CC BY
84
УДК 630.161.32:582.47(571.53) ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПЦР
ДЛЯ ВИДОВОЙ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФИЛЛОБОТРИОЗА В ПРОБАХ РЫБЫ И БИОМАТЕРИАЛА ЧЕЛОВЕКА
Л л о
© П.А. Чумаченко1 , В.П. Саловарова1, Н.Л. Белькова2
Иркутский государственный университет, 664003, Россия, г. Иркутск, ул. К. Маркса,1, [email protected] 2 Лимнологический институт СО РАН, 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 3, [email protected]
Дифиллоботриоз является широко распространенным паразитарным заболеванием, вызываемым ленточными червями рода Diphyllobothrium и представляет актуальную социально-медицинскую проблему в связи с большой распространенностью и ростом заболевания. На территории Иркутской области доказана циркуляция трех видов лентецов: D. latum, D. dendriticum и D. ditremum, из которых эпидемиологическое значение имеют два первых вида. При этом D. latum и D. dendriticum оказывают неравноценное воздействие на организм человека и вызывают, по сути, разные формы заболевания. Однако в медицинской практике дифференцированная видовая принадлежность возбудителей дифиллоботриоза человека не диагностируется. Наибольшее число заражения дифиллобо-триозом по данным эпидемиологических исследований на территории Иркутской области и Республики Бурятия связано с употреблением в пишу необеззараженной рыбы. Поэтому детекция возбудителя важна, как с клинической, так и с эпидемиологической точек зрения. В настоящей работе показана возможность применения высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции для детекции и идентификации возбудителя в клиническом материале, полученном от больного, а также в пробах рыбы для паразитологического мониторинга с целью оценки заражения рыбы и разработки мероприятий по предупреждению и снижению заболевания среди людей. Ключевые слова: дифиллоботриоз, диагностика, ПЦР
THE USE OF PCR FOR THE DIAGNOSTIC OF SPECIFIC PATHOGEN DIPHYLLOBOTHRIASIS N SAMPLES OF FISH AND HUMAN BIOMATERIAL
P.A. Chumachenko1, V.P. Salovarova1, N.L. Belkova2
Irkutsk State University,
K. Marx st., 1, Irkutsk, 664003, Russia, [email protected] 2 Limnological Institute of SB RAS, Ulan-Batorskaya st., 3, Irkutsk, 664033, Russia, [email protected]
Diphyllobothriasis is a widespread parasitic disease caused by tapeworms Diphyllobothrium genus, and is the actual socio-medical problem due to the high prevalence and an increase in disease. On the territory of the Irkutsk region circulation of three types of tapeworms: D. latum, D. dendriticum and D. ditremum is proved, of which the epidemiological important are the first two species. At the same time D. latum and D. dendriticum have unequal effects on the human body and cause, in fact, different forms of the disease. However, in clinical practice affiliation of the etiological agent of human diphyllobothriasis to differentiated species is not diagnosed. The highest number of diphyllobothriasis infestation in the Irkutsk region and the Republic of Buryatia is associated with the consumption of untreated fish according to epidemiological studies. Therefore, detection of the pathogen is important, both from a clinical and epidemiological point of view. In the present work the authors show the possibility of using a highly sensitive polymerase chain reaction for detection and identification of the pathogen in clinical samples obtained from patients, as well as in samples of fish for parasitological monitoring to assess the contamination of fish and the development of actions to prevent and reduce disease among the people. Keywords: diphyllobothriosis, diagnostics, polymerase chain reaction.
ВВЕДЕНИЕ
Дифиллоботриозы - это группа эндемичных неконтагиозных пероральных биогельмин-тозов, занимающих особое место среди паразитарных болезней в связи с их большой распространенностью. У человека описаны и изучены восемь возбудителей дифиллоботриозов (класс Cestoidea «цестоды», отряд Pseudophyl-lidea «лентецы», семейство Diphyllobothriidae «дифиллоботрииды») [4, 5].
