CC BY
82
УДК 616.716.1-089.23:611.018.4
1 1 2-3 1-2 1
Алексеева И.С., Кулаков А.А., ' Гольдштейн Д.В., ' Волков А.В, Шураев А.И. ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ОБЪЕМА КОСТНОЙ ТКАНИ НА ВЕРХНЕЙ ЧЕЛЮСТИ (СРОК НАБЛЮДЕНИЯ ДО 21 МЕСЯЦА)
ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХМинздравсоцразвития России», Москва 2ЗАО «РеМеТэкс», Москва
3 УРАМН «Медико-генетический научный центр РАМН», Москва Контактная информация
Алексеева Ирина Сергеевна, канд. мед. наук, врач клиники «Дента Эль» Адрес: Москва, Хорошевское ш., 68, тел. +7(916)653-11-26 E-mail: [email protected]
Статья поступила: 11.02.2012, принята к печати 29.02.2012.
Изучение механизмов регенерации различных органов и тканей с использованием клеточных технологий получило значительное развитие за последнее десятилетие. Возросло количество исследований по использованию стволовых клеток для устранения дефектов костной ткани в хирургической стоматологии. Проведено клиническое исследование по восстановлению костной ткани у пациентов с выраженной атрофией альвеолярного отростка верхней и нижней челюстей с помощью тканеинженерных конструкций. Источником мультипотент-ных стромальных клеток для изготовления тканеинженерной конструкции была жировая ткань. Для изучения характеристик полученного костного регенерата через 4 мес. после проведения трансплантации мы проводили гистологическое исследование.
Ключевые слова: жировая ткань, липоаспират, стромальные клетки, тканевая инженерия, костная ткань.
'Alekseeva I.S, 'Kulakov A.A2,3, , D. Goldstein12, AV Volkov1'2, 1Shuraev A. EXPERIENCE OF CONSTRUCTION TKANEINZHENERNOY TO INCREASE THE VOLUME OF BONE On the upper jaw (TERM MONITORING TO 21 MONTHS)
'FGU "TsNIIS and Maxillofacial Surgery Health Ministry of Russia", Moscow
2ZAO "ReMeTeks", Moscow
3 URAMN "Medical Genetics Research Center", Moscow
Investigation of the mechanisms of regeneration of various organs and tissues using cellular technology has developed considerably over the last decade. Increased number of studies on the use of stem cells to correct defects in bone tissue dental surgery. Adipose tissue was used as a source of multipatent stem cells to produce tissue engineering. It was a clinical study on the restoration of bone tissue in patients with severe atrophy of the alveolar process of the maxilla with tissue engineering. To study the characteristics of the obtained bone regenerate within 4 months after transplantation examined histologically.
Key words: adipose tissue, lipoaspirat, multipatent stem cells, tissue engineering, bone tissue.
Введение
Восстановление костной ткани с помощью ТИК вызывает большой интерес исследователей и клиницистов [2; 4; 7; 8]. Первый этап создания ТИК включает в себя эксфузию аутогенного клеточного материала, выделение тканеспецифических клеток и получение их культуры. Далее производится диффе-ренцировка культуры малодифференцированных клеток в необходимом направлении. Эквиваленты костной ткани получают путем направленной диф-ференцировки стволовых клеток костного мозга, надкостницы, жировой ткани [5; 6; 9-12]. Затем культура клеток помещается на носитель (матрицу).
Далее конструкция вводится в зону дефекта [1; 3]. При культивировании клеток для получения объёма, необходимого для успешной стимуляции остеогенеза, как правило, используется не более 4-6 пассажей, что позволяет получить достаточное количество клеточного материала для трансплантации.
В зависимости от индивидуальных способностей организма на это требуется от 3 до 5 недель. Клетки, культивированные до 10 пассажей, считаются безопасными для клинического применения [11; 13].
С 2006 по 2011 год на базе ФГУ «ЦНИИС» Росмедтехнологий совместно с ЗАО «РеМеТэкс» в соответствии с решением Ученого совета и этического комитета ФГУ «ЦНИИС» Росмедтехнологий проводилось клиническое исследование по восстановлению костной ткани у пациентов с выраженной атрофией альвеолярного отростка в области верхней и нижней челюсти с помощью тканеинже-нерных конструкций на основе мультипатентных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ). В рамках клинического исследования было проведено лечение 20 пациентов.
