CC BY
30
The use of cultivated human cells for testing cytotoxicity alcohol drinks in the experiments in vitro
12 3
Abakumova O. , Kalinina A. , Samojlik L. ,
Kondrashev G.4 (Russian Federation)
Использование культивируемых клеток человека для тестирования цитотоксичности алкогольсодержащих напитков в опытах in vitro Абакумова О. Ю.1, Калинина А. Г.2, Самойлик Л. В.3,
Кондрашев Г. И.4 (Российская Федерация)
Абакумова Ольга Юрьевна /Abakumova Ol'ga - доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии,
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН;
2Калинина Анна Георгиевна /Kalinina Anna - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией токсикологии;
3Самойлик Людмила Васильевна/Samojlik Ljudmila - научный сотрудник лаборатории токсикологии;
4Кондрашев Геннадий Иванович / Kondrashev Gennadij - научный сотрудник лаборатории токсикологии,
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В. П. Сербского» МЗ РФ, г. Москва
Аннотация: в статье приводится методика тестирования алкогольных напитков с использованием клеточных культур. Показано, что исследуемые напитки, в отличие от их основы (этиловый спирт и сахар) обладают определенным диапазоном цитотоксических свойств. Описанный метод может найти применение при оценке токсичности как вновь выводимых рецептур напитков, так и при ревизии имеющихся на потребительском рынке.
Abstract: the article describes a cell cultures method for testing of alcoholic beverages. It is shown that the investigated drinks, unlike their base (ethanol and sugar) have a certain range of cytotoxic properties. The method described may be applied for the assessment of toxicity of newly inferred beverage recipes, and revision of available ones in the consumer beverage market.
Ключевые слова: алкогольные напитки, клеточные культуры, цитотоксичность.
Keywords: alcoholic beverages, cell culture, cytotoxicity.
Биологически активные вещества, предполагаемые к дальнейшему использованию человеком в качестве лекарственных, косметических средств, добавок к пище и т.д. на первых этапах исследования принято оценивать с точки зрения потенциальной токсичности. Во всем мире с этой целью применяются методы биотестирвания - тесты, выполняемые с использованием живых организмов, чаще теплокровных - крысах, мышах, кроликах и др. При этом традиционные исследования на лабораторных животных дорогостоящи и не всегда выполнимы в принципе [1, 172; 2, 608, 3, 21].
Развитие методологии культивирования различных линий клеток животных и человека привело в начале 80-х годов прошлого века к созданию альтернативных токсикологических приемов - исследованию токсичности в опытах in vitro. Такие исследования отличаются относительно низкой себестоимостью, ускоряя при этом изучение биологической активности исследуемых веществ [4, 27]. Одним из основных преимуществ токсикологической оценки веществ с использованием культивируемых клеток человека in vitro является обнаруженная возможность экстраполяции результатов этих исследований на организм человека [5, 15].
Условия проведения опытов in vitro и линии культивируемых клеток строго стандартизованы, они сохраняют метаболизм исходных тканей и высокую видовую специфичность. Определяющим фактором в выборе метода исследования токсичности в пользу клеточных технологий является высокая корреляция результатов in vitro и in vivo [6, 19; 7,339].
Всемирная организация здравоохранения рекомендует и поддерживает использование культуральных моделей и методов в токсикологии, а внедрение их в токсикологические исследования происходит под контролем Европейского центра по утверждению альтернативных методов (ECVAM), Интернационального комитета по утверждению альтернативных методов (ICCVAM) и Европейского сообщества токсикологов in vitro (ISTIV) [4,27].
Ранее нами было показано, что злоупотребление слабоалкогольными напитками молодыми женщинами вызывает специфический комплекс нарушений репродуктивной патологии, выраженный первичным и вторичным бесплодием, кистозно-фиброзными перерождениями яичников, дисменореей и аменореей. Было установлено, что у рожениц, злоупотреблявших до беременности слабоалкогольными напитками (пиво,
тонизирующие напитки), наблюдается минимальный срок вынашивания плода. Репродуктивная патология сопровождается нарушением функции желудочно-кишечного тракта, патологией поджелудочной железы [8, 43-50].
Первые исследование цитотоксичности фракций одного из видов пива были выполнены нами и описаны ранее [9, 84]. Было показано, что некоторые компоненты пива обладают цитотоксической активностью, которая не связана с высокомолекулярными веществами. Наибольшая токсическая активность была присуща фракциям пива с молекулярной массой порядка 10 кДа. Метод определения цитотоксичности пива оказался достаточно трудоемким, так как напиток производится путем естественного брожения и диапазон содержащихся в нем биологически активных компонентов может широко варьировать в зависимости от качества и вида исходного сырья, а также ряда технологических приемов. Поэтому исследованию цитотоксичности предшествовало фракционирование образца напитка.
