CC BY
193
Игорь Степанович Брюховецкий', Полина Викторовна Мищенко2, Юрий Степанович Хотимченко3, Андрей Степанович Брюховецкий4
ОБОСНОВАНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO ФЕНОМЕНА НАПРАВЛЕННОЙ МИГРАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ И ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК ВЗРОСЛЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ К КЛЕТКАМ КРЫСИНОЙ ГЛИОМЫ ЛИНИИ C6
' К. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной нейробиологии,
Школа биомедицины ФГАОУВПО «Дальневосточный федеральный университет» (69009', РФ, г. Владивосток, ул. Суханова, д. 8); научный сотрудник, лаборатория фармакологии ФГБУН «Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского» ДВО РАН (69004', РФ, г. Владивосток, ул. Пальчевского, д. '7) 2 Аспирант, лаборатория фармакологии, ФГБУН «Институт биологии моря им. А. В. Жирмунского» ДВО РАН (69004', РФ, г. Владивосток, ул. Пальчевского, д. '7)
3 Д. б. н., профессор, директор, Школа биомедицины ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет» (69009', РФ, г. Владивосток, ул. Суханова, д. 8) 4 Д. м. н, профессор, генеральный директор, ЗАО «Клиника восстановительной и интервенционной неврологии и терапии "Нейровита"» (''5478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 23); руководитель, Центр биомедицинских технологий ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий» ФМБА России (''5682, РФ, г. Москва, Ореховый бульвар, д. 28)
Адрес для переписки: 690091, РФ, г. Владивосток, ул. Суханова, д. 8, Школа биомедицины ФГАОУ ВПО «Дальневосточный федеральный университет», лаборатория молекулярной и клеточной нейробиологии, Брюховецкий Игорь Степанович; e-mail: bruhovetsky@mail.ru
Мультиформная глиобластома — наиболее распространенная первичная высокоинвазивная злокачественная опухоль центральной нервной системы. Прогноз крайне неблагоприятный. Медиана продолжительности жизни больных после хирургической резекции, облучения и химиотерапии не превышает 12—15 мес, что обусловливает необходимость поиска новых подходов к лечению заболевания. Феномен направленной миграции стволовых клеток в опухолевый очаг открывает новые перспективы для создания технологий адресной доставки лекарственных веществ и других терапевтических средств непосредственно в опухолевый очаг. Гемопоэтические стволовые клетки CD34 + /CD133+ обладают большим репаративным потенциалом и инертны по отношению к нормальной нервной ткани. Цель работы — подтвердить способность взрослых предшественников гемопоэза к направленной миграции к клеткам глиомы. В опытах использовали линию глиомы C6, культуру гемопоэтических стволовых клеток CD34 + /CD133 + , первичные культуры астроцитов и фибробластов крысы. Клетки культивировали в течение 5 дней. Эксперимент позволил обнаружить формирование клеточного вала гемопоэтически-ми стволовыми клетками по периметру культуральной вставки, содержавшей культуру глиомы. Такую картину не наблюдали в лунках с культурами фибробластов и астроцитов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гемопоэтические стволовые клетки обладают высоким потенциалом направленной миграции к клеткам глиомы линии C6; это позволяет рассматривать их в качестве перспективной линии для разработки новых противоопухолевых биомедицинских технологий и проливает свет на ранее не известные аспекты канцерогенеза глиальных опухолей.
Ключевые слова: мультиформная глиобластома, глиома линии C6, гемопоэтические стволовые клетки, нейральные стволовые клетки.
Мультиформная глиобластома — наиболее распространенная первичная глиальная высокоинвазивная злокачественная опухоль центральной нервной системы с крайне неблагоприятным прогнозом. Медиана про-
должительности жизни больных после хирургической резекции, облучения и химиотерапии не превышает 12—15 мес [1—3]. Опухоль характеризуется инвазивным ростом, выраженной инфильтрацией вещества мозга и
высокой резистентностью к лучевой и лекарственной терапии, что обусловливает необходимость поиска новых подходов к лечению заболевания [4].