Материалы и методы
Для создания ТИК использовали культуру мультипотентных стромальных клеток СВФ ЖТ. СВФ ЖТ выделяли из аутолипоаспирата пациентов. Липоаспирацию проводили по стандартной методике под местной инфильтрационной анестезией в области передней брюшной стенки.
Объем липоаспирата рассчитывали, исходя из предполагаемого объема ТИК, а также с учетом объема, который подвергался криоконсерви-рованию.
76 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ...
В зависимости от этих факторов объем липо- течение 6 часов, после чего проводилась промывка аспирата составлял 20-60 мл. Липоаспират промы- образцов в фосфатном буфере (pH=7,4). дЛя полували раствором Версена и дезагрегировали путем чения серийных срезов материал обезвоживали и инкубации в нем с добавлением 0,25 %-ного трип- заливали в парафин. сина при 37 °С в течение 1,5 часов. Клеточную сус- Для проведения гистоморфометрического пензию центрифугировали 10 минут при 1100 исследования из серии срезов случайным образом с об/мин, осадок разводили ростовой средой помощью программного обеспечения Random вы-(DMEM/F12 1:1 с добавлением аутологичной сыво- бирали 6 стекол, содержащих 4 среза. 5 стекол ок-ротки до 10%, амикацина до 500 мг/л), переносили рашивали по Массону-Голднеру, 1 - гематоксили-в чашки Петри и инкубировали при стандартных ном по Мейеру с докраской эозином. культуральных условиях (37 °С, 5% СО2). Для морфометрического анализа выбирали Плотность посева составляла 1,5-2 тыс. кле- третий слева срез. Если его качество было недостаток на см2. Спустя двое суток не прикрепившиеся точно высоким, выбирали следующий. клетки удаляли, заменяя ростовую среду на све- С помощью этого метода рандомизации дос-жую. По достижении 80 %-ного конфлюентного тигалась максимально случайная выборка объекта монослоя клетки рассевали в новую культур3 альную исследования. посуду в плотности 1,5-2 тыс. клеток на см . Ростовую среду меняли каждые 3 суток. Клинический пример 1 (рис. 1; см. вкл.) Для направленной остеогенной дифференци- Пациентка Р., 51 года. ровки клетки рассаживали на 90 мм чашки Петри и Диагноз: «вторичная частичная адентия на верхней и по достижении 80 %-ного конфлюентного монослоя нижней челюсти, хронический генерализованный па-заменяли ростовую среду на дифференцировочную родонтит тяжелой степени тяжести». (DMEM с 10% аутологичной сыворотки крови, 100 Осмотр: подвижность 16; 17; 27; 13; 12; 11 - 3 степени. мкг/мл амикацина, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты, КТ: атрофия альвеолярного отростка, изменен-10 мМ/л Р-глицерофосфата натрия и 10 нМ 1,25- ная периодонтальная щель в области 27; 11; 12; дигидроксивитамина D3). Замену среды на свежую 13; 16; 17. Утолщение слизистой верхнечелюст-производили каждые 3 суток. ных пазух. Высота альвеолярного отростка до трансплантации области отсутствующих зубов: Приготовление PRP 14 - 2 мм; 15 - 2,6 мм; 25 - 0,9 мм; 26 - 0,9 мм. (плазмы, обогащенной тромбоцитами) Лечение. А: Экстракция 16; 17; 27; 13; 12; 11. Забор крови проводили в вакуумную систе- Б: Операция. Двухсторонний синус-лифтинг ТИКЖТ му типа Vacuette® с цитратом натрия. Кровь цен- (лунки удаленных зубов заполнены тканеинженерной трифугировали при скорости 1000 об/мин в течение конструкцией). V трансплантата 9 см3. Был пере-10 мин, отбирали верхний слой (без эритроцитов) и мещен полнослойный