При исследовании цитотоксичности слабоалкогольных напитков, описанном в настоящей статье, мы сочли возможным использовать аликвоты напитка, не подвергая его какой-либо подготовке за исключением дегазирования.
Физиологическое действие отдельных составляющих исследуемых слабоалкогольных напитков хорошо известно из литературы. Все они относятся к пищевым продуктам, входят в состав напитков в рекомендуемых для употребления НИИ питания количествах. При этом информация об их сочетанном влиянии на организм человека ограничена и не имеет научного подтверждения.
Целью настоящей работы является изучение возможности использования МТТ-теста [4, 27; 10, 713], при скрининге слабоалкогольных напитков и непосредственной оценки токсичности исследуемых образцов напитков (в качестве примера). В работе мы не использовали названия напитков, а присвоили им условные буквенные обозначения.
Материалы и методы.
Культуры клеток. В экспериментах использовали линии клеток солидных опухолей человека и животных: MCF-7 (аденокарцинома молочной железы человека), полученная из American Туре Culture Collection (ATCC), НГУК1 (невринома Гассерова узла крысы) и ЭПНТ5 (глиобластома мышей), полученные из коллекции НИИ морфологии человека РАМН, а также фибробласты кожи здоровых людей (ФБЧ), которые были получены из лаборатории биотехнологии 1-го МГМУ им. И. М. Сеченова.
Культивирование клеток производили во влажной атмосфере, в СО2-инкубаторе при 5% СО2 и 37ОС, используя среды DMEM и RPMI 1640 («Gibco») а также эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) («Gibco»). Клетки MCF-7 и ФБЧ культивировали в среде ДМЕМ, НГУК1 и ЭПНТ5 в среде RPMI 1640, с добавлением 10% ЭТС («Gibco») и антибиотиков стрептомицина и пенициллина («ПанЭко»).
Исследовали слабоалкогольные напитки D, S, R и G (каждая буква соответствует названию напитка); в качестве растворов сравнения использовали основы напитков, содержащие 7%-ный раствор этилового спирта с добавлением сахара - в соответствии с количеством сахара в исследуемых напитках (основа D, S и основа R, G).
Для определения цитотоксичности напитков клетки пассировали в 96-тилуночные планшеты («Costar») в 100 мкл среды и в количестве 5 х 103 клеток/лунку. Через 24 ч к клеткам в 4-х повторах добавляли 5, 10 и 20 мкл каждого напитка, а также их основы, эксперимент останавливали через 48 и 72 ч.
Количество выживших метаболически активных клеток определяли, используя МТТ-тест [4, 27; 10, 713], основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия митохондриальными дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, которые затем растворяли в DMSO. Оптическую плотность этих растворов измеряли на мультискане EX («Lab. System», Финляндия) при длине волны 540 нм. Количество выживших клеток рассчитывали в процентах от контроля, которым служили клетки, культивированные без добавления напитков и их основы.
Результаты исследования и их обсуждение.
На рис. 1 представлены результаты исследования влияния на рост клеток MCF-7 различных аликвот напитков D, S, R и G и основы D, S через 48(А) и 72 ч (Б) после их добавления. В то время как добавление аликвот напитков уменьшало число клеток MCF-7 к 72 ч от 40 до 67% по сравнению с контролем, добавление основы D, S практически не изменяло рост клеток MCF-7, а самая низкая аликвота (5 мкл) стимулировала рост этих клеток.
А
Б
Рис. 1. Влияние различных количеств исследуемых напитков и основы напитков на рост клеток MCF-7 через 48(А) и 72
(Б) часа после их добавления
Клетки глиобластомы мышей ЭПНТ5 и невриномы Гассерова узла крыс оказались значительно более чувствительными к действию напитков при добавлении их аликвот 10 и 20 мкл. Уже к 48 ч после добавления напитков D, S и G оставалось от 6 до 9% клеток ЭПНТ5 и 3-4% клеток НГУК1 по сравнению с контролем. Только после добавления напитка R к 48 ч оставалось 30% клеток ЭПНТ5 и 26% клеток НГУК1 (рис. 2 и 3).
