CC BY
112
Хвойные бореальной зоны, XXXI, № 3 - 4, 2013
УДК 561.284.579.61
использование глубинной биомассы мицелия
pleurotus pulmonarius в качестве посевного материала
для выращивания плодовых тел
Е.А. Мельникова, Т.М. Тарченкова, П.В. Миронов
ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» 660049, Красноярск, пр. Мира, 82; е-mail: [email protected]
В работе исследована возможность получения биомассы мицелия Pleurotus pulmonarius методом глубинного культивирования на синтетической среде контролируемого состава. На практике показана перспективность использования данной биомассы в качестве посевного материала для получения плодовых тел на растительном субстрате методом твердофазного культивирования. Проведен сравнительный анализ количественного и качественного состава белков, выделенных из плодового тела и глубинного мицелия Pleurotus pulmonarius.
Ключевые слова: мицелий, базидиомицеты, глубинное культивирование, белково-витаминная добавка, плодовое тело.
The article describes the preparation of mycelial Pleurotus pulmonarius biomass by submerged cultivation in a medium consisting of inorganic salts and starch. Shows the use of biomass as an inoculum material for fungi on plant substrates by solid cultivation. Made a comparative analysis of the quantitative and qualitative composition of proteins and protein deep fungus mycelium Pleurotus pulmonarius.
Keywords: mycelium, basidiomycetes, subsurface cultivation, protein vitamin supplement, fruiting body.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время антропогенное влияние на природу сокращает и загрязняет естественные места обитания грибов. В результате этого снижается урожайность дикорастущих грибов, их пищевая безопасность. Получение экологически безопасной грибной биомассы возможно при искусственном культивировании грибов. Наиболее перспективными в этом отношении считаются дереворазрушающие базидиомицеты, обладающие не только ценными пищевыми качествами, но и лечебными свойствами. Они характеризуются быстрым накоплением биомассы и не требуют сложных питательных сред. Представителем этой группы грибов является лигнотрофный сапрофит Pleurotuspulmonarius (вешенка легочная). По своим питательным свойствам, содержанию витаминов и микроэлементов он не уступает белому грибу. В плодовом теле Pleurotus pulmonarius содержится до 35 % белка и богатый набор витаминов, микроэлементов и ферментов, полезных для организма человек (Бисько и др., 1983, Заикина и др., 2007), а также протеолитические ферменты, противоопухолевые вещества, антибиотики и вещества, обладающие антивирусными свойствами (Булах, 2001).
Сегодня искусственное выращивание грибов проводят по интенсивной стерильной технологии твердофазного культивирования, которое, в сравнении с экстенсивным методом, позволяет получать готовую продукцию на протяжении всего года при стабильной урожайности, а условия стерильных сред обеспечивают наиболее благоприятные условия роста грибного мицелия (Заикина и др. 2007). Одним из важнейших
этапов культивирования грибов является стадия инокуляции субстрата посевным мицелием. Использование на данном этапе глубинной культуры в качестве посевного материала обеспечивает наиболее эффективное перемешивание компонентов субстрата и посевного материала. Это сокращает время и трудоемкость данной операции, создает наиболее благоприятные условия для соблюдения стерильности, в сравнении с традиционным использованием зернового мицелия. В связи с этим, целью данной работы являлось получение мицелия Pleurotus pulmonarius (вещенки легочной) методом глубинного культивирования и изучение возможности его дальнейшего использования в качестве посевного материала для получения плодовых тел на растительном субстрате методом твердофазного культивирования.
объекты и методы исследований
Объектом настоящего исследования являлся штамм PP-3.2 базидиального гриба Pleurotus pulmo-narius, чистая культура которого была получена из плодовых тел. Систематическое положение изучаемого базидиомицета: класс - Базидиомицеты (Basid-iomycetes); подкласс - Холобазидиомицеты (Holoba-sidiomycetidae); порядок - Агариковые (Agaricales); семейство - Трихоломовые (Tricholomataceae); род - Вешенка вид - Вешенка легочная
га^ pulmonarius).
Выделение чистой культуры проводили с использованием общепринятых микологических методов (Нетрусов и др.,2005, Билай и др. 1973). Поверхностное культивирование Pleurotus pulmonarius и подбор
углеродсодержащего компонента питательной среды проводили на сусловом агаре в чашках Петри при температуре 26+1 оС. Полученный воздушный мицелий использовали в качестве посевного материала при получении инокулята глубинной культуры Pleurotus pulmonarius. Инокулят выращивали в колбах вместимостью 250 мл с объемом питательной среды 150 мл на лабораторном шейкере. Выращенную биомассу в дальнейшем использовали как посевной материал в процессе глубинного культивирования.
Глубинное культивирование проводили в стационарном лабораторном биореакторе CeCa (Gallenkamp controlled environment culture apparatus, made in England BY) при непрерывном перемешивании за счет барботирования стерильного воздуха. Расход воздуха составлял 100 л/ч на л среды. Культивирование продолжалось в течение 72 ч, при температуре среды 26+1 оС и рН 5,0. Питательную среду предварительно стерилизовали в автоклаве в течение 30 минут при 0,5 кгс/см2. Используемая для культивирования среда содержала в своем составе источники азота (NH4+), источник углерода (крахмал) и комплекс минеральных солей (KCl, NaCl, CaCl2, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4). Выход полученной биомассы определяли гравиметрическим методом. Полученный мицелий использовали для определения химического состава, в том числе биологически активных веществ.
