CC BY
4
Общие вопросы гигиены
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 613.632:615.91.092.4
Ю. Н. Талакин, Л. А. Иванова, А. А. Калашников, И. А. Некрасова,
Л. В. Черных
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПЕРФУЗИИ ПЕЧЕНИ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Донецкий медицинский институт им. М. Горького
Применение модели перфузируемой печени мелких лабораторных животных получило в последнее время довольно широкое распространение. Особенно перспективно ее использование для выяснения механизмов токсического дейст-
г о
вия ядов в плане установления временной динамики повреждения различных субклеточных структур, а также для решения вопроса о том, какая из субклеточных структур служит мишенью яда, поскольку получение подобных данных в исследованиях на целостном организме весьма затруднительно. Кроме того, техника эксперимента на перфузируемой печени позволяет осуществлять точную количественную дозировку токсичного агента и устанавливать время появления нарушений в клетках (по составу перфузионной среды).
Цель настоящей работы состояла в изучении характера изменений биохимических и морфологических показателей перфузируемой печени при воздействии химических веществ разных классов для оценки специфичности ответа гепа-тоцитов.
В экспериментах осуществляли 2-часовую перфузию печени крысы in situ с помощью замкнутой установки. В качестве перфузата использовали 70 мл полусинтетической среды, состоящей из среды 199 (45 %), полиглюкина (40%), отмытой эритроцитной массы (5%) и аутокрови (10 %). Вещества подавали в канюлю воротной вены печени через 15 мин от начала перфузии. Через 15, 30, 60, 90 и 120 мин от начала перфузии отбирали 2 мл оттекающего от печени перфузата. В нем определяли активность ферментов разной клеточной локализации: кислой и щелочной фосфатаз (КФ, ШФ), глю-козо-6-фосфатазы (Г-6-Ф), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аланин- и аспартатаминотрансфераз (АЛТ, ACT), каталазы и аргиназы. Регистрировали также внешний вид печени, скорость желчеотделения, мочевинообразования, рН перфузионной среды, содержание электролитов, белка, глюкозы.
По окончании перфузии ткань печени фиксировали, подвергали обычной гистологической обработке с окраской гематоксилином и эози-
ном. В отдельных случаях в ней определяли также содержание липидов (суданом III), гликогена, РНК, активность ЩФ.
В каждой серии проведено 4—8 перфузий. Контролем служили данные по перфузии печени 18 интактных крыс. В качестве действующих были выбраны следующие вещества: этанол, четыреххлористый углерод, тиомочевина, соли ртути: хлорид ртути (II), йодид ртути (II), амидохлорид, синтетическое моющее средство (CMC) «Лотос».
Эмпирическим путем подбирали дозу вещества, вызывающую сдвиги регистрируемых показателей перфузата. Вносимые на 70 мл перфузата количества составили для этанола — 153 мг, четырххлористого углерода — 15,4 мг, тиомочевины — 50 мг, хлорида ртути(II) — 0,5 мг, йодида ртути(II) — 0,43 мг, амидохлорид а ртути — 2,14 мг, CMC «Лотос» — 75 мг.
Затем дозу веществ снижали в 5 раз (в случае соединений ртути в этой дозе испытывали лишь сулему) и регистрировали те же показатели.
Результаты выражали как в абсолютных величинах, так и в процентах к исходному уровню. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием критерия Стьюдента — Фишера.
При введении больших доз химических веществ печень к концу второго часа перфузии приобретала пятнистую окраску, что является признаком расстройства кровообращения в ткани печени. Мочевинообразование прекращалось полностью, исключение составило лишь введение больших доз CMC, вызывающих лишь некоторое замедление этого процесса по сравнению с контролем. Желчеотделение под влиянием всех веществ резко снижалось вплоть до полного прекращения. Для изучаемого воздействия характерны выделение клетками калия и задержка в них натрия, особенно значительные в конце перфузии. Следует подчеркнуть, что описанные явления не сопровождались изменением pH перфузионной среды и в силу этого не могут считаться следствием нарушений кислотно-
4
*
*
Показатели жизнедеятельности перфузируемой печени при воздействии химических веществ (к моменту окончания
перфузии)
Исследованные показатели, % к исходному уровню
Вещество Доза | мочевинообра- желчеотделение рН среды скорость оттока содержание
зование перфузата
калия натрия
Этанол 1 0 0 0 44 124 84
0,2 100 100 0 80 109 95
Четы р е х х л о р истый 1 0 0 0 53 179,8 99
углерод 0,2 100 100 0 90 136,2 100
Тиомочевина 1 0 0 0 - 169 62
0,2 100 100 0 - 134 93
Соли ртути 1 0 0 0 39 179 77,5
0,2 100 100 0 86 112 88,1
CMC 1 80 0 0 50 185 136
" 0,2 100 100 0 78 160 120
Примечание. Доза вещества приведена в долях от величин доз, приведенных в тексте.
