферментов данной группы. С по-
мощью последующего анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ПЦР-продуктов определяется принадлежность выявленных СТХ-М к одному из четырех основных генетических субтипов [23].
Если для семейства энтеробактерий особую значимость имеют бета-лактамазы классов А и С, то неферментирующие грамотри-цательные бактерии чаще всего становятся продуцентами бета-лактамаз класса В. Ферментная инактивация карбапенемов может реализовываться с помощью металло-бета-лактамаз пяти групп (VIM, IMP, SPM, GIM и SIM); наиболее распространены типы VIM и IMP. Праймеры ко всем описанным группам предложены и с успехом используются во всем мире [42].
Механизмы антибиотикорезистентности бактерий сложны и разнообразны. Предложены ПЦР-тест-системы для детекции не только генов, контролирующих синтез ферментов, инактивирующих антибиотики (лак-тамазы, трансферазы и др.), но и позволяющие идентифицировать элементы эффлюкс-систем, отвечающих за выведение антибиотика из клетки (тетрациклина — белки TetA-TetE, TetK, TetL грамположительных и грамотрицательных бактерий; макролидов — система, кодируемая те/-геном, распространенная среди S. pneumoniae, S. pyogenes и др.), детерминанты устойчивости к ванкомицину энтерококков (гены vanA и vanB) и другие.
генотипирование возбудителей гСи. Сегодня молекулярно-генетический анализ широко используется для субвидового типи-рования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, что особенно ценно при проведении эпидемиологических исследований [10]. Только при установлении высокой степени сходства нуклеотидных последовательностей генома нескольких изолятов при одной эпидемической вспышке можно с уве-
ренностью утверждать, что возникшая вспышка была вызвана генетически идентичными штаммами и, скорее всего, имела общий источник и факторы передачи возбудителя инфекции [21]. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипирование) генотипи-рование отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью [10].
Методы на основе ПЦР [13]:
1. Методы, основанные на амплификации ДНК с произвольными (длиной от 10 до 20 нуклеотидов) праймерами — RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) [31] и AP-ПЦР (Arbitrarily Primed PCR) [28, 52]. ПЦР осуществляется при «расслабляющих» условиях (низкой температуре отжига праймеров), при которых праймер произвольно связывается с хромосомными последовательностями в двух различных участках инвертированных повторов, создавая продукты (ампликоны), которые могут анализироваться в агарозном геле после электрофоретического разделения.
2. Методы, в основе которых лежит использование праймеров, комплементарных консервативным повторяющимся последовательностям в ДНК — REP-ПЦР, BOX-ПЦР и ERIC-ПЦР [34, 51]. Данные последовательности присутствуют во многих копиях практически во всех геномах бактерий, а их расположение может варьировать от штамма к штамму. Методы широко используются для выявления идентичных (близких) штаммов микроорганизмов, сходных по культураль-нам характеристикам и изолированных из одного источника.
3. Методы, объединяющие ПЦР и рест-рикционный анализ ДНК. Эти методы можно использовать для анализа рестрикционных фрагментов определенных генов — RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism, ПДРФ), ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, рестрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК) [50], или целого генома — AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism — полиморфизм длины амплифицированных рестрик-ционных фрагментов ДНК) [26]. Например, метод ПЦР-ПДРФ активно применяется за рубежом для типирования S. aureus путем анализа гена, кодирующего коагулазу [37].
С помощью вышеперечисленных методов выявляется степень генетического родства исследуемых штаммов, которая определяется путем сравнительного анализа количества и размера амплифицированных фрагментов индивидуальных электрофоре-тических профилей, проводимого визуально или с применением компьютерных программ, например TREECON [49], Quantity One 4.6 (Bio-Rad Laboratories, США).
Методы генотипирования, не связанные с амплификацией ДНК. Генетическое типирование («маркировка») штаммов возбудителей ГСИ может осуществляться другими методами, без применения ПЦР. Так, анализ плазмидных профилей является примером «первого поколения» методологических приемов молекулярной эпидемиологии. Сравнение плазмидного профиля изолятов, полученного при рестрикционном анализе плазмид (РАП), эффективно используют и сегодня в эпидемиологической оценке патогенных энтеробактерий («плазмидный фир-герпринтинг») [43]. Плазмидный анализ возбудителей ГСИ применим только для плазми-доваров и в ограниченный промежуток времени (возможна потеря экстрахромосомных элементов) [21, 48].
