CC BY
123
УДК: 616.155.16-07:543.545
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА АГАРОЗЕ В ДИАГНОСТИКЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ГЕМОГЛОБИНОПАТИЙ
О.Ю. Верлинский1, Ю.И. Жиленкова2, С.С. Бессмельцев3, А.В. Козлов2 1 Институт репродуктивной генетики, Чикаго, США 2 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова 3 Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России
Изучены возможности электрофореза на агарозе в разных условиях («щелочной», «кислый», изоэлектрофокусирование) в первичной диагностике различных типов гемоглобинопатий у 62 пациентов (2-58 лет). С помощью электрофореза тип гемоглобинопатии был установлен у 58 (93,5%) пациентов из 62 обследованных, у кого на этапе скрининга было выявлено снижение MCV (<80 фл), MCH (<27 пг), индекс Менцера (<11,4) при концентрации железа и ферритина в сыворотке крови в пределах возрастных норм. Малая форма бета-талассемии была обнаружена у 54 пациентов, сочетание бета-талассемии и гемоглобинопатии D - у 1, Н-гемоглобинопатия - у 1 и гемоглобинопатия С - у 1. У 4 пациентов из 62 изменений соотношений между фракциями гемоглобина по данным электрофореза выявлено не было, тогда как молекулярно-генетический анализ установил у них наличие мутаций бета-глобинового гена. Анализ электрофореграмм у 5 пациентов с установленной ранее большой формой бета-талассемии и у 1 пациента с серповидно-клеточной анемией подтвердил сложности выявления HbF c помощью электрофореза на агарозе.
Ключевые слова. Электрофорез, щелочной, кислый, изоэлектрофокусирование, агароза, гемоглобинопатии, талассемия, гемоглобин.
В результате глобальных миграционных процессов в мире, в том числе и в РФ, происходит распространение талассемий и других вариантов гемоглобинопатий в те регионы, для которых они ранее не были характерны [1, 2]. К настоящему времени во многих странах предложены различные алгоритмы лабораторного обследования больных на гемоглобинопатии [3,4,5]. В их основе многоступенчатый подход с использованием различных лабораторных технологий на каждом этапе. Как правило, на первом этапе используются отдельные эри-троцитарные параметры и расчетные индексы [6,7,8]. На последующих - методы, обеспечивающие разделение фракций гемоглобина и их идентификацию. К ним относится электрофорез на различных носителях, в том числе на агарозе [9,10].
Цель работы
Оценить возможности электрофореза на ага-розе в первичной диагностике гемоглобинопа-тий в Санкт-Петербурге.
Материал и методы
В исследование были включены 98 пациентов различных возрастных групп, находившихся на обследовании и лечении в СПб ГУЗ «Консультативно-диагностический центр для детей» и ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии ФМБА России». Пациенты
были распределены на две группы. Основную группу составили 62 человека: мужчины - 31, женщины - 31, возраст от 2 до 58 лет. Критериями включения служили:
1. Эритроцитарные параметры: MCV<80 фл, МСН<27 пг, индекс Менцера<11,4.
2.Биохимические показатели: концентрация железа и ферритина в сыворотке крови не ниже возрастных норм.
В группу сравнения были включены 30 пациентов с подтвержденной железодефицитной анемией: мужчины - 13, женщины - 17, возраст от 2 до 54 лет. Критерии включения в данную группу:
1. Эритроцитарные параметры: MCV<80 фл, МСН<27 пг, индекс Менцера>11,4.
2. Биохимические показатели: концентрация железа и ферритина в сыворотке крови ниже возрастных норм.
Отдельную подгруппу (для уточнения точности измерения НЬ F) составили 5 человек с установленным диагнозом «большая форма бе-та-талассемии» и 1 пациент с серповидно-клеточной анемией (СКА).
Материалом для исследований служила венозная кровь, собранная в пробирки с К3ЭДТА в качестве антикоагулянта ^асиеие, GremerBю-Опе, Австрия). Для приготовления гемолизата эритроциты дважды отмывали раствором хлорида натрия 9,0 г/л и добавляли лизирующий реактив производителя тест-систем, содержа-
щий Тритон X-100 (Helena BIOSCIENCES, Великобритания).