щелочного равновесия ткани перфузируемого органа (см. таблицу).
Структурные изменения, возникающие в ткани печени под влиянием различных веществ, бы-л ли однотипными и заключались в появлении ^ признаков расстройства кровообращения. Отмечались полнокровие сосудов, стаз и резкое расширение пространств Диссе за счет отека (местами с дискомплексацией печеночных долек). В гепатодитах наблюдалась выраженная гидропи-ческая дистрофия, в некоторых участках — мутное набухание с гибелью единичных клеток. Содержание гликогена, РНК было снижено по сравнению с контролем. В периваскулярных пространствах имели место небольшие лимфо-идно-гистиоцитарные инфильтраты.
Под влиянием высоких доз изучаемых веществ в составе перфузата появились ферменты, обычно прочно удерживаемые неповрежден-* ной клеткой. Ферментный спектр перфузата со-Ъ держал ферменты по существу всех субклеточных органелл: растворимые ферменты цитозо-ля, ферменты клеточной оболочки, эндоплазма-тического ретикулума, пероксисом. Динамика появления их в перфузате, а следовательно, и характер повреждения субклеточных структур были различными и зависели от природы действующего химического агента. Так, действие на печень этанола и четырххлористого углерода характеризовалось кратковременным обратимым увеличением проницаемости мембраны и сопровождалось практически мгновенным выбросом в межклеточное пространство ферментов различной клеточной локализации, что не противоречит результатам, полученным другими авторами [1, 2].
Картина повреждения гепатоцитов солями ртути определялась постепенным нарастанием . во времени мембраноповреждающего эффекта. щ В ранние сроки воздействия (60—90 мин) обнаруживалась повышенная активность ЛДГ и аргиназы, к 120-й минуте — Г-6-Ф, ЩФ, катала-
зы. Кроме того, в конце эксперимента появлялись составные части мембран — фосфолипиды, холестерин. Восстановления проницаемости мембран нами не отмечено.
Характер действия CMC на мембраны гепатоцитов был промежуточным между действием органических веществ и соединений тяжелых металлов. Резкое нарастание активности ферментов цитозоля (ЛДГ, АЛТ, аргиназа), микро-сом (Г-6-Ф), пероксисом (каталаза) отмечалось на ранних стадиях опыта. Повышение активности ферментов лизосом (КФ и катепсин D) было более отсроченным по времени, чем при действии других химических веществ.
Введение всех изучаемых веществ в дозе, составляющей 7б от исходной, не вызывало изменений функционального состояния печени. Морфологические нарушения не выявлялись совсем, или отмечался незначительный отек ткани печени. Динамика ферментного спектра перфузата повторяла таковую при воздействии высоких доз веществ, однако соблюдался четко выраженный дозозависимый эффект. Чаще обнаруживалась лабилизация клеточных мембран, носящая функциональный характер. При воздействии низкой дозы хлорида ртути(II) установлен холелитиче-ский тип поражения мембран, заключающийся в уменьшении их проницаемости для белка и некоторых ферментов.
Выводы. 1. Функциональные и морфологические изменения при введении химических агентов в систему кровообращения печени не зависят от их химического строения, а определяются в основном дозой.
2. Динамика изменений ферментативной активности перфузата отражает общий характер поражения мембран.
3. Использование модели перфузируемой печени для изучения порядка вовлечения в патологический процесс различных субклеточных структур весьма проблематично ввиду ее явной неспецифичности.