В последние годы в центре внимания исследователей оказался феномен направленной миграции ней-ральных стволовых и прогениторных клеток в опухолевый очаг, открывающий широкие перспективы для адресной доставки в опухоль лекарственных молекул, специфических генов, антител и других терапевтических средств [5—9]. Особую актуальность приобретает проблема выбора оптимальных клеточных линий, безопасных для трансплантации, поскольку использование собственных нейральных стволовых клеток нейроонко-логического больного сопряжено с высоким риском их неопластической трансформации [10—12].
Как мы полагаем, альтернативой могут стать гемо-поэтические стволовые клетки (ГСК) CD34 + /CD133 + , получение и хранение которых не представляет больших технических сложностей, а применение не сопряжено с этическими и юридическими ограничениями. Кроме того, эти клетки уже более полувека успешно используются для лечения онкологических больных [13].
Внимание ученых сосредоточено также на нейраль-ных стволовых и прогениторных клетках головного мозга человека как на наиболее вероятном источнике происхождения злокачественных глиом [5; 14—16]. В свою очередь, способность клеток — предшественников гемо-поэза взрослых млекопитающих и человека направленно мигрировать в неопластический очаг открывает принципиально новые аспекты процессов канцерогенеза в головном мозге.
Цель настоящей работы состояла в получении экспериментальных доказательств способности клеток — предшественников гемопоэза взрослых млекопитающих к направленной миграции к клеткам крысиной глиомы линии C6 при совместном культивировании.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОдЫ ГСК крысы
Культура крысиных ГСК предоставлена АНО «Национальный институт регенеративной медицины» (Москва). Фенотип и чистоту клеточной популяции характеризовали на проточном цитофлуориметре Becton Dickinson FACScan с использованием anti-CD34/anti-CD133 FITC-conj-Mab. Перед внесением в сочетанную культуру клетки окрашивали флюоресцентным маркером Vybrant® CFDA SE Cell Tracer (Life Technologies, V12883) в соответствии с рекомендациями производителя.
Культура клеток глиомы линии C6
По данным литературы, культура крысиной глиомы линии C6 по характеру поражения вещества мозга соответствует мультиформной глиобластоме человека [17; 18]. Линия глиомы C6 для проведения эксперимента предоставлена Школой биомедицины Дальневосточного федерального университета. Аликвоту, содержавшую
© Брюховецкий И. С., Мищенко П. В., Хотимченко Ю. С.,
Брюховецкий А. С., 2014
УДК 616-006.484-092.9:611.018.46
1 х 106 опухолевых клеток, размораживали в течение 10 мин при температуре 37°C, отмывали от DMSO средой DMEM (Gibco®), содержащей FBS (10%) и антибио-тик-антимикотик (10 000 ЕД/мл). Клетки осаждали центрифугированием и высаживали в 50-миллиметровые культуральные матрасы. Культивирование продолжали до образования монослоя. После этого клетки снимали ферментативной диссоциацией (0,05% раствор трипси-на-ЭДТА, 1:4, 10 мин, 37°C), центрифугировали (120 g, 6 мин), супернатант сливали. Опухолеродность используемой в эксперименте клеточной линии глиомы С6 проверяли посредством имплантации 0,5 х 106 клеток глиомы линии C6 в головной мозг половозрелых крыс с помощью стереотаксического аппарата (David Kopf Instruments) по методике, описанной Карен Эбоди [5].
Выделение первичной культуры фибробластов крысы
Для получения первичной культуры фибробластов использовали крысиные 12-дневные эмбрионы. Самку крысы глубоко наркотизировали эфиром, тело протирали спиртом. В стерильных условиях вскрывали брюшную полость, из рогов матки вынимали эмбрионы и помещали их в раствор Хенкса с добавлением антибиотика. У эмбриона удаляли конечности, голову и внутренние органы. Оставшуюся массу измельчали ножницами на маленькие кусочки и подвергали ферментной диссоциации (0,25% трипсин, 40 мин, 37°C). Клетки осаждали центрифугированием (1000 g, 5 мин). Осадок ресуспендировали в полной среде DMEM/F12, HEPES (Gibco®), содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,8% глюкозы, 0,2 ед/мл инсулина и антибиотик-антимикотик (10 000 ЕД/мл).