Наиболее популярным методом геноти-пирования в настоящее время является пульс-электрофорез (ПЭ). Это метод фракционирования высокомолекулярных ДНК (от
10 тыс. п. н. до 10 млн. п. н.) с помощью электрофореза в агарозном геле в условиях периодически меняющегося по направлению («пульсирующего») электрического поля. В настоящее время этот метод стал одним из ключевых инструментов современной ге-номики, поскольку он дает возможность манипулировать ДНК целых хромосом, мега-плазмид или их протяженных участков [12]. Ферментативная обработка эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) тотальной клеточной дНК приводит к созданию набора фрагментов разного размера, которые могут быть разделены и сравнены при электрофо-ретической разгонке в агарозном геле. Ред-кощепящие рестриктазы, узнающие последовательность из 8 п. н. (N0^ Sfй и др.), гидро-лизуют дНК с образованием очень крупных фрагментов, которые удается разделить только с помощью ПЭ. Результаты исследований показали высокую разрешающую способность ПЭ, а в ряде случаев — его преимущество в сравнении с большинством фено- и генотипических методов. Создание банка данных профилей макрорестрикции, полученных с помощью этого метода для всех микроорганизмов, обеспечивает понятие «глобального» хромосомного мониторинга [40].
Необходимо подчеркнуть, что молеку-лярно-генетические методы не могут заменить методы «классической бактериологии», которые совершенно правомерно используются в рутинной лабораторной диагностике ГСИ. Однако в сложных, «арбитражных» случаях, когда определить вид микроорганизма традиционными методами не представляется возможным, значение молекулярных технологий трудно переоценить. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют также о том, что прогнозирование клинической эффективности антимикробных препаратов на основе оценки антибио-
тикофенотипа менее эффективно, чем ее прогнозирование на основе определения набора детерминант резистентности этиопато-генов. Более того, в задачи молекулярно-ге-нетического анализа может входить оценка распространенности высокоустойчивых, например, БЛРС-изолятов в лечебном учреждении, что позволит организовать в нем более рациональное назначение антибактериальных препаратов. Наконец, на современном этапе развития мировой медицинской практики обязательным является использование методов молекулярного типирования в эпидемиологическом анализе как при расследовании локальных вспышек ГСИ, так и для постоянного мониторинга УПМ, циркулирующих в конкретных стационарах. Создание компьютерных баз «генетических портретов» проблемных возбудителей из различных лПУ региона поможет эпидемиологам вовремя обнаружить появление госпитальных штаммов, проследить за их распространением. Обобщение таких данных, выявление формирующихся тенденций на региональном уровне способствуют своевременной профилактике ГСИ и повышению эффективности проводимых мероприятий.
Несмотря на то, что молекулярные методики требуют соответствующей квалификации и оборудования, они имеют много преимуществ и уже широко используются в современной клинико-эпидемиологической практике. В крупных городах России, в том числе и в г. Перми, возникло немало диагностических центров (в большинстве своем коммерческих), применяющих ПЦР-анализ главным образом для детекции возбудителей инфекций, передающихся половым путем, и вирусов. Однако колоссальные возможности, которые открываются с использованием молекулярно-генетического анализа, используются недостаточно, в лучшем случае с научными целями.
Интересный опыт накоплен под руководством и при участии ведущих специалистов Пермского края в области медицинской микробиологии в диагностике хламидийной и микоплазменной, герпес-, папиллома-вирусной и ВИЧ-инфекций. Исключительно важным шагом в мониторинге ГСИ явилось создание в 2009 г. в г. Перми референс-лабо-ратории, высокопрофессиональные врачи-бактериологи которой владеют фенотипи-ческими методами идентификации и дифференциации бактерий. В сотрудничестве со специалистами кафедры микробиологии и вирусологии ПГМА и лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН был выполнен ряд исследований, которые подтвердили целесообразность и эффективность комплексного подхода с привлечением как традиционных бактериологических, так и моле-кулярно-генетических методов в решении задач диагностики внутрибольничных инфекций и проведении мониторинга возбудителей ГСИ [7, 8, 9].
Создание условий для обучения персонала, рационализация использования и развитие материально-технической базы для проведения разноплановых молекулярно-гене-тических исследований являются насущной необходимостью для бактериологической службы Пермского края.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Агапова О. В. Протеаза, гидролизующая секреторный иммуноглобулин как фактор патогенности бактерий/О. В. Агапова, В. М. Бондаренко//Матер. VIII Всерос. съезда эпидемиол., микробиол. и паразитол.: сб. статей. В 4-х т.— М.: ООО «Росинэкс», 2002.- Т. 3.— С. 130—131.