В жизненном цикле возбудителей есть две стадии, на которых возможна его идентификация: в момент заражения промежуточного хозяина - рыбы и в организме окончательного хозяина - человека. Рыбы, у которых личинки паразита (плероцеркоиды) заключены в капсулу белого или желтоватого цвета размером от просяного зернышка до горошины и локализуются в пищеводе, желудке, кишечнике, печени, гонадах и полости тела, являются источником заражения человека [12, 13]. Во время весенних паводков и обильных дождевых смывов в воду озер и рек попадают яйца лентеца. Через 2-3 недели в яйцах развиваются личинки -корацидии, которые вскоре покидают оболочку яйца. Далее корацидии заглатываются пресноводными рачками - циклопами и диаптомуса-ми, и через 2-3 недели развиваются в личинку второй стадии - процеркоид. В организме рыб процеркоиды через 3-4 недели развиваются в плероцеркоиды [4, 8].
На территории Иркутской области доказана циркуляция трех видов дифиллоботриид, из которых для человека опасны лишь два: широкий лентец Diphyllobothrium latum и чаечный лентец D. dendriticum. Однако методы, используемые в настоящее время в медицинской практике, не дают возможности дифференцировать дифиллоботриозы, вызванные разными видами возбудителей. В клинико-диагностических лабораториях учреждений здравоохранения применяются копроовоскопические методы, основанные на микроскопическом исследовании яиц гельминта в фекалиях человека. С их помощью достаточно просто обнаружить яйца лентецов, однако определить их видовую принадлежность невозможно, в связи с чем в записи результатов анализа указывают «обнаружены яйца Diphyllobothriidae sp.». Кроме того, известны случаи ошибочной идентификации с трематодами Digenea, которые обладают яйцами похожего размера, и с сегментами Taenia saginata похожей формы [6, 7, 8, 10]. Множество образцов автоматически определяются как D. latum, однако последующий молекулярный анализ детектирует их как D. dendriticum, D. nihonkaiense и другие разновидности [12, 15]. Некоторые виды могут быть
диагностированы только на основе формы и размера эмбриональных крючьев онкосфер дифиллоботриид, однако они отсутствуют в фекалиях окончательных хозяев и требуют для развития пребывания в течение нескольких дней в воде [9, 14].
Возможна дифференциальная диагностика лентецов на основании морфологических особенностей фрагментов стробилы паразита, однако это требует специальных знаний, а данный материал, как правило, отсутствует в клинических образцах. Помимо этого, после процедур по дегельминтизации человека происходит разрушение стробилы паразита, поэтому проведение морфологического анализа не представляется возможным.
Молекулярный анализ с помощью поли-меразной цепной реакции (ПЦР) представляет надежный инструмент для детекции и идентификации возбудителя за короткое время в минимальном объеме пробы [16]. Высокая специфичность ПЦР определяется структурами праймеров и оптимальными условиями ее проведения. В зависимости от выбранных праймеров можно дифференцировать род и/или вид возбудителя.
В связи с вышесказанным, весьма актуальным является изучение возможности использования для дифференциальной диагностики дифиллоботриоза высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции, позволяющего не только детектировать наличие возбудителя, но и провести его идентификацию в клиническом материале, полученном от больного, а так же в пробах рыбы для парази-тологического мониторинга, разработки основных направлений эпидемиологического надзора и адекватной территориально ориентированной системы противоэпидемических мероприятий в отношении дифиллоботриоза.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Учитывая возможность детекции возбудителя на стадии его развития в промежуточном хозяине - рыбе, адаптация видо-специфичной ПЦР была проведена на плероцеркоидах лен-тецов. В работе использованы фрагменты биологического материала, выделенные от особей омуля, добытых на территории Иркутской области и Республики Бурятия. Видовая диагностика возбудителя (ф. dendrШcum) обеспечивалась использованием в ПЦР видо-специфич-ных праймеров. Чувствительность метода отрабатывали в поиске оптимальных условий реакции. Всего было отобрано 6 образцов, использовались как сами плероцеркоиды, так и фрагменты пищеварительной системы рыб, где гельминты были обнаружены. Для контро-
ля селективности на уровне видовой диагностики использовали плероцеркоиды D. latum. Плероцеркоиды фиксировали в этаноле, перед проведением генетического анализа отмывали буферным раствором [11].