Фракции гемоглобина разделяли методом электрофореза на агарозе в «щелочных» (AlkalineHb), «кислых» (AcidHb) условиях и изоэлектрофокусирования (IEF) (система для электрофореза SAS1 и SAS2 Helena BIOSCIENCES, Великобритания). Электрофорез проводили на автоматизированной системе электрофореза SAS-1 Plus при соблюдении рекомендованных параметров:
1. AlkalineHb: 200 В, 30 мин., 25°С.
2. AcidHb: 60 В, 22 мин., 18°С.
3. IEF: 600 В, 30 мин., 15°С [10].
Гели окрашивали с помощью автоматизированной системы обработки гелей SAS-2. Идентификацию фракций проводили с использованием программного обеспечения "Platinum-3".
Использовали «отрезные» значения по данным производителя: Hb А2>3,7, Hb F>2%.
Мутации бета-глобинового гена определяли методом обратной гибридизации (коммерческий набор ViennaLabDiagnostics, Австрия).
Результаты и их обсуждение
Как следует из представленных в таблице 1 данных, при проведении электрофореза в щелочных условиях из 62 пациентов у 54 (87%) выявлено увеличение НЬ А2>3,7 % [от 4,2% до 7,7%, медиана - 5,1%]. У 1 пациента был обнаружен НЬ Н (5,6%). У 2 пациентов были обнаружены фракции: D,S (10,7%), С,А2 (10,3%). Для их идентификации был проведен электрофорез в кислых условиях, по результатам которого у 1 пациента был выявлен НЬ D (10,3%) и у 1 - НЬ С (11,3%).
При изоэлектрофокусировании (ИЭФ) из 62 пациентов у 50 (81%) выявлено увеличение НЬ А2>3,7% [от 4,0% до 7,9%, медиана - 5,1%]. У 4 пациентов увеличение НЬ А2>3,7% вместе
Таблица 1
Распределение пациентов по группам по данным «щелочного», «кислого» электрофореза и изоэлектрофокусирования (п=62)
Форма гемоглобинопатии AlkalineHb AcidHb IEF
Малая форма бета-талассемии (п=54) НЬ А2 Т + n=54 - + n=50
Малая форма бета-талассемии (п=4) НЬ А2Ти НЬ Ft - - + n=4
Малая форма бета-талассемии с НЬ F (п=1) НЬ А2 N НЬ Ft - - +
Гемоглобинопатия D ( п=1) HbD + 1) + +
Гемоглобинопатия С (п=1) НЬ С +2) + +
Гемоглобинопатия Н (п=1) НЬ Н + - +
Мутация бета-глобинового гена, не подтвержденные электрофорезом на агарозе п=4 - - -
Всего 62 57 58
+ фракции обнаружены при данном виде электрофореза - фракции не обнаружены при данном виде электрофореза
1) - обнаружены фракции со сходной подвижностью в геле в щелочных условиях:
2) - обнаружены фракции со сходной подвижностью в геле в щелочных условиях: С,А2
с увеличением НЬ F [от 9,0 до 12%, медиана - 10,9%] и у 1 пациента НЬ F (7%) при НЬ А2 (1,2%). Также у 1 пациента выявлен НЬ Н (7%), у 1 - НЬ D (12%) и у 1 - НЬ С (8,5%).
Таким образом, электрофорез на агарозе в разных условиях позволил установить тип гемоглобинопатии у 58 (93,5%) пациентов из 62 выявленных на этапе скрининга на основании критериев включения. Малая форма бета-талассемии (увеличение НЬ А2>3,7%) была обнаружена у 54 пациентов, сочетание бета-талассемии и гемоглобинопатии D - у 1, Н-гемоглобинопатия - у 1 и гемоглобинопатия С - у 1. Причем метод ИЭФ оказался чувствительнее к выявлению НЬ ^ чем «щелочной» электрофорез.
По данным молекулярно-генетического анализа мутации бета-глобинового гена были обнаружены у всех 62 пациентов, отобранных по критериям включения в основную группу, что подтвердило у них наличие гемоглобинопатии. Из них:
- у 58 пациентов по данным электрофореза на агарозе было зафиксировано изменение фракций;
- у 4 пациентов изменений по данным всех 3-х вариантов электрофореза выявлено не было.