Глубинную мицеальную биомассу применяли в качестве посевного материала для твердофазного культивирования с целью получения плодовых тел Pleurotus pulmonarius. В качестве растительного субстрата использовали измельченную солому, предварительно простерилизованную в автоклаве в течение 1 часа при 0,5 кгс/см2. Засев проводили в стерильных условиях методом впрыска полученной мицелиальной биомассы в подготовленный субстратный блок на глубину до 100 мм шприцом Жане с внутренним диаметром носика шприца 5 мм и объемом впрыска 150 мл. Расход посевного материала для засева 1 дм3 субстратного блока составлял 100+10 мл. Инкубирование засеянных блоков проводили при температуре 26+1 оС и влажности воздуха 60-65 % до полного прорастания субстрата мицелием. После полной колонизации субстрата «белые блоки» устанавливали в помещение с температурой 18 - 20 оС для получения плодовых тел. Выращенные плодовые тела в дальнейшем использовали для определения химического состава и содержания в них биологически активных веществ.
Результаты, полученные в процессе исследования, фиксировали с помощью цифровой камеры Canon Power Shot A650IS. Микроморфологические особенности изучали с помощью электронного растрового микроскопа ТМ-1000 (Япония).
Содержание белка в мицелии определяли с помощью красителя амидо-черного 10В (Бузун и др., 1982). Аминокислотный состав белков определяли по методике (Плешков, 1976) на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339М (MIKROTECHNA, Чехия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе на сусловом агаре в чашке Петри был получен воздушный мицелий исследуемого бази-диомицета. В ходе радиального роста штамм сформировал колонию (рисунок 1а), характеризующуюся наличием микро- и макроморфологических признаков, соответствующих изучаемому штамму Pleurotus pulmonarius (Мельникова, Литовка, Миронов, 2013).
Ш
пряжка
I ТМ-1000 4938
2011.06.09
L D3.0 х5.0к 20 um
Рисунок 1 - Морфология штамма Pleurotus pulmonarius при культивировании на сусловом агаре (а - колония воздушного мицелия; б - микроморфологические особенности воздушного мицелия)
Полученные результаты культивирования на агари-зованных средах с различными углеродсодержащими компонентами (глюкоза, крахмал и пивное сусло) показали, что зарастание чашек воздушным мицелием во всех трех случаях протекало практически с одинаковой линейной скоростью. С целью уменьшения вероятности инфицирования, а также с экономической точки зрения, наиболее целесообразно использовать крах-малсодержащее сырье, поэтому источником углеродсодержащего компонента для глубинного культивирования был выбран крахмал.
В процессе приготовления питательной среды для глубинного культивирования крахмал подвергали
а
Хвойные бореальной зоны, XXXI, № 3 - 4, 2013
клеистеризации, и для снижения его вязкости - частичному ферментативному гидролизу а-амилазой. Такая предварительная обработка позволяла использовать питательные среды с исходной концентрацией крахмала 2-3 % при относительно низкой вязкости получаемой питательной среды. Это способствовало более полному усвоению углеводов грибным мицелием и давало возможность применения в проводимых исследованиях оптических методов определения концентрации выращенной биомассы.
В результате глубинного культивирования Pleurotus pulmonarius была получена культуральная жидкость с содержанием биомассы около 10 г а.с.м./л, се-диментирующаяся с течением времени (рисунок 2а). При фильтровании культуральной жидкости получали молочно-белую биомассу Pleurotus pulmonarius. Она в основном представляла собой скопление гранул неправильной звездообразной формы диаметром 2-3 мм (рисунок 2б). Содержание белка в полученной биомассе составляло до 30 % а.с.м.
В дальнейшем культуральную жидкость, содержащую биомассу Pleurotus pulmonarius, диспергирова-
ли при помощи магнитной мешалки до равномерного распределения биомассы по объему и использовали как посевной материал для выращивания плодовых тел. На всех стадиях твердофазного культивирования, от засева до получения плодовых тел Pleurotus pulmo-narius, соблюдались стерильные условия. В процессе прорастания мицелием субстратный блок становился белым и на его поверхности появлялись зачатки плодовых тел в виде белых мицелиальных вздутий различной формы (рисунок 1, приложение 1). В течение последующих 3-7 суток происходило формирование плодовых тел. На рисунке 2 приложения 1 приведены фотографии с изображением плодовых тел Pleurotus pulmonarius на различных стадиях их развития. Полученное плодовое тело на «белом блоке» (рисунок 3) по внешним морфологическим признакам полностью соответствовало изучаемому штамму Pleurotus pulmonarius (Мельникова, Литовка, Миронов, 2013), что подтверждает его систематическую принадлежность. Содержание белка в выращенном плодовом теле составляло около 35 % а.с.м.