2. Бондаренко В. М. Клебсиеллы и клеб-сиеллезы/В. М. Бондаренко, С. В. Фиалкина, О. В. Агапова.— Тверь: Триада, 2008.— 160 с.
3. Вершинин А. Е. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков/А. Е. Вершинин, В. В. Колоджиева, Е. И. Ермоленко и др./Журн. микробиол.— 2008.— № 5.— С. 83—86.
4. Дмитренко О. А. Молекулярно-генети-ческие аспекты эпидемиологии внутри-больничных инфекций, вызванных представителями вида Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину/оксацил-лину: автореф. дис. ... д-ра мед. наук/ О. А. Дмитренко.— М., 2008.— 43 с.
5. Дмитренко О. А. Определение генов пирогенных токсинов суперантигенов у клинических изолятов метициллин-резистентных Staphylococcus aureus/ О. А Дмитренко, В. Я. Прохоров, И. А. Ша-гинян и др.//Журн. микробиол.— 2006.— № 2.— С. 36—42.
6. Жеребцова Н. Ю. Генетические маркеры патогенности условно-патогенных эн-теробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях/Н. Ю. Жеребцова, А. Х. Байми-ев, Д. А. Валишин, А Р. Мавзютов//Журн. микробиол.— 2007.— № 2.— С. 3—8.
7. Изучение фено- и генотипов Pseudomonas aeruginosa, циркулирующих в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных/Т. И. Карпунина, М. В. Кузнецова, Н. И. Маркович, Н. С. Авдеева, В. И. Сергевнин//Вестник РУДН. Серия «Медицина».— 2008.— № 6.— С. 268—271.
8. Карпунина Т. И. Распространенность кар-бапенемоустойчивых штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах Перми/ Т. И. Карпунина, М. В. Кузнецова, Н. В. Николаева, В. А. Демаков//Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер.— 2010.— Т. 12.— № 2.— Прил. 1.— С. 32.
9. Карпунина Т. И. Эпидемиологические аспекты нозокомиальной синегнойной
инфекции в многопрофильном хирургическом стационаре/1 И. Карпунина, М. В. Кузнецова, Н. В. Николаева, В. А. Де-маков///Сибирский мед. журн.— 2009.— Т. 24.— № 4.— С. 70—73.
10. Лопухов Л. В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике/Л. В. Лопухов, М. В. Эйдель-штейн//Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер.— 2000.— Т. 2.— № 3.— С. 96— 100.
11. Микробиологический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за внутрибольничными гнойно-септическими инфекциями/Н. И. Маркович, В. И. Сергевнин, Т. И. Карпунина и др.// Метод. рекоменд.— Пермь, 2006.— 18 с.
12. Насонова Е. С. Пульс-электрофорез: теория, инструментальный арсенал и области применения/Е. С. Насонова://Цитология.— 2008.— Т. 50.— С. 927—935.
13. Плотникова Е. Г. Методы ДНК-типирова-ния микроорганизмов/Е. Г. Плотникова // Молекулярная генетика: учебно-метод. пособие/Под ред. С. В. Боронниковой.— Пермь: Изд-во ПГУ, 2007.— 150 с.
14. Покровский В. И. Стрептококки и стреп-тококкозы/В. И. Покровский, Н И. Брико, Л. А. Ряпис.— М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006.— 544 с.
15. Решедько Г. К. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России/ Г. К. Решедько, Е. Л. Рябкова, О. И. Кречи-кова и др.//Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер.— 2008.— Т. 10.— № 2.— С. 163—179.
16. Сергевнин В. И. Внутрибольничные инфекции и направления микробиологического мониторинга/В. И. Сергевнин, Н. И. Маркович//Эпидемиол. и вакци-нопроф.— 2008.— № 2.— С. 25—28.
17. Сидоренко С. В. Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам/ С. В. Сидоренко, Д. В. Иванов, А. Г. Бере-зин//Антиб. и химиотер— 2004.— № 3— С. 6—16.
18. Сидоренко С. В. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и антибиотикорезистентность среди их возбудителей/С. В. Сидоренко, С. П. Резван, С. В. Еремина и др.//Антиб. и химиотер.— 2005.— Т. 50.— № 2—3— С. 33—41.