Далее с учетом результатов исследований рыбы было проведено исследование биологического материала от людей. С этой целью использовали фекалии людей, зараженных ди-филлоботриозом, при этом три образца были получены от больных, проживающих на территории Иркутской области и один - от больного из Республики Бурятия. Во всех образцах стандартными копроовоскопическими методами подтверждено наличие яиц Diphyllobothrium sp. Забор биологического материала осуществляли согласно методическим рекомендациям «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР диагностики» [3]. Образцы для молекулярного исследования (фекалии, содержащие яйца лентеца) также, как и в случае с образцами, взятыми от рыбы, фиксировали в этаноле и отмывали буферным раствором.
Выделение ДНК из подготовленных образцов проводили с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб» по модифицированной методике [1, 2]. К образцу объемом 100 мкл добавляли 300 мкл лизирующего буфера и тщательно перемешивали гомогенизатором. Для удаления взвеси лизат центрифугировали на настольной центрифуге (5 мин, 12 000 об/мин), надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и к ней добавляли 25 мкл сорбента. Далее все стадии отмывки проводили согласно инструкции фирмы-изготовителя. Нуклеиновые кислоты элюировали в 50 мкл безбактериальной стерильной воды. Для этого осадок суспендировали, прогревали в термостате 5 мин при 60 оС и центрифугировали 5 мин при 12 000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали в качестве матрицы в ПЦР.
В ПЦР использованы видо-специфичные праймеры: MulRevCom (5'-ATGATAAGGGAYA-GGRGCYCA-3') и MulDen4 (5'-GTGTTTTTCAT-TTGATGATGACCAGTC-3'), позволяющие ам-
плифицировать фрагмент гена, кодирующего первую субъединицу цитохром с оксидазы длиной 338 н.п. митохондриальной ДНК D. dendriticum. Специфичность реакции обеспечивается высокой гомологией праймера MulDen4 с целевым фрагментом D. dendriticum (табл. 1). Максимальное количество замен на выбранном участке составляет не более 2 для D. dendriticum, идентифицированных в разных объектах, в то время как с другими эпидемиологически важными видами D. latum и D. ditremum замен существенно больше, причем располагаются они и на важном для амплификации 3'-конце (табл. 1).
Последовательность праймеров разработана зарубежными коллегами и ранее не применялась для работы с образцами, полученными на территории Иркутской области [16]. Реакцию проводили с коммерческим набором Encyclo (Евроген, Москва), использовали 1020 нг матричной ДНК и по 5-10 пмоль каждого праймера. В первом цикле денатурация проводилась при 95 оС 5 мин, затем 30 циклов, включающих: денатурацию при 94 оС в течение 30 с, отжиг при 58 оС - 30 с и элонгацию при 72 оС -45 с. В последнем цикле время элонгации увеличивали до 7 мин. Амплификацию проводили в термоциклере Бис (БИС-Н, Россия). После реакции проводили электрофоретический анализ ампликонов в 1,5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (20 миллимоль/л трис-аце-тат, 0,5 миллимоль/л ЭДТА, pH 7,6). Электрофорез вели в электрофоретической ячейке (Bio-Rad, США) при напряжении 120 вольт в течение 40 мин. Ампликоны окрашивали этиди-ум бромидом (рабочая концентрация 2 мкг/мл) и визуализировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе ECX-20L (Vilber Lour-mat, Франция).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведение ПЦР с плероцеркоидами, выделенными от особей омуля, показало, что все образцы плероцеркоидов D. dendriticum, отобранные из рыб, пойманных на территории Иркутской области и Республики Бурятии дали по-
Таблица 1
Сравнительный анализ структуры видо-специфичного праймера MulDen4 для D. dendriticum и целевых фрагментов ДНК
MulDen4 5'-GTGTTTTTCATTTGATGATGACCAGTC-3'
AB374223* Diphyllobothrium dendriticum KC812049* Diphyllobothrium dendriticum KC812048* Diphyllobothrium dendriticum FM209181* Diphyllobothrium latum FM209182* Diphyllobothrium ditremum GTGTTTTTCATTTGATGATGACCAGTC GTGTTTTTCGTTTGATGATGACCAGTC GTGTTTTTCGTTTGATGATGGCCAGTC GTGTTTTT TGTTTGATGGTGGCCAGT T GTGTTCTTTGTTTGATGATGACCAGT T
Примечание: * номер нуклеотидной последовательности, зарегистрированной в международной базе данных ГенБанк (вепБапк).