А
Б
Рис. 2. Сравнительный анализ цитотоксического действия напитков на клетки глиобластомы крыс ЭПНТ5 через 48
(А) и 72 (Б) часа после добавления
А
Б
Рис. 3. Сравнительный анализ цитотоксического действия различных напитков на клетки невриномы Гассерова узла
крысы НГУК1 через 48 (А) и 72 (Б) часа после их добавления
А Б
Рис. 4. Влияние различных количеств напитков на рост клеток ФБЧ через 48 (А) и 72(Б) часа после их добавления
А
Б
Рис. 5. Влияние основы исследуемых напитков на рост клеток ФБЧ через 48 (А) и 72 часа (Б) после ее добавления
Значительное токсическое действие напитки оказывали и на рост нормальных фибробластов кожи человека через 48 и 72 ч после их добавления (рис.4, А, Б). К 48 ч оставалось от 30 до 47% клеток по сравнению с контролем. Основы напитков в низких концентрациях (5 и 10 мкл) практически не оказывали влияния на рост этих клеток, но добавление 20 мкл уже стимулировало рост фибробластов в интервале времени 72 часа (рис. 5, А, Б).
Таким образом, слабоалкогольные напитки, взятые нами в эксперимент - D, S, R и G - обладают определенным диапазоном цитотоксичности, действуя как на опухолевые клетки, так и на нормальные клетки кожи человека. При этом, в зависимости от дозы и состава напитков влияние может быть как в сторону угнетения клеточного роста, так и наоборот. Это говорит о том, что злоупотребление данными напитками может провоцировать возникновение патологических состояний у человека. При использовании в исследованиях большего количества различных клеточных культур могут быть получены более точные сведения о специфичной токсичности изучаемых напитков.
Наблюдаемое нами в экспериментах дозовозависимое снижение количества метаболически активных клеток MCF-7, НГУК1 и ЭПНТ5, а также фибробластов кожи человека (ФБЧ), связанно с наличием в напитках некой суммарной цитотоксической активности. Наличие этанола не является определяющим в ее проявлении, так как образцы сравнения (основы) не обладали аналогичной цитотоксичностью.
Компоненты, входящие в состав рецептур напитков, разрешены Роспотребнадзором и Институтом питания РАН к употреблению человеком. Следовательно, полученные результаты в определенной степени подтверждают правомочность сделанных ранее заключений о том, что состав алкогольного напитка (неэтанольные составляющие) могут существенно модифицировать действие этанола на организм человека.
Полученные результаты приводят к выводу о необходимости продолжения исследований с использованием линейки клеточных культур, полученных из различных органов и тканей человека и животных. Целью таких исследований должно быть выявление механизма повреждающего действия напитков с экстраполяцией на ткани и органы, а также на патологию обнаруженную в экспериментах in vivo и при клинических наблюдениях.
Литература
1. Квятковская И. Я. Методы изучения хронического действия химических и биологических загрязнителей / И. М. Трахтенберг, Л. А. Тимофиевская, И. Я. Квятковская / Отв. ред. М. Трахтенберг. - Рига: Знание, 1987. - 172 с.
2. Общая токсикология / Под ред. Б. А. Курляндского, В. А. Филова. - М.: Медицина, 2002. - 608 с.
3. Фрешни Р. Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. М., БИНОМ. Лаборатория знаний. 2010.
4. Ускоренное изучение цитотоксического действия в экспресс-тестах in vitro / Завьялов Н. В., Червонская Г. П., Панкратова Г. П. и др. // Сб. тезисов докл. 1-го съезда токсикологов 17-20 ноября 1998, Москва. -1998. - С. 27
5. Емельянова Н. В. Роль лаборатории клеточных технологий в экологическом мониторинге, Земское обозрение. - № 28. 27.07.2010.
6. Parish W. The future for acute oral toxicity testing. In: Animals and Alternatives in Toxicology —Present Status and Future Prospects / Ed. M. Balls, J. Bridges, J. Southee. —New York: VCH Publishers, 1991. —P. 19 —20.
7. Shrivastava R. In vitro tests in pharmacotoxicology. // Alternatives to Laboratory Animals. —1997. —V. 25. — P. 339-340.
8. Калинина А. Г., Суркова Л. А., Забирова И. Г., Рыбачук Г. В. Влияние различных алкогольных напитков, употребляемых женщинами репродуктивного возраста, на структуру патологии и здоровье новорожденных. Наркология, №3, 2012 г., С. 43-50.
9. Калинина А. Г., Коваленко Н. А., Абакумова О. Ю., Жданов Д. Д.Исследование цитотоксичности различных фракций одного из видов пива, Наркология. - № 6 (114), 2011 г., С. 84-89.
10. Абакумова О. Ю., Подобед О. В., Борисова А. А., Сидорук К. В., Александрова С. С., Омельянюк Н. М., Покровская М. В., Кондакова Л. И., Соколов Н. Н. Противоопухолевая активность l-аспарагиназы из yersinia pseudotuberculosis (2008) Биомед. Химия, 54(6), 712-719.
