CC BY
30
УДК б1б.71-001-08:[б11-018.1.5-013.8]-018.4-003.93-092.9
ВЛИЯНИЕ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ НА РЕПАРАТИВНУЮ РЕГЕНЕРАЦИЮ КОСТНОЙ ТКАНИ
А. Г. Хасанов, Ф. А. Каюмов, А. В. Мельникова
Введение
Одной из актуальных проблем медицины является поиск путей влияния на репаратив-ную регенерацию костной ткани. В настоящее время существует несколько способов стимуляции регенерации: остеокондукция с применением имплантантов искусственного или биологического происхождения, остео-индукция с помощью морфогенетических белков и факторов роста, остеобластический остеогенез путем трансплантации стволовых клеток [3, 5, 6, 10, 13].
Основным источником мезенхималь-ных стволовых клеток до настоящего времени являлся костный мозг. Выделение из пуповинной крови мезенхимальных и неограниченно делящихся соматических стволовых клеток (USSCs — unrestricted somatic stem cells), способность их дифференциров-ки в костную ткань при культивировании в специальных средах, а также безопасность и техническая простота забора крови, возможность длительного консервирования и использования в качестве аутологичного трансплантата привлекли внимание к исследованию клеток пуповинной крови [2, 7, 8, 9, 11, 12, 13].
Цель работы — изучение влияния клеток пуповинной крови на репаративную регенерацию костной ткани при экспериментальном остеомиелите.
Материалы и методы
Пуповинная кровь была получена у 30 беременных самок на сроке 20—21-е сутки гестации путем пункции пуповины и забора крови в шприц с 6% раствором ЭДТА (дина-триевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в соотношении не менее 10:1. Взвесь ядросодержащих клеток получена методом седиментации эритроцитов в поли-глюкине в соотношении 1:2 с последующим промыванием клеток в фосфатно-солевом буфере. Таким образом, получали 1,8—2 х107 клеток в 1 мл.
Исследование проведено на 54 нелинейных белых крысах массой 200—250 г, у которых моделировали экспериментальный остеомиелит путем открытой остеотомии в диафизе бедренной кости на протяжении 5 мм со вскрытием костномозгового канала и последующим инфицированием места травмы патогенным золотистым стафилококком (106 микробных тел).
На 30-е сутки после моделирования экспериментального остеомиелита у 6 крыс проведено бактериологическое, рентгенологическое и гистологическое исследование оперированных конечностей. 32 животным (опытная группа) в дефект бедренной кости вводилось 0,2 мл взвеси клеток, дефект прикрывался коллагеновой пленкой. В контрольной группе у 16 животных дефект заполнялся аутогемопломбой. На 5, 10-е сутки после операции в опытной группе животных в область
дефекта производилось повторное инъекционное введение клеток пуповинной крови. В ходе всего эксперимента осуществляли динамическое наблюдение за состоянием животных: аппетит, двигательная активность, состояние оперированных конечностей. На 15, 30, 60, 90, 120-е сутки проводилось бактериологическое исследование мазков из костного дефекта и морфологическое исследование оперированных конечностей, отсеченных у животных контрольных и опытных групп. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином и изучали в свето-оптическом микроскопе. Во все сроки проводили рентгенографическое исследование оперированных конечностей.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с определением средней арифметической вариационного ряда (М), стандартного отклонения (StD), стандартной ошибки среднего объема выборки (п), критерия Стьюдента 0 для сравнения средних величин, углового преобразования Фишера (ф*) для сравнения качественных показателей. Все статистические данные считались достоверными при уровне значимости а менее 5% (р<0,05).
Результаты и обсуждение
Экспериментальная модель остеомиелита характеризовалась возникновением выраженного воспалительного процесса в области операции, поражающего все слои костной ткани: надкостницу, кортикальную пластину, костномозговой канал, с формированием плотного соединительнотканного рубца, что подтверждалось рентгенологическим и морфологическим исследованиями (рис. 1).