1000 500
1000 500
Рис. 1. Детекция 01рЬу!!оЬоМгшт dendriticum в исследуемых образцах: 1, 2, 3, 4 - гельминты, выделенные из омуля (Иркутская обл.); 5 - гельминт из омуля (Республика Бурятия); 6 - отрицательный контроль (й[рЬу!!оЬо^пит !эШт); 7 - безматричный контроль; М - маркер молекулярного веса
1000 500
Рис. 2. Детекция Diphy!!obothrium dendriticum в исследуемых образцах: 1 - положительный контроль (й. dendriticum); 2 - отрицательный контроль (й. Иэ^т); 3 - пищевод рыбы; 4 - гельминты, выделенные из пищевода рыбы; М - маркер молекулярного веса
1000 500
Рис. 3. Детекция Diphyllobothrium dendriticum в исследуемых образцах: 1 - положительный контроль (гельминты, выделенные из омуля); 2 - отрицательный контроль (Diphyllobothrium latum); 3-6 - образцы биоматериала человека; 7 - безматричный контроль; М - маркер молекулярного веса
положительную детекцию (рис. 1). В качестве отрицательного контроля использовали достоверно идентифицированный образец D. latum. Отсутствие специфичного ампликона в отрицательном контроле позволяет говорить о селективной детекции D. dendriticum на уровне вида. Использование для детекции фрагмента пищевода рыбы, где был определен гельминт, дало отрицательную реакцию (рис. 2). Очевидно, что в случае, когда зараженность рыбы гельминтами невысокая, использование в качестве биологического материала для выделения ДНК и дальнейшей видо-специфичной ПЦР небольших фрагментов пищеварительной системы нежелательно.
Выделение из пищевода отдельных особей D. dendriticum и использование их в повторной диагностической процедуре дало положительную реакцию (рис. 2).
При постановке метода ПЦР для видо-спе-цифичной идентификации яиц дифиллоботри-ид в биологическом материале (фекалиях) человека использовали подготовленные пробы биоматериала людей, инвазированных дифил-лоботриидами неустановленного вида
Учитывая, что образец биологического материала от человека содержит суммарную фракцию нуклеиновых кислот, а не только ДНК возбудителя, для исключения ложноотрица-тельных результатов в экспериментах варьировали концентрацию матричной ДНК от 0,5 до
1. Белькова Н.Л., Дзюба Е.В., Суханова Е.В., Ханаева Т.А. Адаптация методов молекулярно-генетического анализа для изучения микроорганизмов, ассоциированных с рыбами // Биология внутренних вод. 2008. № 2. С. 91-94.
2. Белькова Н.Л., Дзюба Е.В., Суханова Е.В. Молекулярно-генетическая детекция непатогенного генотипа Spironucleus barkhanus (Diplo-monadida: Hexamitidae) в черном байкальском хариусе (Thymallus arcticus baikalensis Dybowski, 1874) // Известия РАН. Серия биологическая, 2008. Т. 35. № 2. С. 253-256.
3. Методы санитарно-микробиологического и санитарно-паразитологического анализа прибрежных вод морей в местах водопользования населения. Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспо-требнадзора, 2011.114 с.
4. Поляков В.Е. Дифиллоботриоз // Российский Медицинский журнал. 2002. № 5. С. 38-40.
5. Савенкова Ю.Ю., Малышева Н.С. О необходимости изучения ситуации по дифиллобо-триозу в условиях Курской области // Теория и практика паразитарных болезней животных, 2014. Вып. 15. С. 260-262.
