CC BY
49
Оригинальная статья / Original article
УДК 597.2.5; 664.2.03; 663.1
DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-61-78
Использование экологически безопасного микромицета рода Rhodotorula для получения кормового каротинсодержащего концентрата
Валентина В. Колпакова1, Рузалия В. Уланова1,2, Денис С. Куликов1, Валентина А. Гулакова1, Лина В. Васильева2, Юлия Ю. Берестовская2, Елена Г. Черемных3, Александр А. Ашихмин4
'Всероссийский научно-исследовательский институт крахмала и переработки крахмалсодержащего сырья - филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр картофеля имени А.Г. Лорха», Красково, Россия 2Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия 3Научный центр психического здоровья, Москва, Россия
"Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Пущино, Россия
Контактное лицо
Валентина В. Колпакова, доктор технических наук, профессор, главный научный сотрудник, Всероссийский научно-исследовательский институт крахмала и переработки крахмалсодержащего сырья - филиал ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр картофеля имени А.Г. Лорха»; 140051 Россия, Московская область, г. Красково, ул. Некрасова 11.
Тел. +79152858450
Email [email protected]
ORCID https://orcid.org/0000-0002-7288-8569
Формат цитирования
Колпакова В.В., Уланова Р.В., Куликов Д.С., Гулакова В.А., Васильева Л.В., Берестовская Ю.Ю., Черемных Е.Г., Ашихмин А.А. Использование экологически безопасного микромицета рода Rhodotorula для получения кормового каротинсодержащего концентрата // Юг России: экология, развитие. 2022. Т.17, N 4. C. 61-78. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-61-78
Получена 20 апреля 2022 г.
Прошла рецензирование 11 июля 2022 г.
Принята 20 сентября 2022 г.
Резюме
Цель работы. Изучение возможности использования экологически безопасного штамма дрожжей рода Rhodotorula для биоконверсии вторичного продукта переработки гороховой муки на белковый концентрат (сыворотки) в кормовую каротиноидсодержащую биомассу.
Материал и методы. Использовали новый штамм Rhodotorula mucilaginosa 111 и вторичные продукты переработки гороховой и нутовой муки на белковые концентраты и картофеля на крахмал (сыворотку). Применяли стандартные и специальные методы анализа сыворотки и микробно-растительного концентрата (КМРК): химические, биохимические, микробиологические, определение токсичности с инфузориями.
Результаты. Определены оптимальные режимы выращивания R. mucilaginosa 111 на гороховой сыворотке (температура 16,9оС; рН 7,8; количество посевного материала 1,85%). Биомассы на гороховой сыворотке синтезировалось больше, чем на нутовой и картофельной сыворотке - 81 г/дм3. Массовая доля белка в биомассе - 58,90±3,03% на сухое вещество, скор незаменимых аминокислот -119-243%. Липиды включали 20% насыщенных и 78% ненасыщенных жирных кислот, линолевой кислоты - 45,26±0,70%, олеиновой -24,04±0,76%, пальмитолеиновой - 6,46±0,31%, пальмитиновой -13,70±0,81%. Дрожжи продуцировали производные фитоина, торулен, в-каротин, торулародин, фитоин. КМРК из гороховой сыворотки стимулировал рост инфузории Tetrahymena pyriformis на 29,1%, из нутовой сыворотки - на 18,6% интенсивнее, чем дистиллированная вода, картофельная сыворотка понижала коэффициент ее роста. Заключение. Сухая биомасса экологически безопасного нового штамма дрожжей R. mucilaginosa 111 содержала необходимые для кормления животных полноценные белки, липиды, минералы, каротиноиды; жидкую гороховую сыворотку возможно использовать для ее биоконверсии и в целях исключения загрязнения окружающей среды.
Ключевые слова
Дрожжи Rhodotorula mudlaginosa, гороховая сыворотка, микробно-растительный концентрат, белки, жирные кислоты, каротиноиды, безопасность, инфузория.
© 2022 Авторы. Юг России: экология, развитие. Это статья открытого доступа в соответствии с условиями Creative Commons Attribution License, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.
Use of environmentally safe micromycetes of the genus Rhodotorula to obtain fodder carotene-containing concentrate
Valentina V. Kolpakova1, Ruzaliya V. Ulanova1,2, Denis S. Kulikov1, Valentina A. Gulakova1, Lina V. Vasilyeva2, Yulia Yu. Berestovskaya2, Elena G. Cheremnykh3 and Alexander A. Ashikhmin4
'All-Russian Research Institute of Starch and Processing of Starch-Containing Raw Materials - Branch of A.G. Lorkha Federal Potato Research Centre
2S.N. Vinogradsky Institute of Microbiology, Fundamental Foundations of Biotechnology Federal Research Centre, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia 3Mental Health Research Center, Moscow, Russia
"Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science, Pushchino Scientific Centre for Biological Research, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia
Principal contact
Valentina V. Kolpakova, Doctor of Technical Sciences, Professor, Chief Researcher, All-Russian Research Institute of Starch and Processing of Starch-Containing Raw Materials - Branch of A.G. Lorkha Federal Potato Research Centre, 11 Nekrasova, St, Kraskovo, Moscow Region, Russia 140051.