Выделение первичной культуры астроцитов крысы
Для работы использовали новорожденных белых крыс. Животных глубоко наркотизировали, в стерильных условиях отделяли голову, вскрывали череп, мозг вынимали и помещали в чашку Петри с раствором Хенкса. Затем выделяли кору больших полушарий, очищали ее от сосудистых оболочек, нарезали ножницами на мелкие кусочки, отмывали 2 раза раствором Хенкса и подвергали ферментативной диссоциации 0,05% раствором трипсина-ЭДТА в течение 10 мин при температуре 37°C. Ферментативную диссоциацию останавливали добавлением 5% FBS (в растворе Хенкса). Клеточную суспензию осаждали центрифугированием и ресуспендировали в полной среде (DMEM/F12 (90%), FCS (10%), L-глутамин (2 мМ), глюкоза (0,8%), инсулин (0,2 ед/мл), HEPES (25 мМ), антибиотик-антимикотик (10 000 ЕД/мл)).
Создание совместных культур
Для создания совместных культур использовали культуральные вставки (Millipore) диаметром 12 мм с порами размером 0,4 мкм. Дно лунок 12-луночного культураль-ного планшета покрывали полиэтиленимином (Gibco®), а затем ламинином (Gibco®). После этого в каждую лунку планшета помещали культуральную вставку, которую иммобилизовали каплей стерильного парафина. Внутрь культуральной вставки вносили по 0,5 х 106 опухолевых клеток, нормальных астроцитов и фибробластов. Одну из вставок оставляли пустой (рис. 1, А). Планшет с куль-туральными вставками инкубировали в течение 24 ч,
затем на дно лунки планшета высаживали по 0,25 х 106 ГСК. Через 3 ч инкубации клетки, не прикрепившиеся к дну лунки, отбирали. Визуально анализировали распределение ГСК по дну лунки (рис. 1, Б). Подсчет клеток в области проекции мембраны культуральной вставки осуществляли с помощью программы Photo-Capt v. 12.4 c 1-го по 5-й день культивирования.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Statistica 6.0 и MS Excel (2010).
Экспериментальная часть работы одобрена Комиссией по биомедицинской этике Института биологии моря им. А. В. Жирмунского ДВО РАН (протокол № 12 от 14.12.2012).
РЕЗУЛЬТАТЫ Культура ГСК
По данным цитофлуориметрии чистота популяции ГСК CD34 + /CD133+ составила 88,9%. При окрашивании трейсером Vybrant® CFDA SE клетки приобрели устойчивую флюоресценцию, видимую даже на малых увеличениях (рис. 2, А, Б).
Первичная культура глиомы линии C6
Культура глиомы линии C6 была представлена гетерогенной популяцией активно пролиферирующих клеток различной формы и размера. Через 24 ч культивирования клетки, прикрепившиеся к дну культуральной
Рисунок 1. Общая схема эксперимента.
А. Культуральный планшет содержит клетки глиомы линии C6 (красный), астроциты (синий), фибробласты (желтый) и ГСК (зеленый). Б. Культуральная вставка с клетками глиомы линии C6 (1), культивируемыми совместно с ГСК (2).
вставки, приобретали астроцитоподобный фенотип, другие — формировали многочисленные отростки различной формы и размера. Клетки окрашивались моно-клональными антителами против GFAP. Микроскопия на малых увеличениях и последующая окраска DAPI позволили визуализировать многочисленные неопластические ядра различной формы и размера (рис. 2, В, Г). Стереотаксическая имплантация клеток глиомы линии C6 в количестве 3 х 104 в мозг половозрелых крыс приводила к развитию опухолей, что сопровождалось выраженной астенией, резким снижением массы тела животных и тяжелым течением с отеком и дислокацией мозговых структур и подтверждалось данными морфологического и нейровизуализирующего исследований (рис. 2, Д, Е).
Первичная культура фибробластов крысы
Фибробласты крыс после окраски гематоксилином и эозином представляли собой клетки различной формы и размера с округлым ядром правильной формы (рис. 3, А). Функциональный анализ клеток, проведенный с использованием FluoSpheres® Collagen I-Labeled Microspheres (Life Technologies F-20892) по методике производителя, продемонстрировал активный фагоцитоз частиц коллагена (рис. 3, Б). Данную культуру применяли в эксперименте в качестве контроля.
Первичная культура астроцитов крысы
Культуру астроцитов крысы окрашивали DAPI, характеризовали с использованием моноклональных антител против GFAP и применяли в качестве контроля (рис. 3, В, Г).
