CC BY
62
УДК 599.323.4:616.718.004.6-022-08:1611-013.8+59111
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ИНФИЦИРОВАННЫХ ДЕФЕКТОВ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
Анвар Гиниятович Хасанов, Фарит Мирьянович Каюмов, Арина Викторовна Мельникова
Кафедра хирургических болезней (зав. — проф. А.Г. Хасанов) Башкирского государственного медицинского университета, г. Уфа, e-mail: [email protected]
Реферат
Изучалось влияние клеток пуповинной крови на регенерацию костной ткани на 48 крысах. Установлено, что клетки пуповинной крови оказывают стимулирующее влияние на регенерацию инфицированной костной ткани и приводят к полноценному восстановлению анатомической и функциональной целостности кости. В контрольной группе без применения клеток пуповинной крови полноценной регенерации костной структуры не наступило ни в одном случае.
Ключевые слова: дефект костной ткани, регенерация, пуповинная кровь.
Восстановление анатомической и функциональной целостности костной ткани после радикального хирургического лечения хронического остеомиелита длинных трубчатых костей является одной из актуальных проблем современной медицины [1, 2]. В настоящее время существует несколько способов стимуляции костной регенерации: остеокондукция с применением имплантатов искусственного или биологического происхождения, остеоиндукция с помощью морфогенетических белков и факторов роста, остеобластичес-кий остеогенез путем трансплантации стволовых клеток [1-3, 7, 9]. Основным источником мезенхимальных стволовых клеток до настоящего времени служил костный мозг. Однако инвазивность процедуры получения костного мозга, ограниченность пунктата в объеме, уменьшение содержания стволовых клеток с возрастом привели к необходимости поиска альтернативных источников стволовых клеток [5, 7, 8, 9]. Выделение из пуповинной крови мезенхимальных и неограниченно делящихся соматических стволовых клеток (USSCs — unrestricted somatic stem cells), способность их диффе-ренцировки в костную ткань при культивировании в специальных средах, а так-462
же безопасность и техническая простота взятия крови, возможность длительного консервирования и использования в качестве аутологичного трансплантата привлекли внимание к исследованию клеток пуповинной крови [4, 5, 7, 8, 9].
Целью данной работы стало экспериментальное исследование возможности применения клеток пуповинной крови для стимуляции репаративной регенерации костной ткани в условиях инфицирования.
Экспериментальное исследование проводилось на 48 взрослых нелинейных белых крысах массой 200-250 г. Животным в асептических условиях производили резекцию кортикального слоя диафи-за бедренной кости на протяжении 5 мм и глубиной 2 мм и последующее инфицирование места травмы патогенным золотистым стафилококком (106 микробных тел). Клетки пуповинной крови получали у 30 беременных самок на 20-21-е сутки гестации. Из крови пуповины выделяли фракцию ядросодержащих клеток методом седиментации эритроцитов в полиг-люкине с последующим центрифугированием взвеси при 1500 об/с.
На 30-е сутки после моделирования инфицированной костной полости производили некрэктомию и санацию полости дефекта раствором диоксидина. У 32 животных (опытная группа) в послеоперационный дефект вводили 0,2 мл взвеси клеток пуповинной крови (1х105 клеток). В контрольной группе у 16 животных дефект заполняли аутогемопломбой. Животных выводили из опыта на 15, 30, 60, 90, 120-е сутки. Гистологический материал фиксировали в 10% нейтральном фор-
Рис. 1. Рентгенограммы бедренных костей крыс: А — на 30-е сутки после стимуляции остеогенеза клетками пуповинной крови; В — на 60-е сутки после этого; С — на 60-е сутки после операции контрольной группы животных.
малине, декальцинировали в 12% растворе азотной кислоты, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и пропитывали целлоидином. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и изучали в светооптическом микроскопе. Во все сроки проводили рентгенографическое исследование оперированных конечностей.