Tel. +79152858450
Email [email protected]
ORCID https://orcid.org/0000-0002-7288-8569
How to cite this article
Kolpakova V.V., Ulanova R.V., Kulikov D.S., Gulakova V.A., Vasilyeva L.V., Berestovskaya Yu.Yu., Cheremnykh E.G., Ashikhmin A.A. Use of environmentally safe micromycetes of the genus Rhodotorula to obtain fodder carotene-containing concentrate. South of Russia: ecology, development. 2022, vol. 17, no. 4, pp. 61-78. (In Russian) DOI: 10.18470/1992-1098-2022-4-61-78
Received 20 April 2022 Revised 11 July 2022 Accepted 20 September 2022
Abstract
Aim. The aim of the work was to study the possibility of using an environmentally friendly strain of yeast of the genus Rhodotorula for the bioconversion into fodder carotenoid-containing biomass of the secondary product of processing pea flour into a protein concentrate (whey). Material and Methods. We used a new strain of Rhodotorula mucilaginosa 111 and by-products of processing pea and chickpea flour into protein concentrates and potatoes into starch (whey). We used standard and special methods for the analysis of serum and microbial-vegetable concentrate (FMVC) namely: chemical; biochemical; microbiological; and the determination of toxicity with ciliates. Results. Optimal conditions for growing R. mucilaginosa 111 on pea whey were determined (temperature 16.9°C, pH 7.8, amount of inoculum 1.85%). More biomass was synthesized on pea whey than on chickpea and potato whey - 81 g/dm3. The mass fraction of protein in the biomass is 58.90±3.03% on dry matter and the rate of essential amino acids is 119243%. Lipids included 20% saturated and 78% unsaturated fatty acids, linoleic acid - 45.26±0.70%, oleic - 24.04±0.76%, palmitoleic -6.46±0.31%, palmitic - 13.70±0.81%. The yeast produced phytoin derivatives, torulene, P-carotene, torularodin and phytoin. FMVC from pea whey stimulated the growth of ciliates Tetrahymena pyriformis by 29.1%, from chickpea whey (by 18.6% more intensively than distilled water), while potato whey reduced its growth rate.
Conclusion. The dry biomass of the ecologically safe new yeast strain R. mucilaginosa 111 contained complete proteins, lipids, minerals, and carotenoids necessary for feeding animals. Thus liquid pea whey can be used for its biokonversions, while avoiding environmental pollution.
Key Words
Yeast Rhodotorula mucilaginosa, pea whey, microbial-vegetable concentrate, proteins, fatty acids, carotenoids, safety, ciliates.
© 2022 The authors. South of Russia: ecology, development. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
ВВЕДЕНИЕ
Обеспеченность кормами животноводческой и птицеводческой отраслей АПК является основой успешного их развития, однако изменяющиеся климатические и экономические условия ограничивают возможность производства продукции традиционными способами. К альтернативным технологиям, не зависящим от погодных условий и интенсификаций сельхозугодий, относится микробиологический синтез кормовой биомассы [1]. Биомасса одноклеточных организмов с питательными и биологически активными компонентами (белки, липиды, витамины, антиоксиданты, минеральные вещества) вводится в состав кормовых рационов в качестве полноценных и относительно дешевых ингредиентов. Ведущее положение в производстве микробного белка занимают дрожжи родов Candida, Saccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Saccharomycopsis, Kluyveromyces и др. [2-6]. Особый интерес представляют те микроорганизмы, которые обеспечивают получение, кроме основных компонентов, и биологически активных веществ, придающих кормам ростовые, профилактические, антиоксидантные и другие свойства. В организме каротиноиды играют не только энергетическую роль, но и обладают антиоксидантными, иммуномодулирующими и онкопротекторными свойствами для нормализации репродуктивной функции, роста и развития животных и птицы [7-9]. Они являются изопреноидными пигментами и провитаминами А, принимают участие в пигментации организма, защите от хронических, дегенеративных и других заболеваний (старение, рак, катаракта, сердечно-сосудистые и т.д.) [10-13]. В составе пищевых добавок каротиноиды обладают и антимикробной активностью [14].
