CC BY
56
УДК 616.911:579.88-078+575.22
А.Н. Коломеец1,2, С.Н. Шпынов1,2, Н.В. Рудаков1-2, И.Е. Самойленко1, Т.А. Решетникова1,
Л.В. Кумпан2
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ (ПЦР-ПДРФ) ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ
1Омский НИИ природно-очаговых инфекций (Омск) 2Омская государственная медицинская академия (Омск)
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированного в ПЦР гена в 590 п.о., кодирующего поверхностный белок rOmpA, использовался для. генотипирования. семи штаммов рик-кетсий группы, клещевой пятнистой лихорадки. Эти штаммы, были, изолированы, на территории России и Казахстана из различных видов клещей в период 1981—2000 гг. ПЦР-фрагменты разрезались рестрикционными эндонуклеазами PstI и RsaI, и. эти образцы, анализировались с помощью 1% агарозного гель-электрофореза и. сравнивались с профилями известных видов риккетсий группы. КПЛ. Комбинация, профилей, полученных после рестрикции ПЦР-продуктов дала возможность осуществить дифференциацию риккетсий двух групп (R. sibirica subsp. sibirica — R. sibirica subsp. BJ-90 и R. sp. RpA4 — R. sp. DnS14 — R. sp. DnS28).
Ключевые слова: риккетсии, группа пятнистой лихорадки, полимеразная цепная реакция, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
THE USE OF COMPLEX OF MOLECULAR-GENETIC METHODS (PCR-RFLP) TO STUDY OF SPOTTED FEVER GROUP RICKETTSIA
A.N. Kolomeets1,2, S.N. Shpynov1,2, N.V. Rudakov1,2, I.E. Samoilenko1,
T.A. Reschetnikova1,2, L.V. Kumpan2
1Research Institute of Endemic Infectious Diseases, Omsk 2Omsk State Medical Academy^ Omsk
Restriction, fragment length polymorphism, analysis of PCR-amplified 590-bp gene fragment coding for the surface protein rOmpA was used, for genotyping of 6 strains of spotted, fever group (SFG) rickettsiae. These strains were isolated, on the territory of Russia and Kazakhstan, from, differed species of ticks during 19842000s. The PCR-fragments were cleaved, with restriction endonucleases PstI and RsaI, and. the digestion patterns were analyzed by 1 % agarose gel electrophoresis and compared with profiles of known species of SFG rickettsiae. The combination, of the profiles obtained, after digestion of the pCr product allowed, for the differentiation. of 2 groups' rickettsiae (R. sibirica subsp. sibirica — R. sibirica subsp. BJ-90 и R. sp. RpA4 — R. sp. DnS14 - R. sp. DnS28).
Key words: rickettsiae, spotted fever group, polymerase chain reaction, restriction endonuclease fragment length polymorphism analysis
В последние годы для идентификации новых изолятов риккетсий широко используются методы генетического типирования [1, 11, 12]. Наиболее точным методом молекулярной идентификации является секвенирование амплифицирован-ного фрагмента ДНК и сравнение его с соответствующими последовательностями известных видов [10]. Этот метод не лишен недостатков, на что указывают некоторые авторы [6]. На практике чаще используются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, одним из которых является ПЦР — ПДРФ. В ПЦР с помощью специфических праймеров амплифицируется фрагмент гена-мишени. С помощью эндонуклеаз рестрикции изучаемый фрагмент гена разрезается. После проведения электрофореза изучаются электрофоретические профили. Дальнейший анализ индивидуальных электрофоретических профилей позволяет осуществить молекулярно-биологическую идентификацию. При оптимальном выборе праймеров и рест-риктаз этот метод характеризуется высокой раз-
решающей способностью и имеет хорошую воспроизводимость [6].
В последние годы, на фоне непрекращающего-ся роста заболеваемости клещевым риккетсиозом преимущественно за счет Западной Сибири и Дальнего Востока [7], расширилось представление о циркуляции представителей порядка Rickettsiales в ик-содовых клещах в РФ [3, 10]. Кроме известных ранее Rickettsia sibirica (R. sibirica), R. conoriisp. caspii, впервые с помощью молекулярно-биологических методов выявлены: R. slovaca, R. heilongjiangensis, а также описаны впервые: R. sp. RpA4, R. sp. DnS14, R. sp. DnS28 (геноварианты, образующие один кластер в геногруппе R. massiliae) и Candidatus R. tarasevichiae [4, 8, 9, 10]. Данные о работах по применению комплекса методов ПЦР — ПДРФ для идентификации новых видов риккетсий отсутствуют, что заставило нас изучить возможность применения этого подхода для дифференциации клещевых видов риккетсий, циркулирующих в Азиатской части России. Актуальность этого подхода обусловлена не-
достаточной видоспецифичностью серологической диагностики клещевых риккетсиозов, вследствие перекрестных реакций из-за выраженного антигенного сходства и низкого уровня межвидовой дифференциации, обусловленного недавней дивергенцией риккетсий группы КПЛ [2, 5].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы штаммы: Я. sibirica subsp. БЛ-90 («Приморье 32/84»), Я. sibirica subsp. sibirica («Баево 107/87»), Я. sp. Эп814 («Шайман»), Я. sp. ЭпЯ28 («Бурятия-5»), Я. sp. ЯрЛ4 («Караганда 8/ 9»), Я. sp. ЯрЛ4 («Подгородка 5/6»).