В опытной группе животных после замещения костного дефекта клетками пуповин-ной крови в послеоперационном периоде наблюдались осложнения: отек и гиперемия мягких тканей в области операции у 4 крыс, перелом бедренной кости с формированием
Рис. 1. Секвестрация некротизированного участка компактной кости (С), экссудативное воспаление в костной ткани (КТ), лейкоцитарная инфильтрация рыхлой соединительной ткани (РСТ) и хрящевой ткани (ХТ) в зоне дефекта на 30-е сутки после моделирования экспериментального остеомиелита. Окраска гематоксилин-зозином. у-100
ложного сустава в одном случае. Бактериологическое исследование показало, что инфи-цированность золотистым стафилококком костного регенерата наблюдалась в 2 случаях на 15-е сутки после операции. В дальнейшие сроки наблюдения бактериологический анализ дал отрицательный результат. В контрольной группе у 8 животных наблюдались более ранние (на 4-е сутки) проявления воспалительных осложнений со стороны послеоперационных кожных ран и позднее их купирование (к 14—15-м суткам), а также 4 случая перелома оперированной конечности. Бактериологический анализ мазков из области костного дефекта выявил рост золотистого стафилококка в 3 случаях на 15-е сутки, в 4 случаях — на 30-е сутки и в 1 случае — на 60-е сутки после операции.
В опытной группе животных опора на конечность восстанавливалась в среднем на 4,34±0,9 суток (ШБШ). К 5—6-м суткам у 4 животных появился умеренный отек в области послеоперационной раны, который купировался после трехкратной обработки кожного покрова 3% спиртовым раствором йода на 8,75±0,96 суток (М±StD). Послеоперационные раны заживали в среднем на 7,4±0,9 суток (М±StD). У животных конт-
рольной группы отек и гиперемия купировались на 11,7±1,8 суток (М±StD), опора на конечность появлялась на 5,31 ±1,14 суток после операции (М±StD), операционные раны заживали в среднем на 9,7±1,5 суток (М±StD).
Морфологические изменения в костной ткани под воздействием клеток пуповинной крови характеризовались формированием грубоволокнистой и пластинчатой костной ткани к 60-м суткам после операции. В последующем регенераторные процессы не стихали, продолжалась перестройка костной ткани: формирование кортикального слоя
кости и костномозгового канала, заполненного кроветворным костным мозгом. Полноценное восстановление анатомической структуры кости наблюдалось на 90-е сутки после замещения дефекта клетками пуповин-ной крови (рис. 2).
В контрольной группе животных без замещения дефекта клетками пуповинной крови полноценного восстановления костной структуры не происходит, что подтверждено рентгенологическим и гистологическим исследованиями оперированных конечностей. Длительно сохранялись воспалительные изменения в костной ткани. Наблюдались явле-
б
Рис. 2.
а — Формирование хрящевой ткани (ХТ) и примитивных костных балок (КТ) по краям дефекта (Д), образование надкостницы (НК) на 15-е сутки после трансплантации клеток пуповинной крови. Окраска гематоксилин-эозином. у-100. б — Сформированная костная ткань (КТ), надкостница (НК) и костномозговой (КМ) канал на 90-е сутки после операции на животных опытной группы. Окраска гематоксилин-зозином. у 100
Рис. 3.
а — Воспалительная реакция в зоне дефекта (Д) бедренной кости крыс на 15-е сутки после операции на животных контрольной группы (КТ — костная ткань). Окраска гематоксилин-эозином, у 100. б — Плотный соединительнотканный рубец (Д) между краями кортикальной пластины (КТ) на 90-е сутки после операции на животных контрольной группы. Окраска гематоксилин-эозином, у 100
б
ния замедления и остановки регенераторных процессов, о чем свидетельствовало образование плотной соединительнотканной рубцовой структуры в зоне дефекта, либо формирование зрелой костной ткани без восстановления анатомической целостности кости: сужение кортикального слоя кости, сужение или закрытие костномозгового канала замыкательной пластиной (рис. 3).
Сравнительный анализ клинического течения послеоперационного периода показал, что замещение клетками пуповинной крови костных полостей экспериментального остеомиелита приводит к более быстрому заживлению послеоперационных ран 0=5,6; р=0,00001) и более раннему восстановлению опорных свойств оперированной конечности 0=3,03; р=0,004). Воспалительные изменения мягких тканей в области операции также купировались значительно быстрее в опытной группе животных, чем в группе сравнения 0=3,35; р=0,01). Помимо этого, в опытной группе животных наблюдалось значительно меньшее количество переломов оперированных конечностей (ф*=2,259; р<0,05) и осложнений со стороны мягких тканей (ф*=2,77; р<0,01). Инфицированность золотистым стафилококком костного дефекта также наблюдалась реже, чем в группе контроля (ф*=2,654; р<0,01).