Сегодня 80-90% каротиноидов производят химическим синтезом, но все больше спрос возрастает на каротиноиды из природного растительного сырья, так как синтетические аналоги могут быть опасными для здоровья [15]. Природный кормовой каротин получают из тыквы, моркови, люцерны, экстракта фруктовых отходов и т. д.) [16; 17]. Из-за высокой потребности в каротиноидах для пищевой, кормовой промышленности и здравоохранения в 2022 году суммарная рыночная цена их препаратов, по прогнозам экспертов, может превысить 2,0 миллиарда долларов [18]. С учетом преимуществ микроорганизмов, по сравнению с растениями (темп роста, способность произрастать на отходах, часто загрязняющих окружающую среду, отсутствие сезонности роста и т.д.), исследования по получению кормовой биомассы, обогащенной каротиноидами, расширяются. Активными продуцентами каротиноидов выступают дрожжи родов Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Sporidiobolus, Yarrowia, Phaffia и др. [19-22], они привлекают внимание и как продуценты липидов и эссенциальных жирных кислот [23-25]. Так, каротинсодержащая кормовая биомасса получена для теплокровных животных, птиц и аквакультуры c дрожжами Rhodotorula rubra, Rhodosporidium SC-111, Saccharomyces diastaticus Y-1218, Rhodotorula glutinis [7; 26; 27]. При этом использовались отходы и вторичные продукты переработки сельскохозяйственного и пищевого сырья [28-32]. Так, при культивировании каротиноидных дрожжей R. rubra на экстракте
фруктовых отходов при рН 7,0, температуре 28,2°С и перемешивании при 150 об/мин выход биомассы составлял 7,83 мг/дм3, каротиноидов - 2,98±0,28 мг/дм3 [17]. Урожайность биомассы на средах с картофельными сточными водами и глицериновыми фракциями с дрожжами R. glutinis, Rothia mucilaginosa и Rhodotorula gracilis также была высокой. Синтез в ней липидов, например, с культурой R. gracilis обеспечивал их количество 21,1 г/100 г, каротиноидов - 360,4 мкг/г биомассы, полиненасыщенных жирных кислот -30,4% от общего количества [33; 34]. При трансформации отходов корицы дрожжами Rhodosporidium toruloides, остающихся после удаления полифенолов, количество каротиноидов составляло 2,00±0,23 мг/дм3 [35]. Продуктивность ассоциации дрожжей R. rubra и Kluyveromyces lactis на ультрафильтрате молочной сыворотки составляла 24,3 г/дм3, каротиноидов - 10,2 мг/дм3 [36]. У дрожжей R. glutinis и R. mucilaginosa при ферментации на сывороточной и картофельной среде урожайность достигала 30-45 г/дм3, массовая доля каротиноидов -46-56 мг/дм3 [36]. Положительные результаты получены и при использовании чайных отходов для синтеза каротиноидов и липидов дрожжами R. toruloides. Содержание пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой кислот составляло более 90% от общего количества жирных кислот [37]. Доказана также возможность использования сточных вод пивоварни с R. glutinis для производства липидов и каротиноидов
[38]. Известно, что максимальная продуктивность дрожжей Rhodotorula и Cryptococcus с каротиноидов достигалась при росте на тростниковой патоке, кукурузном сиропе и солодовом экстракте (300 мкг/л)
[39]. Таким образом, сведения по получению кормовой микробной биомассы, обогащенной наряду с белком, липидами и каротиноидами, и подбору ее продуцентов для различных сырьевых источников растительного происхождения весьма важны и актуальны.
Целью данной работы явилось изучение возможности использования жидкого вторичного продукта переработки гороховой муки на белковый концентрат (сыворотки) для получения кормового каротинсодержащего концентрата биоконверсией с новым экологически безопасным штаммом дрожжей рода Rhodotorula.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили питательные среды, полученные на основе гороховой сыворотки - продукта, образующегося при получении белковых концентратов (БК) из гороховой муки. Химический состав гороховой муки, в % на сухое вещество (СВ): массовая доля белка (Nx6,25) - 24,30±1,40, золы - 2,87±0,20, жира - 1,58±0,12, углеводов - 73,02±3,66. Для сравнения роста штамма Rhodotorula на гороховой сыворотке использовали нутовую и картофельную сыворотку. Нутовую сыворотку получали из муки с массовой долей, в % на СВ: белка (Nx6,25) - 24,54±0,23; золы - 2,91±0,02; жира -4,89±0,31; углеводов - 67,66±0,56. Химический состав сока, из которого получена картофельная сыворотка: СВ - 5,55±0,95%; азотистые вещества - 1,94±0,08 г/100 см3; аминный азот 1,03±0,07 г/100 см3; восстанавливающие сахара - 1,07±0,65 г/100 см3; зола - 0,85±0,05 г/100 см3.
Гороховую и нутовую сыворотку получали после удаления белков из экстракта, полученного из муки с ферментными препаратами (ФП): Shearzym 500 L, Viscoferm L, Fungamyl 800 L, AMG 300 L 2500, Alcalase 2.4 L от компании "Novozymes", (Данния) по схеме, приведенной в работе [40]. Картофельный сок, остающийся после удаления крахмала из клубней картофеля [41], нагревали до температуры 95°С, после чего центрифугировали, получали супернатант обозначенный как сыворотка. Микробным объектом служил штамм дрожжей Rhodotorula mucilaginosa 111 из коллекции Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (Москва).
Выведение и идентификация штамма. Чистая культура штамма R. mucilaginosa 111 была выделена из водного образца озера Унтерcее Антарктида, отобранного с глубины 63 м при температуре 4,9°С, и идентифицирована после проведения генетического анализа 18SрРНК. Для обогащения образца клетками бактерий в олиготрофных условиях к образцу воды в соотношении 4:1 добавляли низко-минерализованную среду (НМС) с дрожжевым экстрактом, триптоном, казаминовыми кислотами и пептоном, каждый при концентрации 0,001%. Обогащенный клетками образец получали через 1 месяц при температуре 4°С. Культуру высевали на агаризованную НМС среду, в которой концентрация дрожжевого экстракта, триптона, казаминовых кислот и пептона была выше 0,005%, что позволило получить отдельные колонии, выросшие при 4°С. Чистую культуру штамма получали из одной колонии при многократном ее пересеве, поддерживали ее на НМС с 0,01% дрожжевого экстракта и 0,2% сахарозы при температуре 10°С. Микроскопические фазово-контрастные исследования проводили на микроскопе Olimpus CX41 (Япония) с фотографической приставкой. На агаризованных средах образовывались круглые выпуклые маслянистые колонии дрожжей с гладкой поверхностью ярко-розового цвета.