Все штаммы были выделены сотрудниками Омского НИИ природно-очаговых инфекций из клещей в очагах клещевого риккетсиоза и на неэндемичных по этой инфекции территориях РФ и республики Казахстан в период 1984 — 2000 гг. и хранились в лиофилизированном состоянии (табл. 1).
Выделение ДНК. Выделение ДНК из лиофили-зированного штамма проводили фенол-хлороформ-ным методом без сорбента. К осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера с гуанидином, вортек-сировали и инкубировали 1 час при +56°. Затем добавляли 200 мкл фенол-хлороформной смеси. Вор-тексировали и инкубировали 30 минут при — 20°. После инкубации центрифугировали при 12 000 об/ мин в течение 5 минут. Верхняя фаза (200 мкл) отбиралась в новую пробирку, куда добавляли 20 мкл 3М ацетата натрия и 600 мкл 70 % этанола. Вортексиро-вали и инкубировали 1 час при —20°. После инкуба-
Использованные
ции проводилось центрифугирование в течение 1 минуты при 12 000 об/мин. Полученный осадок отмывался в 500 мкл 70 %, а затем 96 % этанола. Высушенный осадок ресуспендировался в ТЕ-буфере.
Проведение ПЦР. В данной работе использовались специфические праймеры, амплифициру-ющие фрагмент гена в 590 пар оснований, кодирующего поверхностный белок OmpA риккетсий группы КПЛ: 190.70b (5'-ATG-GCG-AAT-ATT-TCT-CCA-AAA'-3') и 190.701b (5'-GTT-CCG-TTA-ATG-GCA-GCA-TCT'-3')
Для приготовления реакционной смеси использовался набор для ПЦР ООО «Лаборатория Медиген». Амплификация проводилась в термоциклере «Терцик».
Режим амплификации представлен в таблице 2.
Продукты амплификации подвергались воздействию эндонуклеаз рестрикции RsaI и PstI («СибЭн-займ») путем добавления к полученному амплико-ну 1,0 мкл RsaI (сайт узнавания GT AC) в 2,0 мкл буфера для RsaI, 0,5 мкл PstI (сайт узнавания CTGCAG) в 2,5 мкл буфера для PstI. Инкубация проводилась при + 37° в течение 3 часов. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводилось в 0,7% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (pH 8,9) в течение 40 минут.
Полученные результаты суммированы в таблице 3 и иллюстрированы примерами (рис. 1).
ОБСУЖДЕНИЕ
Амплифицированные фрагменты ДНК R. sibirica subsp. sibirica и R. sibirica subsp. BJ-90 раз-
Таблица 1
в работе штаммы
Штамм Источник Пассажная история Вид риккетсии Музей
Приморье 32/84 D. silvarum морская свинка R. sibirica subsp. BJ-90 Омский НИИПИ
Баево 107/87 D. marginatus морская свинка R. sibirica subsp. sibirica -//-
Шайман D. silvarum клещевая экспериментальная модель Rickettsia sp. DnS14 Всероссийский музей риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Бурятия-5 D. silvarum клещевая экспериментальная модель Rickettsia sp. DnS28 -//-
Караганда 8/9 D. marginatus клещевая экспериментальная модель Rickettsia sp. RpA4 -//-
Подгородка 5/6 D. marginatus клещевая экспериментальная модель Rickettsia sp. RpA4 -//-
Таблица 2
Программа амплификации
Температура, С° Время Число циклов
94 3 1
94 30 сек. 44
54 30 сек.
68 90 сек.
68 7 мин. 1
4 М -
Таблица З
Результаты ПЦР-ПДРФ
Штамм и вид Количество фрагментов Rsal Количество фрагментов Pstl
R. sibirica subsp. sibirica «Баево 107/B7» 3 2
R. sibirica subsp. BJ-90 «Приморье 32/B4» 3 2
Rickettsia sp. DnS14 «Шайман» 2000 г. 2 2
Rickettsia sp. DnS2B «Бурятия-5» 2000 г. 2 2
Rickettsia sp. RpA4 «Караганда B/9» 199B г. 2 2
Rickettsia sp. RpA4 «Караганда 5/6» 199B г. 2 2
Рис. 1. Электрофореграмма ДНК штаммов, гидролизованных рестриктазами Rsal и Pstl.