Литература
1. Талакин Ю. Н., Иванова JI. А., Животникова Н. В., Матвеенко О. А. // Укр. биохим. жури. — 1985.— №4. —С. 75—78.
2. Novacova О., Musil /,> Buckiova D. et эпидемиол., микробиол. (Прага). -№ 4. — С. 327—340.
al.//Жури. гиг.
198i. — Т. 25,
Поступила 13.03.89
КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990
УДК 613.632-07
Т. А. Шашина, В. С. Кушнева, А. И. Эйтингон, Г. А. Колоскова
ОЦЕНКА КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СМЕСЕЙ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
ПО ВЕДУЩЕМУ ФАКТОРУ
Институт биофизики Минздрава СССР, Москва; НИИ гигиены труда и профзаболева
чий АМН СССР, Москва
В условиях производства, применения, а также при горении высокомолекулярных органических соединений, в том числе полимерных материалов, в окружающую среду возможно выделение продуктов их термоокислительной деструкции, представляющих собой сложные парога-зоаэрозольные смеси (ПГАС) относительно постоянного и не полностью известного состава. Постоянство количественного и качественного состава многокомпонентных смесей выявляется с помощью определенных статистических методов и расчетных уравнений [7].
Одновременное воздействие на организм химических веществ, обладающих различными механизмами и силой токсического действия, может приводить к качественно новому токсическому эффекту смеси выделяющихся продуктов, отличному от изолированных эффектов, входя-дящих в ее состав компонентов.
Выявление характера комбинированного действия подобных сложных ПГАС и определение ведущих токсических компонентов — основные задачи при токсиколого-гигиеническом регламентировании их в воздухе. Большинство применяемых для этих целей методов оценки комбинированного действия химических веществ, особенно графических [5, 12], может быть использовано лишь при изучении бинарных смесей, а распространенный расчетный метод D. Finney [11] применим только для ядов однонаправленного типа действия.
Одним из методических подходов к оценке комбинированного действия сложных ПГАС является выбор ведущих токсических компонентов по лимитирующему признаку вредности. При этом целесообразно использовать методы многофакторного анализа: парной и множественной корреляции, дисперсии, множественной регрессии [2—4]. По мнению ряда исследователей, указанные методы позволяют количественно оценить степень вклада отдельных компонентов смеси в общий токсический эффект и объективно определить ведущий компонент смеси.
Целью настоящего исследования являлось оп-
ределение ведущих факторов при токсикологической оценке продуктов термоокислительной деструкции (ПТД), образующихся при горении композиционного и поливинилхлоридных материалов (соответственно смеси № 1 и 2). Горение композиционного материала происходило при 500 °С, поливинилхлоридных материалов — при 850 °С. Экспозиция для животных составила соответственно 30 и 5 мин в условиях статического режима затравки.
Определение концентраций основных компонентов смесей проводили с помощью комплекса физико-химических и аналитических методов с использованием однолучевого инфракрасного спектрофотометра «Miran 1А» (фирма «Wilkc», США), газового хроматографа с пламенно-ионизационным детектором и катарометром фирмы «Intersmat» (Франция) и газожидкостного хроматографа «Цвет-104» с пламенно-ионизационным детектором.
Для выявления ведущих компонентов смесей наряду с традиционными методическими приемами установления лимитирующего признака вредности применяли многофакторный анализ и планирование эксперимента 2П. Биологическое действие смесей оценивали на смертельном, максимально переносимом, аварийном и минимально действующем (для смеси № 1) уровнях воздействия.
При токсикологической оценке биологических эффектов смеси ПТД композиционного материала, состоящей из окиси углерода, окислов азота, формальдегида и углеводородов (смесь № 1), на смертельном уровне воздействия установлено, что клиническая картина острой интоксикации смесью обусловлена в основном влиянием окиси углерода (быстрая гибель животных во время экспозиции, алая кровь у погибших животных как свидетельство высокого содержания карбоксигемоглобина). При этом содержание окиси углерода и окислов азота в смеси составляло в среднем 3935 и 60 мг/м3, что в 1,5 и 5 раз, а других компонентов — в 40 раз ниже, чем смертельные концентрации этих веществ при изолированном воздействии. Проведенные