Полученные результаты экспериментального исследования подтвердили предположение о стимулирующем влиянии клеток пуповинной крови на регенерацию костной ткани, что может быть обусловлено несколькими факторами. Из литературных источников известно, что клетки пуповин-ной крови обладают собственной потенцией костеобразования и способны дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в специальных средах [2, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14]. Помимо этого, с наличием в пуповинной крови эндотелиальных про-гениторных клеток может быть связано яв-
ление стимулированного ангиогенеза, что в условиях нарушенного кровоснабжения костной ткани имеет большое значение для эффективного репаративного остеогенеза [2, 4, 10, 13]. Выделение биологически активных веществ, факторов роста, трофических факторов обеспечивают активацию регенерации собственных клеток поврежденного органа и уменьшают явления апоптоза клеток [1, 6].
Вывод
Таким образом, трансплантация клеток пуповинной крови в дефект трубчатой кости обеспечила формирование органоспецифич-ного костного регенерата и восстановление анатомически полноценной структуры поврежденной кости. Простота и безопасность получения, высокая пролиферативная и секреторная активность, отсутствие этических и законодательных проблем подтверждают перспективность дальнейшего изучения клеток пуповинной крови и использования их в клинической практике.
Библиографический список
1. Владимирская Е. Б. Биологические основы терапии стволовыми клетками/Е. Б. Влади-мирская//Клиническая лабораторная диагностика.— 2006.— № 4.— С. 26—32.
2. Исаев А. А. Применение клеток пуповин-ной крови в клинической практике/ А А Исаев, В. С. Мелихова//Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.— 2008.— № 1.— С. 34—43.
3. Современные возможности оптимизации репаративной регенерации костной ткани/Я. П. Омельяненко, С. П. Миронов, Денисов-Никольский и др.//Вестник травматологии и ортопедии им. И. И. Приорова.— 2002.— № 4.— С. 85—88.
4. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential/G. Kogler, S. Sensken, J. A Airey et al.//JEM— 2004.— Vol. 200.— № 2.— P. 123—135.
5. Administrations of peripheral blood CD34-positive cells contribute to medial collateral ligament healing via vasculogenesis/K. Tei, T. Matsumoto, Y. Mifune et aL//Stem Cells.— 2008.— Vol. 26.— № 3.— P. 819—830.
6. Bostrom M. P. Transforming growth factor beta in fracture repair/M. P. Bostrom, P. As-nis//Clin. Orthop. Relat. Res.— 1998— Suppl. 355.— P. 124—131.
7. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood/Л. Bieback, S. Kern, H. Kluter et al.//Stem Cells.— 2004.— Vol. 22— P. 625—634.
8. Erices A. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood/A. Erices, P. Conget, J. J. Minguell//Br. J. Hematol— 2000.— Vol. 109.— № 1.— Р. 235—242.
9. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood/O. K. Lee, T K. Kuo, W Chen, K. Lee et al.//Blood—
2004.— № 10.— P. 1669—1675.
10. Local delivery of granulocyte colony stimulating factor-mobilized CD34-positive progenitor cells using bioscaffold for modality of unhealing bone fracture/ Y. Mifune, T. Matsumoto, A. Kawamoto et al.//Stem Cells.— 2008.— Vol. 26.— № 6— P. 1395—1405.
11. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood: proliferation, Oct4 expression, and plasticity/T. Tondreau, N. Meuleman, A. Delforge et al.//Stem Cells.—
2005.— Vol. 23.— № 8.— P. 1105—1112.
12. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers/ H. S. Goodwin, A. R. Bicknese, S. N. Chien et al.//Boil. Blood Marrow Transplant.— 2001.— Vol. 7.— № 11.— P. 581—588.
13. Spontaneous differentiation of mesen-chymal stem cells obtained from fetal rat circulation/K. Naruse, K. Urabe, T. Mukaida et al.//Bone.— 2004.— Vol. 35.— № 4.— P. 850—858.
A. G. Khasanov, F. A. Kayumov, A. V. Melnikova
EFFECT OF UMBILICAL BLOOD CELLS
ON REPARATIVE REGENERATION OF BONE TISSUE
One of alternative (to bone marrow) sources of stem cells is umbilical blood. The study of the influence of umbilical blood cells on bone tissue regeneration was performed on 54 rats. After modeling of infected bone cavity in shaft of the femur, the defect was filled with the cells of umbilical blood in 32 animals while it was left free in 16 animals (control group). The results of the study demonstrated that umbilical blood cells have stimulating effect on bone tissue regeneration and lead to full reparation of anatomic and functional integrity of the bone. In the control group, without umbilical blood cells, complete restoration of bone structure occurred in no cases.
Keywords: umbilical blood cells, bone tissue, regeneration.
Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа
Материал поступил в редакцию 09.03.2008