На 15-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови в дефекте бедренной кости рентгенологически определялся участок гомогенного просветления округлой формы с облачковидным затемнением в центре. Границы полости четкие, кортикальный слой утолщен. На 30-е сутки после операции при рентгенологическом исследовании контуры костей изучаемых конечностей четкие, структура регенерата более плотная, чем
Яг ДА* » «
V V- ^
.V*'* Л • .
’ '
' У,. РСТ
. .. • •• •
окружающая костная ткань, надкостница утолщена (рис. 1А). На 60-е сутки на рентгенограмме животных подопытной группы наблюдалось восстановление костномозгового канала, структура костной ткани полностью соответствовала нормальной (рис. 1В). В контрольной группе животных на 60-е сутки после операции при рентгенологическом исследовании определялись нечеткие границы костной ткани, неоднородность структуры регенерата (рис. 1С).
У животных в подопытной группе при гистологическом исследовании препаратов на 15-е сутки после операции дефект был заполнен рыхлой соединительной тканью с участками хрящевой ткани. Отмечалось большое количество разнообразных клеточных элементов, а также кровеносных сосудов. По краям дефекта располагались очаги остеобластического характера, включавшие единичные примитивные костные балки. Зона активного остеогенеза характеризовалась выраженной базофилией как остеогенных клеток, так и остеомукоида развивающейся костной ткани (рис. 2а). На 30-е сутки после операции микроскопически дефект уменьшился в размерах, заполнился пролиферирующей хрящевой тканью со множеством прораставших кровеносных сосудов. Образование костной ткани происходило путем непрерывного разрушения хрящевых структур с перестройкой в
%тШШ
б
Рис. 2. Гистологические препараты бедренных костей крыс после стимуляции клетками пуповинной крови. (здесь и далее окраска гемотоксилин-эозином.): а — прободающие канальцы с кровеносными сосудами в зоне дефекта на 15-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови; РСТ— рыхлая соединительная ткань; КТ— костная ткань (х 400); б — энхондральный остеогенез в зоне дефекта на 30-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови; ХТ — хрящевая ткань; НК — надкостница (х 200).
г I* * V - • - . •
• - -Г№
гъгч>.. Ж
хк
¡*ё»г:
V'
а
Рис. 3. Гистологические препараты бедренных костей крыс после стимуляции клетками пуповинной крови: а — формирование костной ткани на 60-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови; ХТ — хрящевая ткань; КТ — костная ткань (х 400); б — восстановление костной структуры на 90-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови; КТ— костная ткань; КМ — костный мозг (х 200).
грубоволокнистую и последующим замещением в пластинчатую костную ткань; вокруг враставших сосудов формировались остеоны. Со стороны формировавшейся надкостницы наблюдались явления регенерации путем оппозиционного роста (рис.2б).
На 60-е сутки после операции дефект был представлен костной тканью с концентрическим расположением костных пластинок. Остеогенез наблюдался со всех сторон дефекта костной ткани, вокруг капилляров формировались костные пластинки, концентрически наслаивалось межклеточное вещество. Имели место явления резорбции костной ткани остеокластами, обновления костных структур. Формировавшиеся остеоны были узкими, с извилистым ходом. В некоторых препаратах встречались небольшие очаги хрящевой ткани, на основе которых продолжалось окостенение (рис. 3а). На 90-е сутки во всех препаратах опытной группы наблюдалось восстановление анатомической структуры костной ткани. Полностью моделированная надкостница состояла из наружного и внутреннего слоев, определялись прободавшие сосудистые каналы. Кортикальная пластинка и костномозговой канал сформированы, костная ткань различной зрелости, расположение остеонов нерегулярное, большое количество остеоцитов. В некоторых препаратах встречались локальные очаги дифферен-цировки хондробластов и хондроцитов в 464
остеобластические клетки. Между сформированными костными трабекулами определялась миелоидная ткань с большим количеством форменных элементов крови; непосредственно под надкостницей находились ориентированно расположенные костные пластинки. Таким образом, в зоне травмы кости наблюдалось восстановление гемопоэза и иммуногенеза (рис. 3б).