Рисунок 2 - Глубинная биомасса Pleurotus pulmonarius (а - культуральная жидкость с биомассой; б - морфологические особенности глубинной культуры)
Рисунок 3 -Сформировавшиеся плодовые тела
Pleurotus pulmonarius на «белом блоке»
б
Для оценки биологической ценности белков, выделенных из плодового тела и глубинного мицелия, был изучен их аминокислотный состав. Результаты сравнения аминокислотного состава глубинного мицелия и плодового тела с аминокислотным составом эталонного белка (по ФАО), приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Содержание аминокислот в глубинном мицелии и плодовом теле Pleurotus pulmonarius
Содержание аминокислот, % № Наименование в глу- в плодо- б п/п аминокислоты бинном вом офАО мицелии теле Незаменимые аминокислоты
1 Лизин 3,5 4,3 3,0
2 Треонин 6,7 6,6 2,0
3 Фенилаланин 3,3 2,9 2,0
4 Лейцин 9,1 7,9 6,4
5 Изолейцин 3,2 2,9
6 Метионин 0,5 1,2 3,0
7 Валин 4,1 4,9 3,0
Заменимые аминокислоты
8 Глицин 9,7 8,7
9 Аспарагиновая кислота 9,5 8,8
10 Цистеин 0,1 0,3
11 Пролин 0,8 0,9
12 Тирозин 14,2 7,4
13 Глютаминовая кислота 9,5 15,5
14 Серин 5,8 6,5
15 Аланин 12,9 12,7
16 Гистидин 4,1 4,2
17 Аргинин 3,0 4,3
Итого: 100 100
В белке глубинного мицелия, как и в белке плодового тела Pleurotus pulmonarius, было определено 17 аминокислот, в том числе 7 незаменимых. В белках, выделенных из глубинной культуры, наблюдалось несколько более высокое содержание лейцина, глицина, аспарагиновой кислоты и тирозина. Содержание всех незаменимых аминокислот, кроме метионина, как в глубинной биомассе Pleurotus pulmonarius, так и в плодовом теле оказалось несколько выше, чем в эталонном белке ФАО (яичный альбумин) (Цапалова и др., 2002).
После сбора плодовых тел Pleurotus pulmonarius было определено содержание белка в «белом блоке». Оно составляло до 8 %, что в несколько раз превышало содержание белка в соломе, используемой в качестве субстрата (2 %). Установлено, что в белке, содержащемся в «белом блоке», присутствуют все аминокислоты, выявленные в плодовом теле Pleurotus pulmonarius. Следует отметить более высокое содержание в белках «белого блока» таких аминокислот как: тирозин - 11,0 %, лизин - 8,5 %, гистидин - 5,6 %, лейцин - 9,0 % от общего содержания белков.
Таким образом, можно предположить возможность использования «белых блоков» после сбора урожая грибов в качестве белково-витаминной кормовой добавки для животных. Помимо этого, полученные «белые блоки» могут подвергаться длительному хранению при температуре +5 0С и использоваться как посевной материал для выращивания плодовых тел по традиционной экстенсивной технологии в весенний период.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показали возможность получения биомассы мицелия Pleurotus pulmonarius с высоким содержанием белка методом глубинного культивирования в стационарных биореакторах на синтетической среде контролируемого состава. Основываясь на полученных данных, можно говорить о перспективности использования глубинного мицелия Pleurotus pulmonarius как самостоятельного продукта крупнотоннажного производства с целью получения пищевых белковых добавок. Культуральная жидкость, содержащая глубинный мицелий, может быть использована в качестве посевного материала для получения плодовых тел Pleurotus pulmonarius путем твердофазной ферментации растительных субстратов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Экспертиза грибов: учеб.-справ. пособие / И.Э. Цапалова [и др.).- Новосибирск: Изд-во Новосиб. унта: Изд-во Сиб. Унив., 2002. - 256 с. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов [и др.) / Под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре / Н.А. Бисько [и др.) / Под общ. ред. Дудки И.А. - Киев : Наукова думка, 1983. - 312 с.
Методы экспериментальной микологии: справочник Отв. ред В.И. Билай. - Киев. Наукова Думка, 1973.
- 545 с.
Бузун, Г.Н. Определение белков в растениях с помощью амидо-черного /Г.Н. Бузун, К.М. Джемухад-зе, Ф.Л. Милешко. - Физиология растений. - 1982.
- Т. 29. - Вып. 1. - С.198 -204.
Основы биотехнологии высших грибов: учебное пособие./ Н.А. Заикина, А.Е. Коваленко, В.А. Галын-кин, Ю.Т. Дьяков, А.Д. Тишенков. - СПб.: «Проспект Науки», 2007. - 336 с. Плешков, Б.П. Практикум по биохимии растений /
Б.П. Плешков. - М.: Колос, 1976. - 256 с. Е.А. Мельникова, Ю.А. Литовка, П.В. Миронов Морфологические особенности базидиального гриба Pleurotus pulmonarius в поверхностной и глубинной культуре // Вестник Крас ГАУ - № 7. - 2013 Булах, Е.М. Грибы - источник жизненной силы. -Владивосток: «Русский Остров», 2001. - 64 с.