19. Фиалкина С. В. Генетические детерминанты патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae: автореф. дис. ... канд. биол. наук/С. В. Фиалкина.— М., 2004.— 28 с.
20. Чернуха М. Ю. Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции: автореф. дис. ... д-ра мед. наук/М. Ю. Чернуха— М., 2008.— 46 с.
21. Шагинян И. А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничной инфекции/И. А. Шагинян//Клин. микро-биол. и антимикроб. химиотер.— 2000.— Т. 2— № 3— С. 82—95.
22. Эйдельштейн М. В. Бета-лактамазы аэробных грамотрицательных бактерий: характеристика, основные принципы классификации, современные методы выявления и типирования/М. В. Эйдель-штейн//Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер.— 2001.— Т. 3— № 3— С. 223— 242.
23. Эйдельштейн М. В. Молекулярно-генети-ческий метод выявления резистентности к цефалоспоринам у бактерий семейства Enterobacteriaceae, обусловленной продукцией ß-лактамаз расширенного спек-
тра CTX М-типа/М В. Эйдельштейн, М. А. ПимкиН///Метод. рекоменд.— Смоленск, 2001.
24. Эпидемиология/Под ред. Л. П. Зуевой и Р. X. Яфаева.— СПб.: ООО «Изд-во «Фолиант», 2005.— 752 с.
25. A highly selective PCR protocol for detecting 16s rRNA genes of the genus Pseudomonas (sensu stricto) in environmental samples/ F. Widmer, R. J. Seidler, P. M. Gillevet et al.// Appl. Environ. Microbiol.— 1998.— Vol. 64.— № 7.— P. 2545—2553.
26. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting/P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker et al.//Nucleic. Acids. Res.— 1995.— Vol. 23 (21).— P. 4407—4414.
27. Brakstad O. G. Multiplex polymerase chain reaction for detection of genes for Staphylococcus aureus thermonuclease and methicillin resistance and correlation with oxacillin resistance/O. G. Brakstad, J. A. Mae-land, Y. Tveten//APMIS.— 1993.— Vol. 101.— P. 681—688.
28. Caetano-Anolles G. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers/G. Caetano-Anolles, B. J. Bassam, P. M. Gresshoff///Biotechnology (N.-Y.).— 1991.— Vol. 9.— № 6.— P. 553— 557.
29. Detection and typing of integrons in epidemic strains of Acinetobacte baumannii found in the United Kingdom//. F. Turton, M. E. Kaufmann, J. Glover et al.//J. Clin. Microbiol.— 2005.— Vol. 43.— № 7.— Р. 3074—3082.
30. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by Multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL/D. De Vos, A. Lim, J.-P. Pirnay et al.//J. Clin. Microbiol.— 1997.— Vol. 35.— № 6.— P. 1295—1299.
31. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers/ I. Williams, A. R. Kubelik, K. I. Livak, I. A Rafalski, S. N. Tongey//Nucleic. Acids. Res.- 1990.- Vol. 18.- № 22.- P. 6531— 6535.
32. Du Plessis M. Rapid Detection of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae in cerebrospinal fluid by a seminested-PCR strategy/M. Du Plessis, A. M. Smith, K P. Klugman//]. Clin. Microbiol.- 1998.— Vol. 36.- № 2.- P. 453-457.
33. Fredericks D. N. Application of polymerase chain reaction to the diagnosis of infectious diseases/D. N. Fredericks, D. A. Relman//Clin. Infect. Dis.- 1999.- Vol. 29.- P. 457-488.
34. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction//. Versalovic, M. Schneider, F. J. De Bruijn et al.//Meth. Cell. Mol. Biol.- 1994.-Vol. 5.- P. 25-40.
35. Greisen K. PCR primers and probes for the 16s rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid/K. Greisen, M. Loeffelholz, A. Purohit, D. Leong//J. Clin. Microbiol.-1994.- Vol. 32. - P. 335-351.
36. Hauser A. R Molecular analysis of pyrogenic exotoxins from Streptococcus pyogenes isolates associated with toxic shock-like syndrome/A. R. Hauser, D. L. Stevens, E. L Kaplan, P. M Schlievert//]. Clin. Microbiol.- 1991.- Vol. 29.- P. 15621567.
37. Hookey J. V. Molecular typing of Sta-phylococcus aureus on PCR restriction fragment length polimorphism and DNA sequence analysis of the coagulase gene/ J. V. Hookey, J. F. Richardson, B. D. Cookson// J. Clin. Microbiol.- 1998.- Vol. 36.- № 4.-Р. 1083-1089.