слизисто-надкостничный лос-центрифугировали его при скорости 3600 об/мин в кут в области удаленных зубов, рана ушита наглухо. течение 10 мин. Большую часть супернатанта уда- На период подготовки к имплантации изготовлен ляли, осевшие тромбоциты ресуспендировали в временный съемный протез на верхнюю челюсть. оставшейся плазме. В: Имплантация. Через 4 месяца после трансплантации ТИК ЖТ по данным КТ высота альвео-Подготовка лярного гребня составила: 14 - 6,5 мм; 15 - 11,1 такнеинженерной конструкции мм; 16 - 9 мм; 17 - 8 мм; 25 - 11,5 мм; 26 - 10,7 к трансплантации мм. В альвеолярных бухтах с 2 сторон участки В качестве носителя использовали «Остео- сформированной костной ткани, сливающейся с матрикс» в виде блоков и костной крошки (ООО костной тканью альвеолярного отростка, по «Конектбиофарм»). После отмывания блоков рас- плотности соответствующей неизменной костной твором Хэнкса («ПанЭко») с цефазолином (ОАО ткани. Через 4 мес. после трансплантации прове-«Синтез») (1г/Л) на них аккуратно наслаивали PRP, дена имплантация с установкой 8 имплантатов содержащую 7*106 клеток в см3, и по каплям до- Bicon 0: 17; 15; 25; 25 - 4,5 на 8 мм, 13 и 23 - 4,0 на бавляли раствор тромбина ("P.Z. Cormay") 50 Ед/мл 8 мм и 11; 21 - 3,5 на 8 мм. Все имплантаты были на 10 %-ном р-ре хлорида кальция (ОАО «Даль- заглублены на 2 мм. химфарм») до полимеризации. Осложнение. В области имплантата, установленного в проекции 17; 2 нед. сохранялся болевой Гистологические методы симптом и выраженный отек слизистой. Расхо-Для изучения характеристик костного реге- ждения швов не было. Швы сняты через 7 дней. нерата через 4 месяца после проведения трансплан- Через 4 мес. после раскрытия имплантатов для тации проводили гистологическое исследование. установки формирователя десны была выявлена Образцы тканей забирались 2 мм трепаном в виде подвижность имплантата в области 17 - им-столбиков. Забор образцов тканей проводился пе- плантат удален. ред формированием ложа для установки дентально- Гистология. В материале из регенерата, обнару-го имплантата. жена формирующаяся костная ткань (рис. 3). Биопсийный материал, полученный от паци- Обследование. Через 12 мес. после внутрикостной ентов во время дентальной имплантации, помещали имплантации и 16 мес. после трансплантации ТИК в забуференный нейтральный 10 %-ный формалин ЖТ КТ: в области проведенной трансплантации (Biooptica, Italy) и фиксировали 24 часа. видна неизменная костная ткань. Образцы для гистологического исследования Клинический пример 2 (рис. 4; см. вкл.) представляли собой столбики костной ткани 3 мм в Пациент Б., 1953 лет диаметре и длинной от 8 до 10 мм. Жалобы: обратился на затрудненное пережевыва- Фиксированный материал промывали про- ние пищи из-за адентии 16; 14. точной водой в течение 24 часов. Затем проводили КТ: Дефект костной ткани в области вестибуляр-кислотную декальцинацию с использованием смеси ной кортикальной пластинки в проекции отсутст-соляной и муравьиной кислот (Biooptica, Italy) в вующего 16 зуба, медиальной стенки корня 17 зуба,
№ 1/том 11/2012 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
далее дефект распространялся в область дна верхнечелюстной пазухи, снижение высоты альвеолярного отростка в области дна верхнечелюстной пазухи: 16 зуба - 1 мм, толщина костной ткани от верхушки 15 до нижней стенки пазухи около 2 мм. Лечение: А: Удаление 17.