В контрольной группе без трансплантации клеток пуповинной крови формирование гистологических структур, характерных для трубчатых костей (осте-онов с функционирующими гаверсовыми каналами), происходило в более поздние сроки, чем в опытной группе, костные дефекты были большего размера на всех сроках наблюдения. Во многих препаратах ранних сроков имелась лейкоцитарная инфильтрация регенерата и окружающей костной ткани, что свидетельствовало о некупирующемся воспалительном процессе. На 60-е сутки после операции костный дефект был заполнен грубоволокнистой соединительной тканью со скоплениями хрящевых клеток по краям (рис. 4а). К 90-м суткам область дефекта была представлена костно-хрящевым регенератом с очагами неоформленной плотной соединительной ткани с диффузным расположением макрофагов и лимфоцитов. Кортикальная пластинка не восстановлена, надкостница утолщена. На 120-е сутки после операции костномозговой канал не
З'У&й ‘ ....
v. .
б
Рис. 4. Гистологические препараты бедренных костей крыс контрольной группы: а — очаги хрящевой ткани (ХТ) на границе рыхлой соединительной ткани (РСТ) и костной ткани (КТ); 60-е сутки после операции (х 200); б — неполноценное восстановление костной ткани в зоне дефекта (Д), костномозговой канал не сформирован (КМК); 120-е сутки после операции (х 100).
прослеживался, регенерат был несколько тоньше объема дефекта, отмечались явления перестройки костной ткани (рис. 4б). Таким образом, полноценного восстановления костной структуры без трансплантации клеток пуповинной крови не происходило.
Полученные результаты экспериментального исследования подтвердили предположение о стимулирующем влиянии клеток пуповинной крови на регенерацию костной ткани, что может быть обусловлено несколькими факторами. Из источников литературы известно, что клетки пуповинной крови обладают собственной потенцией костеобразования и способны дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в специальных средах [4-9]. Описанный факт прямой дифференцировки стволовых клеток пуповинной крови в костные клетки, хотя бы даже в условиях in vitro, уже может свидетельствовать о существовании такой возможности и in situ в организме. Помимо этого, с наличием в пуповинной крови эндотелиальных проге-ниторных клеток может быть связано явление стимулированного ангиогенеза, что в условиях нарушенного кровоснабжения костной ткани имеет большое значение для эффективного репаративного остеогенеза [6, 7, 9]. За счет выделения биологически активных веществ, факторов роста, трофических и других факторов происходит активация регенерации собственных
клеток поврежденного органа из-за стимуляции процессов ангиогенеза и нейрогенеза и уменьшаются явления апоптоза клеток [3, 6, 8, 9]. Трансплантация клеток пуповинной крови приводила не только к более раннему и полноценному восстановлению костной структуры, но и к купированию воспалительного процесса в костной ткани.
Таким образом, трансплантация клеток пуповинной крови в инфицированный дефект трубчатой кости обеспечила формирование органоспецифичного костного регенерата и восстановление анатомически полноценной структуры поврежденной кости. Простота и безопасность получения, высокая пролиферативная и секреторная активность, отсутствие этических и законодательных проблем подтверждают перспективность дальнейшего изучения клеток пуповинной крови и возможности использования их в клинической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А. Морфологические и клинические аспекты репаративной регенерации опорных органов и тканей.- М., 1996. — 220 с.
2. Омельяненко Н.П., Миронов С.П., Денисов-Никольский и др. Современные возможности оптимизации репаративной регенерации костной ткани. //Вестн. травматол. — 2002. — № 4. — С. 85-88.
3. Русакова Н.В. Функциональная морфология клеток в остеогенезе. — Киев: Наукова думка, 1989. — 186 с.
4. Erices A., Conget P., Mingue¡¡ J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood//Br. J. Hematol. — 2000. — Apr. — Vol.109 (1). — Р. 235-242.