38. Identification of methicillin-resistant strains of staphylococci by polymerase chain reaction/K. Murakami, K. Minamide, E. Wada
et al./IJ. Clin. Microbiol.- 1991.- Vol. 29.-P. 2240-2244.
39. Lu J. Use of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestions for detection and identification of common bacterial pathogens|J. Lu, C. L. Pemg, S. Lee, C C WanIIJ. Clin. Microbiol.- 2000.-Vol. 38. - P. 2076-2080.
40. Medical microbiology|C. Mims, H. M. Dock-rell, R. V. Goering et al.- University of Oxford, 2004.- 660 p.
41. PCR identification of Pseudomonas aeru-ginosa and direct detection in clinical samples from cystic fibrosis patientsI L V. F. Filho, J. E. Levi, C N. O. Bentof et al.|| J. Med. Microbiol.- 1999.- Vol. 48.-P. 357-361.
42. Queenan A. M. Carbapenemases: the versatile ß-lactamases|A M. Queenan, K. Bush||Clin. Microbiol. Rev.- 2007.- Vol. 20.- P. 440458.
43. Sajid S. U. Plasmid fingerprinting and virulence gene detection among indigenous strains of Salmonella enterica serovar enteritidis|S. U. Sajid, S. SchwarzH J. Ayub. Med. Coll. Abbottabad.- 2009.-Vol. 21.- № 2.- P. 83-86.
44. Species-specific and ubiquitous DNA-based assays for rapid identification of Staphylococcus epidermidis|F. Marti-neau, F. J. Picard, P. H. Roy et al.||J. Clin. Microbiol.- 1996.- Vol. 34.- № 12.-P. 2888-2893.
45. Stevens D. A. Diagnosis of fungal infections: current status|D. A. Stevens||J. Antimicrob. Chemother.- 2002.- Vol. 49.- P. 11-19.
46. The gene encoding a new mitogenic factor in a Streptococcus pyogenes strain is distributed only in group A streptococci| T. Yutsudo, K. Okumura, M. Iwasaki et al.H Infection Immunity.- 1994.- Vol. 62.-№ 9.- P. 4000-4004.
47. Thompson J. D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment son//. D. Thompson, D. G. Higgins, T J. Gibson//Nucl. Acids. Res.- 1994.— Vol. 22.— P. 4673—4680.
48. Threlfall E. J. Plasmid profile typing and plasmid fingerprinting/E. J. Threlfall, N. Woodford et al.//Methods in molecular biology. Diagnostic bacteriology protocols. Totowa, N. J.: Humana Press Inc., 1992.— Vol. 46.— P. 225—236.
49. Van de Peer Y. TREECON for Windows a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment/Y. Van de Peer, R. De Wachter//Comput. Appl. Biosci— 1994.— Vol. 10.— P. 569—570.
50. Vaneechoutte M. DNA fingerprinting techniques for microorganisms. A proposal for classification and nomenclature/ M. Vaneechoutte//Mol. Biotechnol— 1996— Vol. 6.— P. 115—142.
51. Versalovic J. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes/ J. Versalovic, T. Koeuth, J. R. Lupski//Nucleic. Acids. Res.— 1992.— Vol. 19.— № 24— P. 6823—6831.
52. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers/J. Welsh, M. McClelland///Nucleic. Acids. Res.— 1990— Vol. 18.— № 24.— P. 7213—7218.
M. V. Kuznetsova, E. G. Plotnikova, T. I. Karpunina, E. S. Gorovits, V. A. Demakov
molecular-genetic INVESTIGATIONS IN LABORATORY DIAGNOSIS AND MONITORING OF HOSPITAL INFECTION PATHOGENS
Significance of using molecular-genetic methods in laboratory diagnosis and monitoring of pyo-septic infection pathogens is presented in the paper. The most relevant technologies are characterized and examples of their application for isotope identification, determination of pathogenicity factors and bacterial anti-bioticoresistance determinants are given. It is underlined that in epidemiological practice application of molecular typing methods is obligatory along with traditional phenotypic analysis.
Keywords: hospital infections, genetic methods, molecular epidemiology.
Контактная информация: Кузнецова Марина Валентиновна канд. биол. наук, научный сотрудник Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614000, г. Пермь, ул. Голева, 13, тел. 8 (342) 212-44-76
Материал поступил в редакцию 02.09.2010