Исследование процессов миграции ГСК в совместных культурах с астроцитами, фибробластами и глиомой линии C6
При совместном культивировании ГСК и опухолевых клеток наблюдали формирование клеточного вала, состоявшего из ГСК и располагавшегося по периметру культуральной вставки, которая содержала клетки глиомы (рис. 3, Д). Данный феномен, достигавший максимума ко 2-му дню эксперимента, был отчетливо выражен в культурах, содержавших клетки глиомы, и отсутствовал в культурах с фибробластами и астроцитами (рис. 3, Е, Ж). Подсчет количества клеток, окрашенных флюоресцентным маркером, показал четкое (р < 0,05) увеличение числа взрослых предшественников гемопоэза в области мембраны во всех культурах, содержавших клетки глиомы, со 2-го по 5-й день эксперимента (рис. 4). Значимых изменений числа ГСК в культурах с нормальными астро-цитами и фибробластами мы не наблюдали (рис. 5). Очевидно, что направленная миграция ГСК к культурам глиомы обусловлена продукцией неопластическими клетками различных цитокинов и хемоаттрактантов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Открытие феномена направленной миграции ГСК в область травмы, ишемического или неопластического повреждения нервной системы стало важным шагом в понимании биологии процессов регенерации и канцерогенеза. Идентифицировано более 79 цитокинов, хемоаттрактан-
A
Б
Рисунок 2. Характеристика ГСК и неопластических клеток глиомы линии C6.
А. ГСК в культуре, фазовый контраст (х20). Б. Флюоресценция ГСК, окрашенных Vybrant® CFDA SE Cell Tracer непосредственно перед внесением в культуру (х10). В. Неопластические клетки крысиной глиомы линии C6: клетки различной формы и размера на 3-й день культивирования активно распластываются по поверхности, формируя многочисленные отростки; отчетливо видны многоядерные клетки. Инвертированная микроскопия (х32). Г. Неопластические клетки глиомы линии C6 окрашены anti-GFAP Mab, ядра докрашены DAPI (х100). Д. Препарат мозга крысы через 6 дней после имплантации клеток глиомы линии C6. Е. Магнитно-резонансная томограмма мозга крысы через 7 дней после имплантации клеток глиомы линии C6, Т2-взвешенное изображение: видны признаки сдавления желудочков мозга, отека и дислокации срединных мозговых структур.
Рисунок 3. Характеристика клеточных линий контрольных культур фибробластов и астроцитов и реакция различных клеточных линий на совместное культивирование с клетками глиомы в ходе эксперимента.
А. Фибробласты крысы, окраска гематоксилином и эозином (х40). Б. Фибробласт крысы: фагоцитоз коллагена, иммобилизованного на поверхности флюоресцирующих микрочастиц FluoSpheres® Collagen I-Labeled Microspheres (х630). В. Астроциты крысы при окраске anti-GFAP Mab, ядра докрашены DAPI (х200). Г. Астроцит крысы при окраске anti-GFAP Mab (х200). Д. Формирование ГСК, окрашенными Vybrant® CFDA SE Cell Tracer, флюоресцирующего клеточного вала по периметру культуральной вставки, содержащей клетки глиомы (х10). Е. Культура ГСК и фибробластов крысы: формирования клеточного вала не происходит (х10). Ж. Культура ГСК и астроцитов крысы: формирования клеточного вала не происходит (х10).
тов и факторов роста и не менее 20 типов рецепторов, управляющих процессами миграции и хоуминга ГСК.
Доказана первостепенная роль в этом процессе SDF-1a (stromal cell-derived factor-1a), или фактора стромаль-
ных клеток, или хемокина CXCL12 подсемейства CXC, закодированного у человека геном CXCL12. SDF-1a связывается с рецепторами CXCR4 и CXCR7 мембраны стволовых клеток и вовлекает их в миграционный про-
цесс. SDF-1a выступает не только в роли хемоаттрак-танта, он может стимулировать пролиферацию клеток и способствовать их выживанию в условиях ишемии [19].
Фактор стволовых клеток (SCF), фактор роста гепа-тоцитов (HGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), белок хемотаксиса моноцитов (МСР-1), ядерный неги-стоновый белок HMGB1, активатор плазминогена уроки-назного типа (иРА), интерлейкин-6, Р1- и Р2-интегрины, L-селектин и ряд других лигандов являются важнейшими регуляторами трафика стволовых клеток в организме [20].