5. Goodwin H.S., Bicknese A.R., S.N.Chien, B.D. Bogucki.
Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers //Biol Blood Marrow Transplant. — 2001. —
Vol. 7.- P. 581-588.
6. Hartman E. Ectopic bone formation in rats: the importance of vascularity of the acceptorsite. //Biomaterials. —
2004. — Vol. 25. — N. 27 — P. 5831-5837.
7. Kugler G, Sensken S., Airey J.A. et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential //JEM. — 2004. — Vol. 200 — P. 123-135.
8. Lee O.K., Kuo T.K., Chen W. et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood //Blood. — 2004. — № 10. — P.1669-1675.
9. Tondreau T, Meuleman N, Delforge A. et al. Mesenchymal Stem Cells Derived from CD 133-Positive Cells in Mobilized Peripheral Blood and Cord Blood: Proliferation, Oct4 Expression, and Plasticity. //Stem Cells. —
2005. — Vol. 23. — № 8 Sept. — P. 1105-1112.
Поступила 22.05.08.
УДК 616.728.2-089.844:616.832.9-089.5
USE OF UMBILICAL CORD BLOOD CELLS TO RESTORE INFECTED DEFECTS OF LONG TUBULAR BONES IN THE PRESENCE OF INFECTION
Khasanov A.G., Kayumov F.A., Melnikova A.V.
Summary
The influence of umbilical cord blood cells on bone tissue regeneration was studied in 48 rats. It was found that umbilical cord blood cells have a catalytic effect on the regeneration of infected bone tissue and lead to full restoration of the anatomical and functional integrity of bone. In the control group (without umbilical cord blood cells) full regeneration of bone structure did not occure.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОБЕЗБОЛИВАНИЯ ПРИ ЭНДОПРОТЕЗИРОВАНИИ ТАЗОБЕДРЕННОГО СУСТАВА
Рустам Рафильевич Сафин, Равиль Ярхамович Хабибьянов
Научно-исследовательский центр Татарстана “Восстановительная травматология и ортопедия",
г. Казань, e-mail: [email protected]
Реферат
Установлено, что для эндопротезирования тазобедренного сустава у пациентов с сердечно-сосудистой патологией более предпочтителен альтернативный вариант анестезии подогретым до 38,5°С гипобаричес-ким анестетиком бупивакаином.
Ключевые слова: спинальная анестезия, бутивака-ина гидрохлорид (маркаин), изофлюран.
Спинальная и эпидуральная анестезия (СА и ЭА) относятся к числу рекомендованных методов обезболивания при эндопротезировании тазобедренного сустава (ЭТБС). СА и ЭА часто дополняются общей анестезией с целью выключения сознания больного во время операции. В чистом виде общая анестезия применяется только в тех случаях, когда возникают непреодолимые технические трудности в осуществлении ЭА и СА. Существенным недостатком СА является её непредсказуемость. При СА требуется одновременно вносить поправки в зависимости от возраста, роста, анатомических особенностей позвоночника, уровня пункции, направления спинальной иглы, величины и дозы вводимого препарата, удельной 466
плотности ликвора, удельной плотности и баричности спинального введения 0,5% раствора маркаина, позиции пациента на операционном столе. При СА могут быть «сюрпризы» в виде неадекватной анестезии, чрезмерно высокого уровня анестезии, непревиденно короткого времени спинального блока. Непредсказуемость свойственна также ЭА, даже выполненной технически безупречно, с адекватным подбором дозы и объёма анестетика. Осложнения ЭА могут проявиться развитием мозаичного или одностороннего блока, неудовлетворительной анестезией корешков пояснично-крестцового сплетения. Осложнения, связанные с непредвиденно высоким блоком, также свойственны ЭА, хотя и в значительно меньшей степени, чем СА. Тем не менее наибольшую угрозу для больных при СА и ЭА представляет развитие артериальной гипотонии и бра-дикардии [6, 7].
Цель работы заключалась в модификации техники СА с целью обеспечения гемодинамической стабильности и со-