50 нг. Показано, что оптимальным является использование матричной ДНК не выше 5 нг на 50 мкл раствора (рис. 3).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показали принципиальную возможность использования ПЦР для прямого определения наличия возбудителей D. dendriticum в клиническом материале, полученном от больных. Данный метод позволяет провести детекцию большого количества образцов за короткое время и дает возможность постановки диагноза при минимальном количестве яиц паразита в фекалиях, что затруднительно сделать обычными копроовоско-пическими методами. Метод имеет ключевое значение не только для выявления и видовой идентификации возбудителей в клиническом материале, полученном от больного, но и для паразитологического мониторинга рыбы, позволяющего оценить уровень паразитарного заражения рыбы и скоординировать мероприятия по предупреждению и снижению заболевания среди людей. Контроль состояния обитателей водной среды позволит не только своевременно корректировать планы эпидемиологических мероприятий на территории области, но и отслеживать случаи инвазий при досмотре рыбы, поступающей как из разных регионов Российской Федерации, так и из-за ее пределов.
КИЙ СПИСОК
6. Савченков М. Ф., Чумаченко И.Г., Турчи-нова Д.А. Дифиллоботриоз в Байкальском регионе (эпидемиологическое наблюдение) // Сибирский медицинский журнал. 2008. Вып. 3. Т. 78. С. 88-90.
7. Саловарова В.П., Чумаченко П.А., Бого-мазова О.Л. Мониторинг зараженности гельминтами рыбы, реализуемой на территории Иркутской области // Товаровед продовольственных товаров. 2012.№ 6. С. 32-36.
8. Чижова Т.П., Гофман-Кадошников П.Б. Природный очаг дифиллоботриоза на Байкале и его структура // Медицинская паразитология. 1960. № 2. С. 168-176.
9. Dick T.A., Nelson P.A., Choudhury A. Diphyllobothriasis: update on human cases, foci, patterns and sources of human infections and future considerations. Southeast Asian. // J. Trop. Med. Public Health. 2001. Vol. 32. №. 2. P. 59-76.
10. Matsuura T., Bylund G., Sugane K. Comparison of restriction-fragment-length-polymorphisms of ribosomal DNA between Diphyllobothrium nihon-kaiense and D. latum // Journal of helminthology. 1992. Vol. 66. No. 4, P. 261-266.
11. Reperant, L. A., Hegglin D., Fischer C.,
Kohler L., Weber J. M., Deplazes P. Influence of urbanization on the epidemiology of intestinal helminths of the red fox (Vulpes vulpes) in Geneva, Switzerland // Parasitol. Res. 2007. Vol. 101. No. 3. P.605-611.
12. Sampaio J. L., Andrade V. P., Lucas M. C., Fun M.C, Gagliardi S. M., Santos S. R., Mendes C. M., Eduardo M. B., Dick T. Diphyllobothriasis Brazil // Emerg. Infect. Dis. 2005. Vol. 11. No. 10. P. 15981600.
13. Torres P., Cuevas C.L., Tang M., Barra M., Franjola R., Navarrete N., Montefusco A., Otth L., Wilson G., Puga S., Figueroa L., Cerda O. Introduced and native fishes as infection foci of Diphyllo-bothrium spp. in humans and dogs from two localities at Lake Panguipulli in Southern Chile // Comp.
Parasitol. 2004. Vol. 71. No. 2. P. 111-117.
14. Wicht, B., Scholz T., Kuchta R. First record of human infection with the tapeworm Diphyllobothrium nihonkaiense in North America // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2008. Vol. 78. No. 2. P. 235-238.
15. Wicht B.,Yanagida T., Scholz T., Ito A., Jiménez J., Brabec J. Multiplex PCR for Differential Identification of Broad Tapeworms (Cestoda: Diphyllobothrium) Infecting Humans // J. Clin. Microbiol. 2010. Vol. 48. No. 9. P. 3111-3116.
16. Yéra, H., Nicoulaud J., Dupouy-Camet J. Use of nuclear and mitochondrial DNA PCR and sequencing for molecular identification of Diphyllobothrium isolates potentially infective for humans // Parasite. 2008. Vol. 15. No. 3. P. 402-407.