резались на 3 фрагмента после обработки эндонуклеазой КБа1, с одинаковыми профилями в электро-фореграмме. Эти же ампликоны разрезались на 2 фрагмента при обработке рестриктазой РбИ, также со схожими у Я. sibirica subsp. sibirica и Я. sibirica subsp. БЛ-90 электрофоретическими профилями.
При обработке штаммов Я. sp. ОпЯ14 и Я. sp. ЭпЯ28 рестриктазой КБа1 получено 2 фрагмента, такое же количество получено после обработки ампликонов рестриктазой РбИ. Штаммы Я. sp. ЯрЛ4 имели сходную картину рестрикции по количеству и подвижности фрагментов со штаммами Я. sp. ЭпЯ14 и Я. sp. ЭпЯ28.
Все полученные картины рестрикции после обработки эндонуклеазами, принимая во внимание количество фрагментов и их электрофоретическую подвижность, можно объединить в две группы, включающие в себя:
1. Я. sibirica subsp. sibirica и Я. sibirica subsp. БЛ-90.
2. Я. sp. ЭпЯ14, Я. sp. ЭпЯ28, Я. sp. ЯрЛ4 генова-рианты (образующие один кластер в геногруппе Я. massiIiae).
Применение данных эндонуклеаз рестрикции, с нашей точки зрения, является достаточным для дифференциации такого типа. Данный подход позволяет четко осуществить дифференциацию
R. sibirica subsp. sibirica и R. sibirica subsp. BJ-90 от геновариантов R. sp. DnS14, R. sp. DnS28, R. sp. RpA4 в переносчиках на эндемичных и неэндемичных по клещевому риккетсиозу территориях.
Применение этого подхода актуально в связи с выявлением «новых» апатогенных риккетсий в клещах в очагах клещевого риккетсиоза. Необходима его апробация для идентификации риккетсий группы КПЛ в переносчиках — иксодовых клещах, собранных на эндемичных и неэндемичных по этой инфекции территориях, а также в снятых с людей клещах и материале от пациентов для установления этиологической структуры риккет-сиозов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балаева Н.М. Подходы к молекулярной эпидемиологии риккетсиозов / Н.М. Балаева // Журн. микробиол. — 1991. — № 1. — С. 72 — 75.
2. Генотипическая характеристика штаммов Rickettsia sibirica / Н.М. Балаева [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.
- 1993. - № 4. - С. 15-18.
3. Методологические подходы применения молекулярно-генетических методов в изучении риккетсий и других протеобактерий / С.Н. Шпы-нов [и др.] // Современные технологии в диагнос-
тике особо опасных инфекционных болезней: Материалы 4 Межгосударственной науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов,
2003. - С. 202-205.
4. Первое выявление Rickettsia heilongjiangensis в клещах Haemaphysalis concinna на территории России / С.Н. Шпынов [и др.] // Здоровье населения и среда обитания. - 2003. - № 12. - С. 16-20.
5. Рудаков Н.В. Классификация и основные характеристики риккетсий / Н.В. Рудаков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко // Актуальные проблемы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения: Материалы 4 межрегион. науч.-практ. конф. - Омск, 2003.
- Т. 1. - С. 152-161.
6. Шагинян И.А. Роль и место молекулярногенетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций / И.А. Шаги-нян // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т. 2, № 3. - http:/ /www.antibiotic.ru/cmac/2000_2_3/082.htm. -[4.04.2007].
7. Шпынов С.Н. Современное состояние очагов клещевого риккетсиоза в Российской Федерации / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков // ЗНиСО. -
2004. - № 10 (139). - С. 36-39.
8. «CandidatusRickettsia tamsevichiae» in Ixodes persulcatus ticks collected in Russia / S. Shpynov [et al.] // Ann. NY Acad. Sci. - 2003. - Vol. 990, June 2003. Rickettsiology: present and future directions. — P. 162— 172.
9. Detection and Identification of Spotted Fever Group Rickettsiae in Dermacentor ticks from Russia and Central Kazahstan / S. Shpynov [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Inf. Diseases. — 2001. — Vol. 20 (12).
— P. 903 — 905.
10. New Rickettsiae in Ticks Collected in Territories of the Former Soviet Union / E. Rydkina [et al.] // Emerging Infectious Diseases. — 1999. — Vol. 5, № 6.
— P. 811—814.
11. Proteinic and Genomic Identification of Spotted Fever Group Rickettsiae Isolated in the Former USSR / M.E. Eremeeva [et al.] // Journal of Clinical Microbiology. — 1993. — Vol. 31, № 10. — P. 2625 — 2633.
12. Roux V. Differentiation of Spotted Fever Group Rickettsiae by Sequensing and Analysis of Restriction Fragment Length Polymorphism of PCR-Amplified DNA of the Gene Encoding the Protein rOmpA / V. Roux, P.-E. Fournier, D. Raoult // Journal of Clinical Microbiology. — 1996. — Vol. 34, № 9. — P. 2058 — 2065.