Б: Операция. открытый синус-лифтинг. В область дна верхнечелюстной пазухи введена ТИК ЖТ, костный дефект и лунка 17 зуба также заполнены ткане-инженерной конструкцией. V трансплантата - 4 см3. В: Имплантация. Через 4 месяца на КТ высота костной ткани в области отсутствующих зубов: 16 -16 мм, 17 - 14 мм, от верхушки корня 15 - 6 мм. В альвеолярной бухте и зоне удаленных зубов, сформированная костная ткань, сливающаяся с костной тканью альвеолярного отростка, по плотности соответствующая неизмененной костной ткани. Пациенту были установлены 3 имплантата Ысвп 0 4,5 на 11 мм в области отсутствующих зубов -14; 16; 17. Гистология. В материале из регенерата, обнаружена формирующаяся костная ткань (рис. 5). Обследование. Через 21 мес. после трансплантации ТИК ЖТ и 17 мес. после имплантации. КТ: параметры костной ткани не изменены. Морфологически через 120 дней после трансплантации ТИК ЖТ: образцы состояли из трех зон, материнской кости, промежуточной и зоны регенерата (рис. 5). Зона материнской кости состоит из 2 параллельных пластинок компактной кости с прослойкой губчатой кости между ними, содержащей желтый костный мозг и незначительное количество красного костного мозга.
Зона, содержащая тканеинженерную конструкцию, состоит преимущественно из новообразованной трабекулярной костной ткани, ее относительная объемная доля составила 39,3%. Рыхлая волокнистая соединительная ткань с красным и желтым костным мозгом занимает основной объем меж-трабекулярного пространства и составляет 37%. Относительная доля ткани (8 %) и депозитов фибрина (2,5 %) занимает незначительную часть костного регенерата.
Заключение
Результаты многих исследований по применению ТИК на основе МСК являются предварительными, и, тем не менее, методы тканевой инженерии, направленные на восстановление костной ткани, являются малоинвазивными и позволяют получить предсказуемый результат, расширяя, тем самым, возможности проведения костнопластических вмешательств.
Ни в одном из опубликованных клинических исследований по устранению дефектов костной ткани с использованием МСК не отмечалось побочных эффектов, таких как воспаление или чрезмерный рост ткани.
Таким образом, разработка методов восстановления костных дефектов с использованием МСК ЖТ может стать эффективным и наиболее перспективным решением сложной клинической задачи по восстановлению костной ткани и стимуляции репаративного остеогенеза.
Литература
1. Волков А.В. Тканевая инженерия: новые перспективы развития медицины. - клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - №1, 2005. - с. 57-64.
2. Athanasiou K. A., C. Zhu, D. R. Lanctot, C. M. Agrawal, andx. Wang. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. - tissue eng. 2000. 6: 361-81.
3. C. D. Helgason and c. L. Miller (edited by). Methods in molecular biology, vol. 290: basic cell culture protocols, p. 173-85. Third edition.: © humana press inc., totowa, nj.
4. Jiang H., Xiaohua L., Peter X. Biomineralization and bone regeneration. Principles of regenerative medicine (second edition), 2011. P. 733-45.
5. Kassem M., Abdullah B.M., Saeed H. Osteoblastic cells: differentiation and trans-differentiation. - arch. Biochem. Biophys. - 2008, may 15;473(2): 183-7.
6. Kern S., Eichler H., Stoeve J., Kluter Z., Bieback K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. - stem cells. - 2006; 24: 1294-301.
7. Kuhbier J.W., Weyand B., Sorg H., Radtke C., Yogt P.M., Reimers K. Stem cells from fatty tissue: a new resource for regenerative medicine? - chirurg. - 2010 sep;81(9): 826-32.
8. KwanM.D., Slater B.J., Wan D.C., Longaker M.T. Cell-based therapies for skeletal regenerative medicine. -hum. Mol. Genet. - 2008;17: p. 93-8.
9. Muscler G.F, Nacamoto C., Griffith L.G. Engineering principles of clinical cell-based tissue engineering. -j. Bone joint surg. Am. - 2004; 86-a(7): 1541-58.
10. Lee J.A., Parrett B.M., Conejero J.A. Et al. Biological alchemy: engineering bone and fat from fat-derined stem cells. - ann. Plast. Surg. 2003; 50(6): 610-7.
11. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D. Et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999; 284(5411): 143-7.
12. Rose F.R., OreffoR.O. Bone tissue engineering: hope vs hype. Biochem biophys res commun. 2002; 292: 1-7.
13. Rubio D., Garcia-castro J., Martin M.C., De La Fuente R., Cigudosa J.C., LloydA.C., BernadA. Spontaneous human adult stem cell transformation. - cancer research. - 2005; 65(8): 3035-9.