REFERENCES
1. Belkova N.L., Dzyuba E.V., Sukhanova E.V., Khanaeva T.A. Adaptatsiya metodov molekulyarno-geneticheskogo analiza dlya izucheniya mikroor-ganizmov, assotsiirovannykh s rybami [Adapting the methods of molecular genetic analysis for the study of microorganisms associated with fish]. Biologiya vnutrennikh vod - Biology of Inland Waters, 2008, no. 2, pp. 91-94.
2. Belkova N.L., Dzyuba E.V., Sukhanova E.V. Molekulyarno-geneticheskaya detektsiya nepato-gennogo genotipa Spironucleus barkhanus (Diplo-monadida: Hexamitidae) v chernom baikal'skom khariuse (Thymallus arcticus baikalensis Dybowski, 1874) [Molecular genetic detection of non-pathogenic genotype Spironucleus barkhanus (Diplomonadida: Hexamita) in black Baikal grayling (Thymallus arcticus baikalensis Dybowski, 1874]. Izvestiya RAN. Seriya biologicheskaya - Biology bulletin, 2008, vol. 35, no. 2, pp. 219-221.
3. Metody sanitarno-mikrobiologicheskogo i sanitarno-parazitologicheskogo analiza pribrezhnykh vod morei v mestakh vodopol'zovaniya naseleniya. Metodicheskie ukazaniya [Methods of sanitary-microbiological and sanitary-parasitological analysis of coastal sea waters in areas of water use population. Guidelines]. Moscow, Federal Center of Hygiene and Epidemiology, 2011, 114 р.
4. Polyakov V.E. Difillobotrioz [Diphyllobothriasis]. Rossiiskii Meditsinskii zhurnal - Russian Journal of Medicine, 2002, no. 5, pp. 38-40.
5. Savenkova Yu.Yu., Malysheva N.S. O ne-obkhodimosti izucheniya situatsii po difillobotriozu v usloviyakh Kurskoi oblasti [On the need to study the situation on the diphyllobothriasis under the Kursk region]. Teoriya i praktika parazitarnykh boleznei zhivotnykh - Theory and practice of parasitic diseases of animals, 2014, vol. 15, pp. 260-262.
6. Savchenkov M.F., Chumachenko I.G., Tur-chinova D.A. Difillobotrioz v Baikalskom regione (ep-idemiologicheskoe nablyudenie) [Diphyllobothriasis
in the Baikal region (epidemiological surveillance)]. Sibirskii meditsinskii zhurnal - Siberian Medical Journal, 2008, vol. 3 (78), pp. 88-90.
7. Salovarova V.P., Chumachenko P.A., Bo-gomazova O.L. Monitoring zarazhennosti gel'minta-mi ryby, realizuemoi na territorii Irkutskoi oblasti [Monitoring of helminths infestation of fish sold in the Irkutsk region]. Tovaroved prodovol'stvennykh tova-rov - Goods foodstuffs, 2012, no. 6, pp. 32-36.
8. Chizhova T.P., Gofman-Kadoshnikov P.B. Prirodnyi ochag difillobotrioza na Baikale i ego struktura [Natural diphyllobothriasis center on Lake Baikal and its structure]. Meditsinskaya parazitologi-ya - Medical parasitology, 1960, no. 2, pp. 168-176.
9. Dick T.A., Nelson P.A., Choudhury A. Diphyllobothriasis: update on human cases, foci, patterns and sources of human infections and future considerations. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health., 2001, vol. 32, suppl. 2, pp. 59-76.
10. Matsuura T., Bylund G., Sugane K. Comparison of restriction-fragment-length-polymorphisms of ribosomal DNA between Diphyllobothrium nihon-kaiense and D. latum. Journal of helminthology, 1992, vol. 66, no. 4, pp. 261-266.
11. Reperant L.A., Hegglin D., Fischer C., Kohler L., Weber J.M., Deplazes P. Influence of urbanization on the epidemiology of intestinal helminths of the red fox (Vulpes vulpes) in Geneva, Switzerland. Parasitol. Res., 2007, vol. 101, no. 3, pp. 605-611.