В группе сравнения при разделении фракций гемоглобина были получены следующие данные: содержание НЬ А колебалось в пределах от 97% до 98%, НЬ А2 - от 1,7% до 3,5% (медиана 2,4%).
Поскольку чувствительность тест-систем не гарантирует точность измерения НbF при его концентрации менее 10% (НЬ F при всех 3-х видах электрофореза на агарозе имеет сходную подвижность с НЬ А и при низком содержании не отличим), мы оценили возможность его определения у 5 пациентов с установленной большой формой бета-талассемии и у 1 пациен-
та с СКА (табл. 2).
Как следует из представленных в таблице 2 данных, при высокой концентрации Hb F результаты всех типов разделения практических не отличаются.
Электрофорез гемоглобина в щелочных условиях обеспечивает выявление Hb A2 и основных аномальных форм гемоглобина (S, D, C, E), однако не позволяет их дифференцировать (подвижность Hb S не отличается от подвижности Hb D, подвижность Hb C - от подвижности Hb A2) (рис. 1).
Для их разделения (D/S, С/А2), используют гели, в которых разделение проводят в кислых условиях (рис. 2). В этом случае Hb S становится отличим от Hb D, а Hb C от Hb A2. Таким образом, путем сравнения профилей, полученных на щелочном и кислом гелях, нам удалось верифицировать фракции С, D и S.
SAS - Alkaline НЬ Ц • Ц, /
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I I 12
C/A2
'»iiflill
Рис. 1. Электрофорез гемоглобина при рН 8,6 («щелочной»): 1,5 - НЬ А+А2 (норма) 2 - НЬ S 3, 6, 7 - НЬ А+А2 ( НЬА2) 4, 10 - НЬ А+Р+А2 8 - НЬ Н
11 - смесь гемоглобинов (контрольная проба AFSA2)
12 - смесь гемоглобинов (контрольная проба AFSC)
Таблица 2
Данные электрофореза гемоглобина на агарозе у пациентов с большой формой бета-талассемии и СКА
Форма гемоглобинопатии Типы Hb AlkHb Acid Hb IEF
Большая форма бета-талассемии ttHbF F (34,0-75,5%) F (28,7-65,5%) F (27,3-61,0%)
n=5
СКА n=1 Hb S D/S=78% F=19,4% S=79,7% S=81,4% F=18,6%
Рис. 2. Электрофорез гемоглобина при рН 6,0-6,2 («кислый»): 1, 2, 4 - НЬ F+A 3 - НЬ 8 5 - НЬ С
9 - смесь гемоглобинов (контрольная проба SAF) 10 - смесь гемоглобинов (контрольная проба CSAF)
При ИЭФ формы гемоглобина 8, D, С, А и А2 имеют различную подвижность и отличимы друг от друга (рис.3). Чувствительность ИЭФ в отношении выявления НЬ А2 сравнима с электрофорезом в щелочных условиях, однако в отношении НЬ Р несколько выше (за счет более четких полос на геле).
Рис. 3. Изоэлектрофокусирование 1,3 -НЬ А+Р+А2 2 - НЬ Э 4 - НЬ 8 5 - НЬ А+А2 (ТНЬ А2) 6 - НЬ С
7 - смесь гемоглобинов (контрольная проба АР8А2) 9 - смесь гемоглобинов (контрольная проба АР8С)
Полученные нами результаты указывают на то, что для выявления и установления типа гемоглобинопатии может использоваться, либо сочетание методов разделения гемоглобина в щелочных и кислых условиях, либо только ИЭФ. На наш взгляд, ИЭФ более удобен в использовании, поскольку позволяет сразу отличить основные формы гемоглобина (S, D, C, А2) без использования электрофореза в другой системе.
Заключение
Таким образом, электрофорез в агарозном геле позволил нам подтвердить диагноз гемоглобинопатии у 93% пациентов, включенных в основную группу на основании результатов скринирующих параметров (эритроцитарные, биохимические показатели обмена железа, индекс Менцера), и его можно использовать для первичной диагностики гемоглобинопатий.
Литература
1. Лохматова М.Е., Сметанина Н.С., Финоге-нова Н.А. Эпидемиология гемоглобинопатий в Москве. // Педиатрия. - 2009. - Том 87. - № 4.
- С. 46-50.