Идентификацию штамма проводили на основе анализа последовательности рибосомальных генов по стадиям: рассев культуры до отдельных колоний; получение биомассы для анализа 18SРНК; выделение ДНК (GenomicDNAPurificationKit) и идентификация штамма по последовательности 18SрДНК. Секвенирование генов 18S рРНК и 5,8S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе АЕ 3000 с компьютерной программой BLAST. Электрофорез ПЦР образцов проводили на 1,0%-ном агарозном геле при напряжении 5 Вт/см. Анализ сходства нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 18S рДНК штамма, проведен с помощью сервера BLAST.
Приготовление питательной среды. Для биоконверсии сыворотки штаммом R. mucilaginosa 111 корректировали ее рН и стерилизовали при 0,5 атм. в течение 15 мин. Музейные культуры с сусла-агара пересевали в пробирку с сывороткой, культивировали в течение 24 ч, после чего посевную культуру пересевали в колбы емкостью 300 см3 с 50 см3 питательной среды. Культуру выращивали на качалке в течение 48 ч при скорости вращения 150 мин-1 и температуре 17±1°С. Суспензию инактивировали при температуре 95±5°С в течение 10-15 мин и охлаждали до температуры 22±2°С. Биомассу отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 4 000 мин-1 в течение 10 мин, высушивали на лиофильной установке Hochvacuum HVDTG-50
(Германия) в вакууме при -80°С [42] и получали препарат кормового микробно-растительного концентрата (КМРК). Количество биомассы определяли гравиметрическим методом: 10 см3 биомассы центрифугировали в течение 10 мин при 5000 мин-1, осадок дважды промывали стерильной дистиллированной водой, после чего его взвешивали. Результаты рассчитывали в г/дм3 питательной среды.
Анализ продуктов. Количество белка в муке, сыворотке и концентратах определяли по методу Кьельдаля ГОСТ 10846-91 [43], массовую долю влаги -ГОСТ 13586.5-93 [44], золы - ГОСТ 10847-2019 [45], жира - ГОСТ 29033-91 [46], общих углеводов - по разнице между 100% и суммой остальных компонентов. Количество растворимых и нерастворимых волокон в КМРК определяли по методу, основанному на предварительном ферментативном гидролизе крахмала и белков [47]. Для гидролиза белков использовали протеолитический ФП Alcalase 2.4 L, для гидролиза углеводов - а-амилазу Фунгамил 800 L и амилоглюкозидазу AMG ("Novozymes", Дания). Растворимые волокна осаждали четырьмя объемами 95% (v/v) этанола в течение 2 часов при 4°С, после чего промывали 2 раза 95%-ным этанолом. Количество высушенной массы определяли гравиметрическим методом, массовую долю волокон выражали в процентах на СВ. При расчете аминокислотного скора концентратов использовали шкалу эталонного белка ФАО/ВОЗ (2011) [48].
Углеводный состав сыворотки и культуральной жидкости исследовали на газовом хроматографе модели GCMS-QP 2010 (Япония, Shimadzu Corporation) с колонкой ReproGel Na HPLC (9 цт, 8x300 mm).
Аминокислотный состав (АС) определяли на хроматографе модели L-8800 фирмы "Hitachi" (Япония) в стандартном режиме анализа белковых гидролизатов с сульфированным сополимером стирола с дивинилбензолом и ступенчатым градиентом натрий-цитратного буферного раствора с возрастающим значением рН и молярности [49].
Жирнокислотный состав. Липиды из КМРК выделяли по методу Фолча. После упаривания в ротационном испарителе, к ним добавляли хлороформ, солянокислый метанол (SupelcoMethanolic-HCl 0.5 N), смесь нагревали 1 ч при 90оС. Жирнокислотный состав липидов исследовали на хроматографе c масс-детектором Simadzu GCMS-QP2010 Ultra при температуре 120оС, инжектора - 200оС; интерфейса -205оС, детектора - 200оС на колонке SLB-IL82 (30 m, 0,20 mkm, d = 0,25 mm) с гелевым носителем при скорости потока 35,6 см/сек и его делении 1:10. Градиентный режим изменяли от 120оС до 260оС со скоростью 5оС/мин в течение 2 минут.
Состав каротиноидов. Для определения состава каротиноидов клетки биомассы разрушали, после чего из них экстрагировали пигменты, которые разделяли ВЭЖХ-анализом. Для этого 150 мкл биомассы и стеклянные бусы размером 425-650 мкм (Sigma-Aldrich, США) в соотношении 1:1 (V/V) помещали в пробирку Эппендорфа и интенсивно перемешивали в шейкере 5 раз по 15 сек. После каждого перемешивания клетки в течение 2 минут охлаждали во льду. К разрушенным клеткам добавляли 1 см3 ацетон-метанольной смеси (7:2, v/v), перемешивали в шейкере и помещали на 10 мин в термостат при 45°С для экстракции пигментов. Образец центрифугировали в
течение 1 мин на центрифуге Minispin (Eppendorf, США) при 2000 мин-1. Процедуру экстракции повторяли до появления серого цвета у продукта. Экстракты пигментов из нескольких порций объединяли, добавляли петролейный эфир и высушивали в стеклянном пузырьке под струей аргона. Анализ состава каротиноидов проводили с помощью ВЭЖХ на установке Shimadzu (Shimadzu, Япония) [50]. Установка состояла из насоса LC-10ADVP с модулем FCV-10ALVP, детектора с диодной матрицей SPD-M20A, термостата CT0-20AC и колонки с обращенной фазой Agilent Zorbax SB-C18 5 мкм 4,6 х 250 мм («Agilent», США). Концентрацию каротиноидов в моль% рассчитывали по коэффициентам экстинкции [51] и площадям полос поглощения в области 270-800 нм с помощью программы LC-solution (Shimadzu, Япония). Все реактивы были химически чистые.