12. Sampaio J.L., Andrade V.P., Lucas M.C., Fung M.C, Gagliardi S.M., Santos S.R., Mendes C.M., Eduardo M.B., Dick T. Diphyllobothriasis Brazil. Emerg. Infect. Dis. 2005, vol. 11, no. 10, pp. 15981600.
13. Torres P., Cuevas C.L., Tang M., Barra M., Franjola R., Navarrete N., Montefusco A., Otth L., Wilson G., Puga S., Figueroa L., Cerda O. Introduced and native fishes as infection foci of Diphyllo-bothrium spp. in humans and dogs from two localities at Lake Panguipulli in Southern Chile. Comp.
Parasitol., 2004, vol. 71, no. 2, pp. 111-117.
14. Wicht B., Scholz T., Kuchta R. First record of human infection with the tapeworm Diphyllobothrium nihonkaiense in North America. Am. J. Trop. Med. Hyg, 2008, vol. 78, no. 2, pp. 235-238.
15. Wicht B.,Yanagida T., Scholz T., Ito A., Jiménez J., Brabec J. Multiplex PCR for Differential Identification of Broad Tapeworms (Cestoda: Diphyl-
lobothrium) Infecting Humans. J. Clin. Microbiol., 2010, vol. 48, no. 9, pp. 3111-3116.
16. Yéra, H., Nicoulaud J., Dupouy-Camet J. Use of nuclear and mitochondrial DNA PCR and sequencing for molecular identification of Diphyllo-bothrium isolates potentially infective for humans. Parasite, 2008, vol. 15, no. 3, pp. 402-407.
Статья поступила в редакцию 01.02.2016 г.
УДК 581.1:58.07.071
ПЕРОКСИДАЗА В РЕГУЛЯЦИИ ФИТОМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
Л Л о
© Г.П. Акимова1, М.Г. Соколова1, В.В. Верхотуров2
1 Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,
664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, п/я 317, [email protected]
2 Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83
В работе описано исследование изменения активности пероксидазы (ПО) растений при взаимодействии с бактериями разных родов семейства Rhizobiaceae: Rhizobium leguminosarum - симбионт гороха, вызывающий образование корневых клубеньков и Agrobacterium rhizogеnes - фитопатоген, вызывающий синдром «волосатого корня». Активность ПО в ответ на инокуляцию Rh. leguminosarum практически не отличалась от контроля, тогда как в корнях инокулированных A. rhizogines активность ПО имела ярко выраженную тенденцию к возрастанию. Сделан вывод, что направленность изменения активности фермента в проростках гороха при взаимодействии с Rh. leguminosarum способствует проникновению ризобий, а в случае с патогеном A. rhizogines служит показателем стрессового состояния растений.
Ключевые слова: активности пероксидазы; растительно-микробные взаимодействия; Rhizobium leguminosarum; Agrobacterium rhizogеnes; горох Pisum sativum L.
PEROXIDASES IN REGULATION OF PHYTO-MICROBE INTERACTIONS
G.P. Akimova1, M.G. Sokolova1, V.V. Verkhoturov2
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, p/b 317, 132, Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia, [email protected] 2 Irkutsk National Research Technical University, 83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia,
The research was aimed to study changes in peroxidase (PO) activity in the course of interaction with bacteria of various genera of Rhizobiaceae family: Rhizobium leguminosarum - pea symbiont causing formation of root nodules and Agrobacterium rhizogеnes - phytopathogen causing the syndrome of "hairy root". Peroxidase activity in response to inoculation with Rh. leguminosarum virtually did not differ from control, whereas in the roots inoculated with A. rhizogines рeroxidase activity had a well-pronounced tendency to increase. It is concluded that the direction of enzyme activity change in pea seedlings interacting with Rh. legumi-nosarum promotes rhizobia penetration, and in the case with A. rhizogines pathogen it acts as an indicator of plant stress status.
Keywords: peroxidase activities; plant-microbe interactions; Rhizobium leguminosarum; Agrobacterium rhi-zogеnes; pea Pisum sativum L.