2. Ryan К., Bain B.J., Worthington D., James J. Significant haemoglobinopathies: guidelines for screening and diagnosis. // Br. J. of Haematology.
- 2010. - V. 149. - Р. 35-49.
3. Токарев Ю.Н. Гемоглобинопатии: географическое распространение, этиопатогенез, диагностика, принципы лечения и профилактика. // Тер. Архив. - 1998. - 60. - С. 62-66.
4. Abdullah Kutlar. Laboratory diagnosis of hemoglobinopathies. // XXXVIII. UlusalHematolo-jiKongresi. Sickle Cell Center, Georgia Health Sciences University, USA. - 2012. - Р. 107-111.
5. Guidelines for the Clinical Management of Thalassemia. Thalassemia international federation.
- 2008. - P. 114.
6. Urrechaga E., Borque L., Escanero J.F. The role of automated measurement of RBC subpopulations in differential diagnosis of microcytic anemia and p-thalassemia screening // Hematopathol-ogy. - 2011. - V. 135. - P. 374-379.
7. Schoorl M., Schoorl M. Application of innovative hemocytometric parameters and algorithms for improvement of microcytic anemia discrimination. // Hematology Reports. - 2015. - V. 7. - P. 52-55.
8. Жиленкова Ю.И., Зенина М.Н., Козлов А.В., Бессмельцев С.С. Использование эритро-цитарных индексов для скрининга бета-талас-семии. // Медицинский алфавит. - 2015. - Том 3 (Современная лаборатория), № 11. - С. 60-63.
9. Комарова И.Н. Современные подходы к лабораторной диагностике гемоглобинопатий.
// Детская больница. - 2009. - № 3. - С. 38-41.
10. Old J., Galanello R., Eleftheriou A. Prevention of Thalassaemiasand other Haemoglobin Disorders. 2nd Edition. - 2013. - Vol 1. - Р. 212.
11. Bain B.J. Haemoglobinopathy diagnosis. -Blackwell Publishing, 2012. - P. 314.
Ю.И. Жиленкова Тел.:+7 (904) 646-06-74 E-mail: [email protected]
О.Ю. Верлинский, Ю.И. Жиленкова, С.С. Бессмельцев, А.В. Козлов Использование электрофореза на агарозе в диагностике различных типов гемоглобинопатий // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. — 2016. — Том 8, № 1. — С. 22—26.
USE OF THE AGAROSE ELECTROPHORESIS IN THE DIAGNOSIS OF DIFFERENT TYPES OF HAEMOGLOBINOPATHIES
O.J. Verlinsky 1, Y.I. Zhilenkova2, S.S. Bessmeltsev3, A.V. Kozlov2 1 Reproductive Genetics Institute, Chicago , USA 2 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia 3 Russian Research Institute of Hematology and Blood Transfusion
The possibilities of electrophoresis in agarose in different conditions (alkaline, acid, isoelectric focusing) for a primary diagnostics of different types of haemoglobinopathies in 62 patients (2-58 years old) were studied. Agarose electrophoresis has allowed to establish the type of haemoglobinopathies in 58 (93,5%) patients of the 62 identified in the screening stage on the basis of the following parameters: MCV (<80 fl), MCH (<27 pg), Mentzer index (<11,4), and normal age limits of iron and ferritin in serum. Beta-thalassemia minor was detected in 54 patients, the combination of beta-thalassemia and haemoglobinopathy D - 1, H-haemoglobinopathy - 1 and haemoglobinopathy C - 1. 4 patients didn't have changes on electrophoresis, but the molecular genetic analysis have confirmed the presence of mutations of beta-globin gene. Analysis electrophoregrams of 5 patients with a previous beta-thalassemia major and 1 patient with sickle cell disease has confirmed difficulty of identification HbF by electro-phoresis on agarose.
Key words. Electrophoresis, alkaline, acid, isoelectric focusing, agarose, hemoglobinopathies, thal-assemia, haemoglobin.
Authors Y.I. Zhilenkova Tel.:+7 (904) 646-06-74 E-mail: [email protected]
O.J. Verlinsky, Y.I. Zhilenkova, S.S. Bessmeltsev, A.V. Kozlov Use of the agarose electrophoresis in the diagnosis of different types of haemoglobinopathies // Herald of the Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov. — 2016. - Vol. 8, № 1 - IP 22-26.