Для определения коэффициента роста инфузорий и экологической безопасности концентратов использовали инфузорию Tetrahymena pyriformis WH14 из коллекции Всероссийского НИИ ветеринарной санитарии и экологии (Москва). К 10±0,001 мг образца добавляли 10 см3 дистиллированной воды и встряхивали на шейкере в течение 20 мин. Раствор разводили в 10 раз, отбирали 10 см3 и определяли коэффициент роста числа клеток инфузорий на образцах через 24 часа. Контролем служила дистиллированная вода, подсчет живых тест-организмов проводили на приборе БиоЛаТ (ООО «Европолитест», Россия) [52] по специальной программе с использованием изображения лунок планшета с инфузориями. Программная обработка изображения основана на вычитании двух последовательных кадров лунки с тест-организмами и сканировании результирующего изображения для выявления объектов, отличающихся по яркости от фона. Коэффициент роста Кр0Ста (%) вычисляли по формуле:
К -. ; ;т.: = — X . С С , где Ао,
прирост клеток
инфузории в опыте, Ак - прирост клеток в контроле. При уменьшении прироста клеток инфузории на 50% и более, по сравнению с контролем, проба считалась токсичной.
Обработка результатов. Экспериментальные данные обрабатывали в программах ТаЫеСигее 2D 5.1, ТаЫеСигее 3D 4.0, Ма^етайса 10.3 и Statistica 10. Доверительный интервал среднего арифметического рассчитан по уровню значимости р = 0,05.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В статье представлены результаты по разработке микробиологического процесса получения
каротиноидсодержащего КМРК с использованием вторичного продукта переработки зерна гороха на белковый концентрат - жидкой сыворотки. Сыворотка оставалась после осаждения белков из экстракта в изоэлектрической точке [40]. Для получения КМРК использовали новый штамм Rhodotorula mucilaginosa 111, активно усваивающий компоненты сред и синтезирующий белки, липиды, углеводы, каротиноды.
При анализе последовательности
рибосомальных генов по базе данных GenBank первичный скрининг показал, что штамм принадлежал к систематическому роду и видам: Rhodotorula mudlaginosa, Rhodotorula alborubescens, Rhodotorula evergladensis. Критерием отнесения микроорганизма к конкретному виду считали гомологию не менее 98%. Для установления филогенетического родства использовали метод сравнения нуклеотидных последовательностей, кодирующих домен D1/D2 гена 18S рРНК. Анализ филогенетического родства, построенный с использованием штаммов близкородственных микроорганизмов, энтеробласти-ческое почкование, слизистая консистенция культуры и наличие пигментов показали, что наиболее близким к образцу был род Rhodotorula, вид - mucilaginosa. Штамм образца депонировали под номером 111.
С целью предварительного определения значений температуры и рН для развития культуры использовали НМС Американской коллекции типовых культур - АТСС, в состав которой входила сахароза в концентрации 0,2%. В пробирки со стерильной средой засевали культуру в 3-х кратной повторности, колбы выдерживали в течение недели при температуре 4, 10, 15, 20, 25 и 30°С и рН от 6,5 до 8,5. Наибольший рост культуры наблюдался при рН 8,0 и температуре 25°С. Штамм R. mucilaginosa 111 образовывал пигмент, окрашивающий колонии в розовато-оранжевый цвет (рис. 1), что характерно для каротиноидных пигментов базидиомицетовых дрожжей данного рода. Размер клеток яйцевидной формы, расположенных одиночно и попарно, составлял 3,75±1,25 мкм х 5,5±2,5 мкм. Размножались клетки чаще полярным почкованием, реже - многосторонним почкованием (рис. 1).
В •
О G
ÖS 0
--- ^
Рисунок 1. Внешний вид клеток R. mucilaginosa 111 на твердой питательной среде Figure 1. Appearance of R. mucilaginosa 111 cells on a solid nutrient medium
Продуктивность (урожайность) культуры R. mucilaginosa 111 изучали на питательной среде из сыворотки, без внесения дополнительных ингредиентов, и сравнивали ее для сред из нутовой и картофельной сыворотки. Зерно нута по химическому составу и физико-химическим свойствам белков имеет сходство с зерном гороха, тогда, как картофель по данным показателям от зернобобовых отличается. Поэтому представлялось интересным исследовать продуктивность дрожжей на сыворотке различной природы, химический состав которой приведен в таблице 1. Параметры выращивания использовали те же, что и для гороховой сыворотки, но с консорциумом дрожжей Saccharomyces cerevisia и микромицета Geotrichum candidum (температура роста 27±1оС, рН 6,0-6,5) [40]. Показано, что продуктивность дрожжей R. mucilaginosa 111 на гороховой и нутовой сыворотке в 1,6 раза выше, чем на картофельной сыворотке (рис. 2). Возможно, что в состав сыворотки из зернобобовых культур в 1,5-1,8 раза больше входило легко усвояемых моно- и олигосахаридов. Для дальнейших исследований
использовали гороховую сыворотку, нутовую и картофельную - для сравнения процессов роста и продуктивности дрожжей.