Основным источником хемоаттрактантов, привлекающих ГСК, служат поврежденные нейроны, астроциты, клетки микроглии и дегенерирующие элементы межклеточного матрикса, высвобождаемые в кровеносное русло.
Как следует из эксперимента, первичным источником цитокинов является именно ткань опухоли. Способность
1400 1300 1200 1100
° 1000
(D
о 900
о
зг 800 700 600 500
1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 5-й день
A
I[É 111
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 5-й день
Б
Рисунок 4. Распределение числа ГСК в культурах глиомы с 1-го по 5-й день эксперимента. 1 — лунка № 1; 2 — лунка № 2; 3 — лунка № 3; 4 — лунка № 4; 5 — лунка № 5; 6 — лунка № 6.
А. Динамика числа ГСК в проекции мембраны культуральной вставки различных культур, содержавшей клетки глиомы линии С6. Б. Экспликация достоверных результатов увеличения количества ГСК в культурах, содержавших неопластические клетки глиомы.
1000
900
800
700
600
500
1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 5-й день
Рисунок 5. Сравнительная динамика числа ГСК в культу-ральных вставках, содержавших клетки глиомы линии C6, астроциты и фибробласты, с 1-го по 5-й день эксперимента. 1 — контроль; 2 — глиома; 3 — астроциты; 4 — фибробласты.
неироэпителиальных опухолей продуцировать тенасцин, фибронектин, ламинин, коллаген различных типов и ряд других биологически активных молекул описана в литературе [20].
Очевидно, в естественных условиях основным источником мультипотентных клеточных элементов становятся герминативные зоны зрелого мозга. Привлекая и активно рекрутируя вовлеченные в процессы мутации нейральные стволовые клетки, опухоль аккумулирует их и стимулирует экспрессию большинства онкогенов, активно используя их репликативный и миграционный потенциал [21].
Клетки — предшественники гемопоэза взрослых млекопитающих и человека в отличие от нейральных стволовых клеток значительно меньше вовлечены в мутационный процесс, о чем свидетельствует анализ их протеомных профилей [22]. Кроме того, высокий репа-ративный потенциал при сохранении интактного отношения к нормальной нервной ткани позволяет рассматривать клетки — предшественники гемопоэза взрослых в качестве наиболее перспективной клеточной линии для лечения большинства неврологических заболеваний и травм мозга [23; 24].
Результаты экспериментов позволяют сделать вывод о выраженном патотропизме ГСК млекопитающих к глиоме линии C6. Это открывает широкие перспективы клинического применения ГСК. Однако роль ГСК и про-гениторных клеток в канцерогенезе злокачественных новообразований головного мозга нуждается в дальнейшем изучении.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (код проекта 314).
ЛИТЕРАТУРА
1. Schiff D., Purow B. Neuro-oncology: Five new things // Neurol, Clin. Pract. — 2013. — Vol. 3, N 4. — P. 326—333.
2. Omuro A., DeAngelis L. M. Glioblastoma and other malignant gliomas: a clinical review // JAMA. — 2013. — Vol. 310, N 17. — P. 1842—1850.
3. Patterns of care and survival for patients with glioblastoma multiforme diagnosed during 2006 / Yabroff K. R., Harlan L., Zeruto C., Abrams J., Mann B. // Neuro. Oncol. — 2012. — Vol. 14, N 3. — P. 351—359.
4. Surgical strategies for nonenhancing slow-growing gliomas with special reference to functional reorganiations: review with own experience / Hayashi Y., Nakada M., Kinoshita M., Hamada J. // Neurol. Med. Chir. (Tokyo). — 2013. — Vol. 53, N 7. — P. 438—446.
5. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: Evidance from intracranial gliomas / Aboody K. S., Brown A., Rain-ov N. G., Bower K. A., Liu S., Yang W., Small J. E., Herrlinger U., Oured-nik V., Black P. M., Breakefield X. O., Snyder E. Y. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97, N 23. — P. 12 846—12 851.
6. Human neural stem cell tropism to metastatic breast cancer / Zhao D., Najbauer J., Annala A. J., Garcia E., Metz M. Z., Gutova M., Polewski M. D., Gilchrist M., Glackin C. A., Kim S. U., Aboody K. S. // Stem Cells. — 2012. — Vol. 30, N 2. — P. 314—325.