Технологические режимы культивирования дрожжей R. mucilaginosa 111 на гороховой сыворотке оптимизировали с методами математической обработки данных. Составили матрицу планирования эксперимента выращивания дрожжей в течение 3-х суток для выявления зависимости выхода биомассы от кислотности среды, температуры и количества посевного материала. Поиск искомой зависимости осуществляли в следующем виде:
md = a0 ■ fpH ■ ft ■ fcm
где: fpH , ft и fcm - функции эффектов влияния pH, температуры t и количества посевного материала cm.
На рисунке 3 представлены частные эмпирические зависимости fpH, ft и fcm эффектов влияния pH, температуры, количества посевного материала на выход биомассы дрожжей.
Таблица 1. Химический состав сыворотки различной природы Table 1. Chemical composition of serum of various nature
_Показатели / Indicators_
Углеводы, % от общего количества
АВ, % СВ _Carbohydrates, % of the total
СВ, % (Nx6,25) Мальтоза,
DS, % NS, % Фруктоза Глюкоза сахароза Галактоза Раффиноза Стахиоза ВМС
(Nx6,25) Fructose Glucose Maltose, Galactose sucrose Raffinose Stachiose HMC
Гороховая сыворотка / Pea whey
3,00 13,94± 10,99± 41,45± 1,32± 2,91± 3,14± 35,12±
5,32 0,61 1,12 0,04 - 0,10 0,09 2,01
Нутовая сыворотка / Chickpea whey
3,80 14,95± 14,06± 4,28± 4,40± 4,35± 9,52± 3,68± 47,21±
7,53 0,84 0,45 0,36 0,55 1,42 0,47 1,93
Картофельная сыворотка / Potato whey
3,80 29,75± 12,11± 18,30± 3,74± 64,22±
2,25 0,56 0,93 0,41 1,02
Примечание: СВ — сухие вещества; ВМС — высокомолекулярные соединения; АВ — азотистые вещества Note: DS — dry substances; HMC — high molecular compounds; NS — nitrogenous substances
Рисунок 2. Продуктивность дрожжей R. mucilaginosa 111 на сыворотке: 1 -гороховой; 2 - нутовой; 3 - картофельной
Figure 2. Yeast productivity R. mucilaginosa 111 on serum: 1 - pea; 2 - chickpea; 3 - potato
lny=a+bx+c/xA(1.5) r*2=1 DF Adj rA2=1 a=1.377448 b=-0.16307885 c=-18.361843
0.5-
s=04' 0.3 0.2 0.1 0
lny=a+bx+c/x rA2=0.99997341 DF Adj 1*2=0.99992022 a=6.3129974 b=-0.20081811 c=-57.102084
246
pH
20
Температура t
y=a*x/(1+b*xA2)
|A2=0.95583945 DF Adj №0.91167891 FitStdErr=0.046792991 Fstat=64.933943 a=0.52657762 b=0.29188687
Рисунок 3. Частные эмпирические зависимости эффекта влияния: a c - fcm от количества посевного материала cm
Figure 3. Partial empirical dependences of the influence effect: a - fpH on pH; b c - fcm from seed quantity cm
fpH от pH; b - ft от температуры t; ft on temperature t;
С повышением рН от 5 до 7-8, температуры от 10 до 15-17°С и количества посевного материала от 1 до 2% выход биомассы повышался, после чего он плавно или резко понижался. Коэффициенты корреляции (Я) уравнений, описывающих данные зависимости, равнялись, соответственно, для рН (рис. 3А) - 1,0000;
md =
21698.726 • cm • e
температуры (рис. 3В) - 0,98600 и количества посевного материала ст (рис. 3С) - 0,99997, что указывало на адекватное описание уравнением полученных экспериментальных данных. Искомое уравнение зависимости выхода массовой доли биомассы (md) от влияющих факторов имело вид:
1 8 362 _0.1631 рн _Ш-0.2008/
pH 1
3.4341+ cm
2
где: рН - рН среды, t - температура, ст - количество посевного материала.
Коэффициент корреляции уравнения Я равнялся 0,8715, что также указывало на адекватное описание им экспериментальных данных (рис. 4). На рисунке 5 отображена зависимость выхода биомассы md (г/10 см3) от рН и температуры 0С при количестве посевного материала ст = 2%. Зависимость количества
биомассы от исследуемых факторов имела четко выраженные максимумы. Из листинга решения уравнений вытекали оптимальные значения факторов, обеспечивающие максимальный выход биомассы (md), (0,81 г/дм3). В процессе накопления биомассы усваивались глюкоза и фруктоза.
Для гороховой и картофельной сыворотки в культуральной жидкости количество глюкозы закономерно уменьшалось: у гороховой сыворотки - до
b
a
c
нуля, у картофельной - в 6 раз, по сравнению с началом процесса. У нутовой сыворотки количество глюкозы практически не изменялось (табл. 2). У всех видов сыворотки количество фруктозы в культуральной
жидкости к концу выращивания биомассы уменьшилось в 2,2-3,9 раза. Следовательно, дрожжи из гороховой и картофельной сыворотки усваивали глюкозу, фруктозу, из нутовой сыворотки - фруктозу.
Рисунок 4. Корреляционный график Figure 4. Correlation chart
Рисунок 5. Зависимость выхода биомассы (md) от pH и температуры (t)
Figure 5. Dependence of biomass yield on pH and temperature
Таблица 2. Углеводный состав сыворотки и культуральной жидкости в процессе роста дрожжей R. mucilaginosa 111 Table 2. Carbohydrate composition of serum and culture liquid during the growth of the yeast R. mucilaginosa 111_
Состав
Composition
Оыворотка / Whey
Гороховая
Pea
Нутовая
Chickpea
Картофельная
Potato
С
W
Сутки роста
Days of growth
2
С
W
Сутки роста
Days of growth
1
2
3
С
W
Сутки роста
Days of growth
1
2
3
СВ, % 3,00± 3,00± 2,80± 1,60± 3,80± 3,80± 3,00± 2,50± 3,80± 4,00± 2,20± 2,00±
DS, % 0,65 0,02 0,43 0,49 0,37 0,12 0,89 0,85 0,38 0,44 0,75 0,60
Глюкоза 41,45± 32,17± 11,93± 0 6,61± 4,28± 5,86± 7,73± 18,30± 10,56± 2,67± 3,10±
Glucose 2,54 1,96 0,66 0,73 0,28 1,61 0,15 1,85 2,01 0,88 0,81
Фруктоза 11,99± 13,85± 12,46± 5,29± 12,68± 14,06± 8,63± 3,34± 12,11± 9,40± 8,41± 4,03±
Fructose 1,95 1,38 1,72 2,97 0,95 1,99 1,75 1,39 1,25 2,40 2,34 1,22
Галактоза 1,32± 1,04± 0 0 4,35± 4,19± 4,40± 5,28± 2,80± 3,17± 3,45± 3,11±
Galactose 0,08 0,05 0,17 0,13 0,16 0,09 0,20 0,92 0,80 0,06
Мальтоза, - - - -
сахароза Maltose, sucrose 1,32± 1,75± 4,35± 12,85± 4,40± 3,88± 4,80± 7,40± 3,74± 3,04± 3,68± 3,42±
0,69 0,99 0,57 0,82 0,43 0,38 0,21 0,55 0,04 0.36 0,12 0,15
Раффиноза 2,91± 1,14± 1,93± 2,28± 9,52± 10,44± 15,82± 19,59± 1,15±
Raffinose 0,07 0,05 0,07 0,02 0,09 0,13 0,40 0,24 0,03
Стахиоза 3,14± 2,85± 3,23± 4,20± 3,68± 4,25± 4,17± 3,48±
Stachiose 0,47 0,78 0,12 0,34 0,94 0,54 0,19 0,38
ВМС 32,80± 38,57± 58,96± 75,38± 47,21± 46,97± 52,07± 50,71± 61,42± 69,45± 74,15±2 80,4±
HMC 0,98 1,05 2,92 2,07 1,71 1,94 1,99 1,48 1,72 2,77 ,54 3,38
Примечание: СВ - сухие вещества; ВМС - высокомолекулярные соединения; С - сыворотка Note: DS - dry substances; HMC - high molecular compounds; W - whey
1
3
Данные отличия незначительно повлияли на выход биомассы из нутовой сыворотки по сравнению с гороховой. Достоверных данных по уменьшению в культуральной жидкости количества мальтозы и сахарозы не выявлено. Увеличение количества дисахаридов к концу роста биомассы, как и количества ВМС, в культуральной жидкости можно объяснить
количественным перераспределением фракционного состава углеводов за счет усвоения моносахаридов дрожжами в процессе роста
С оптимальными режимами выращивания культуры получены лабораторные образцы КМРК (рис. 6), изучен их химический состав и токсичность. Концентрат имел розово-оранжевый цвет, посторонние
запахи отсутствовали. Спектрофотометрическим анализом экстрактов из биомассы дрожжей получили спектр поглощения каротиноидов в петролейном эфире (рис. 7) и хроматограмму ВЭЖХ-анализа пигментов (рис. 8) с различными максимумами поглощения (табл. 3). В биомассе обнаружены фитоин и его производные, торулен, ß-каротин, торулародин и фитоин. При этом известно, что первым продуктом
биосинтеза каротиноидов в растениях является фитоин [53], который через ряд реакций превращается в окрашенный ß-каротин, у-каротин [54], торулин и торулародин [55]. Провитаминная активность каротиноидов в нашем случае убывала в следующем порядке: производные фитоина>торулен>
ß-каротинэторулародин^итоин.