7. Neural stem cell-mediated CE/CPT-11 enzyme/prodrug therapy in transgenic mouse model of intracerebellar medulloblastoma / Gutova M., Shackleford G. M., Khankaldyyan V., Herrmann K. A., Shi X. H., Mittelholtz K., Abramyants Y., Blanchard M. S., Kim S. U., Annala A. J., Najbauer J., Synold T. W., D'Apuzzo M., Barish M. E., Moats R. A., Aboody K. S. // Gen. Ther. — 2013. — Vol. 20, N 2. — P. 143—150.
8. Frank R. T., Najbauer J., Aboody K. S. Concise review: stem cells as an emerging platform for antibody therapy of cancer // Stem Cells. — 2010. — Vol. 28, N 11. — P. 2084—2087.
9. Tabatabai G., Weller M. Glioblastoma stem cells // Cell Tissue Res. — 2011. — Vol. 343, N 3. — P. 459—465.
10. Soltanian S., Matin M. M. Cancer stem cells and cancer therapy // Tumour Biol. — 2011. — Vol. 32, N 3. — P. 425—440.
11. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice / Holland E. C., Celestino J., Dai C., Schaefer L., Sawaya R. E., Fuller G. N. // Nat. Genet. — 2000. — Vol. 25, N 1. — P. 55—57.
12. Circulating progenitor cells: a comparison of patients with glioblastoma or meningioma / Alexiou G. A., Vartholomatos G., Karamout-sios A., Batistatou A., Kyritsis A. P., Voulgaris S. // Acta Neurol. Belg. — 2013. — Vol. 113, N 1. — P. 7—11.
13. Grobben B., De Deyn P. P., Slegers H. Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion // Cell Tissue Res. — 2002. — Vol. 310, N 3. — P. 257—270.
14. Стволовые клетки в канцерогенезе мультиформной глио-бластомы / Брюховецкий И. С., Брюховецкий А. С., Кумейко В. В., Мищенко П. В., Хотимченко Ю. С. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2013. — Т. VIII, № 2. — С. 13—19.
15. Goffart N., Kroonen J., Rogister B. Glioblastoma-initiating cells: relationship with neural stem cells and the micro-environment // Cancers (Basel). — 2013. — Vol. 5, N 3. — P. 1049—1071.
16. Neural stem cell tropism to glioma: critical role of tumor hypoxia / Zhao D., Najbauer J., Garcia E., Metz M. Z., Gutova M., Glackin C. A., Kim S. U., Aboody K. S. // Mol. Cancer Res. — 2008. — Vol. 6, N 12. — P. 1819—1829.
17. Barth R. F., Kaur B. Rat brain tumor models in experimental neu-ro-oncology: the C6, 9L, T9, RG2, F98, BT4C, RT-2 and CNS-1 gliomas // J. Neurooncol. — 2009. — Vol. 94, N 3. — P. 299—312.
18. Cheng M., Qin G. Progenitor cell mobilization and recruitment: SDF-1; CXCR4; a4-integrin, and c-kit // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. — 2012. — Vol. 111. — P. 243—264.
19. CXCR4-mediated bone marrow progenitor cell maintenance and mobilization a modulated by c-kit activity / Cheng M., Zhou J., Wu M., Boriboun C., Thorne T., Liu T., Xiang Z., Zeng Q., Tanaka T., Tang Y. L., Kishore R., Tomasson M. H., Miller R. J., Losordo D. W., Qin G. //Circ. Res. — 2010. — Vol. 107, N 9. — P. 1083—1093.
20. Роль системных механизмов миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной системы и разработке новых методов противоопухолевой терапии / Брюховецкий И. С., Брюховецкий А. С., Мищенко П. В., Хотимченко Ю. С. // Российский биотерапевтический журнал. — 2013. — Т. 12, № 4. — С. 3—12.
21. The role of chemokine receptor CXCR4 and its ligand CXCL12 in the process of proliferation and migration of oral squamous cell carcinoma / Yin D., Zhang Z., Gao S., Li B. // West China J. Stomatol. — 2013. — Vol. 31, N 1. — P. 8—12.
22. Сравнительное протеомное картирование опухолевых стволовых клеток, выделенных из глиобластомы человека линии U87, и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека: от каталогизации клеточных белков к инновационной парадигме про-теом-основанной клеточной терапии опухолей / Брюховецкий А. С., Шевченко В. Е., Чехонин В. П., Брюховецкий И. С., Ковалев С. В., Баклаушев В. П., Давыдов М. И. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2013. — Т. VIII, № 2. — С. 85—92.
23. P53 and PTEN control neural and glioma stem/progenitor cell renewal and differentiation / Zheng H., Ying H., Yan H., Kimmelman A. C., Hiller D. J., Chen A. J., Perry S. R., Tonon G., Chu G. C., Ding Z., Stom-mel J. M., Dunn K. L., Wiedemeyer R., You M. J., Brennan C., Wang Y. A., Ligon K. L., Wong W. H., Chin L., DePinho R. A. // Nature. — 2008. — Vol. 455, N 7216. — P. 1129—1133.
24. CXCL12 in early mesenchymal progenitors is required for hematopoietic stem-cell maintenance / Greenbaum A., Hsu Y. M., Day R. B., Schuettpelz L. G., Christopher M. J., Borgerding J. N., Nagasawa T., Link D. C. // Nature. — 2013. — Vol. 495, N 7440. — P. 227—230.
Поступила 01.12.2013
Igor Stepanovich Bryukhovetsky', Polina Victorovna Mischenko2, Yury Stepanovich Khotimchenko3, Andrey Stepanovich Bryukhovetsky4
DIRECTED MIGRATION OF ADULT HEMOPOIETIC PROGENITOR CELLS TOWARDS C6 RAT GLIOMA IN VITRO
' MD, PhD, Senior Researcher, Molecular and Cellular Neurobiology Laboratory, School of Biomedicine, Far Eastern Federal University (8, Sukhanova ul.,Vladivostok, RF, 69009'); Researcher, Laboratory of Pharmacology, A. V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS
('7, Palchevskogo ul., Vladivostok, RF, 69004') 2 Postgraduate Student, Laboratory of Pharmacology, A. V. Zhirmunski Institute of Marine Biology, FEB RAS ('7, Palchevskogo ul., Vladivostok, RF, 69004') 3 MD, PhD, DSc, Professor, Director, School of Biomedicine, Far Eastern Federal University (8, Sukhanova ul., Vladivostok, RF, 69009') 4 MD, PhD, DSc, Professor, Director General, NeuroVita Interventional and Restorative Neurology
and Therapy Clinic (23, Kashirskoye sh., Moscow, RF, ''5478 ); Head, Center of Biomedical Technologies, Federal Research and Clinical Center for Specialized Medical Care and Health Technologies, FMBA (28, Orehovy Bulvar, Moscow, RF, ''5682)
Address for correspondence: Bryukhovetskiy Igor Stepanovich, Laboratory of Molecular and Cellular Neurobiology, School of Biomedicine, Far Eastern Federal University, 8, Sukhanova ul., Vladivostok, 690091, RF;
e-mail: bruhovetsky@mail.ru
Glioblastoma multiforme is the most common, highly invasive, primary malignant tumor of the central nervous system with an extremely poor prognosis. Median survival of patients after surgical resection, radiation, and chemotherapy is not more than 12 to 15 months, and new approaches to the treatment of the disease are therefore needed. The observed directed migration of stem cells to the tumor center opens the opportunity for targeted delivery of therapeutic agents directly to the brain tumor. Hematopoietic CD34 + /CD133+ stem cells have a great reparative potential and are inert to normal neural tissue. The purpose of this study was to demonstrate experimentally the directed migration of adult hematopoietic progenitor cells towards glioma. We used C6 glioma line, culture of hematopoietic CD34 + /CD133+ stem cells, primary cultures of rat astrocytes and fibroblasts. The cells were cultured for 5 days. Hemopoietic cells formed a cell shaft on the perimeter of the glioma-containing culture insert. This phenomenon was not observed in the fibroblast and astrocyte culture. The conclusion may be made that hematopoietic stem cells have a high potential for directional migration towards C6 glioma cells, and may therefore be a promising candidates for the development of new anticancer biomedical technologies.
Key words: glioblastoma multiforme, glioma C6, hematopoietic stem cells, neural stem cells.