a b
Рисунок 6. Внешний вид КМРК, полученного на гороховой сыворотке: a - сырая биомасса; b - сухой концентрат Figure 6. Appearance of the FMVC obtained on pea serum: a - wet biomass; b - dry concentrate
Длина E олны. hm ' Время удержания, мин
Wavelength, run Holding time, min
Рисунок 7. Спектр поглощения экстракта пигментов в петролейном эфире
Figure 7. Absorption spectrum of pigment extract in petroleum ether
Рисунок 8. Хроматограмма ВЭЖХ-анализа пигментов: 1, 6 - производные фитоина; 2 - торулародин; 3 - торулен; 4 - в-каротин; 5 - фитоин
Figure 8. Chromatogram of HPLC analysis of pigment: 1, 6 - phytoin derivatives; 2 - torularodin; 3 - torulene; 4 - в-carotene; 5 - phytoin
Наряду с каротиноидами, КМРК содержал белки, жиры, минеральные элементы (показатель зольности), растворимые и нерастворимые волокна (табл. 3). В состав его белков входили 18 аминокислот (АК) (рис. 9), среди которых преобладали иммунноактивные аспарагиновая, глютаминовая кислоты, аланин. Скор для всех незаменимых АК у КМРК был выше 100%, что указывало на высокую биологическую ценность белков. Общая сумма незаменимых АК у горохового КМРК равнялась 21,86%, у нутового КМРК - 27,03%, от общего
их количества. Скор этих АК на 12-25% выше, чем у КМРК, полученного на той же гороховой сыворотке, но с консорциумом дрожжей Saccharomyces cerevisiae 121 и гриба Geotrichum candidum 977 (табл. 4), для нутовой сыворотки - на 6-17%, при том, что белки у обоих КМРК были биологически полноценные.
Жирнокислотный состав липидов КМРК включал 20% насыщенных и 78% ненасыщенных жирных кислот (табл. 5), соотношение жирных кислот (насышенные: моноеновые: полиеновые) равнялось 20:33:45, что
приравнивало их к липидам арахиса, томатов, кунжута и оливкового рафинированного масла. Среди ненасыщенных жирных кислот присутствовали линолевая кислота (ш=6), олеиновая (ш=9) и пальмитолеиновая кислота (ш=7). Среди насыщенных жирных кислот большая доля приходилась на пальмитиновую кислоту (13,70%), меньшая - на лауриновую кислоту с антибиотической активностью и стеариновую кислоту: 1,56±0,45% и 1,41±0,21%, соответственно. На долю душистых веществ (альдегид, эфир, кетон) приходилось в сумме 1,27%. Таким образом, липиды и каротиноиды КМРК в организме животных могут принимать активное участие в обмене веществ не только как энергетический материал, но и как компоненты, включающиеся в синтез гормонов,
витаминов и других биологически активных соединений.
Токсикологическая оценка КМРК, выполненная биотестированием с биологическими моделями из одноклеточной инфузории Tetrahymena pyriformis [52], показала, что в течение 24 часов концентрат стимулировал ее рост. На это указывало большее на 29,1% значение коэффициента роста микроорганизма, по сравнению с коэффициентом роста на дистиллированной воде (рис. 10). Нутовая сыворотка также являлась стимулирующей средой для дрожжей, коэффициент роста инфузорий выше на 18,6%, по сравнению с контролем. Картофельная сыворотка, наоборот, угнетала рост клеток инфузорий, возможно из-за гликоалколоидов.
Таблица 3. Каротиноидный состав горохового КМРК Table 3. Carotenoid composition of pea FMPC
№ Каротиноиды Carotinoids Время удержания с колонки, мин Column retention time, min Absorption maxima, nm Площадь пика Peak area Mol %
1 Производное фитоина Phytoin derivative 20,241 272/281/293 261842 90,6
2 Торулародин Torularodine 22,224 470/491/527 2746 1,0
3 Торулен Thorulen 32,340 458/487/519 9821 3,4
4 ß-Каротин ß-carotene 35,213 429/452/479 3664 1,3
5 Фитоин Phytoin 39,240 270/282/293 1912 0,7
6 Производное фитоина Phytoin derivative 40,038 271/282/293 8998 3,1
Ï
ffl M 6
U С
й ö 5
К о
2 1 0
□ Гороховый КРМК PeaFMPC
□ Нутовый КРМК Chickpea FMPC
i
¿i
im
F
Ii
1 fn
NI
Asp Thr Ser Glu Pro Cys Gli Ala Val Met Ile Leu Туг Plie His Lys Arg Trp
Рисунок 9. Аминокислотный состав горохового и нутового КМРК Figure 9. Amino acid composition of pea and chickpea FMPCs
Таблица 4. Химический состав горохового и нутового КМРК Table 4. Chemical composition of pea and chickpea FMPCs
Массовая доля влаги, %
Moisture, %
Массовая доля, % на СВ / Mass fraction, % on DS
Белок (Nx6,25)
Protein
Жир
Lipids
Зола
Ash
Волокна / Fiber
Растворимые Soluble
Нерастворимые Insoluble
6,76±0,11
58,90±3,03
1,20±0,06
4,53±0,23
9,33±0,46
26,04±0,26
Аминокислотный скор КМРК, % / Amino acid score of the FMPC, %
Val
His
Ile
Leu
Lys
Met+Cys
Thr
Trp
Phe+Tyr
Гороховый / Pea
R. mucilaginosa
120
243
136
119
129
240
201
272
221
S. cerevisiae + G. candidum
107
219
124
107
116
226
179
247
197
Нутовый / Chickpea
R. mucilaginosa
162
200
203
145
135
242
236
147
143
S. cerevisiae + G. candidum
151
188
197
136
127
225
221
137
135
Таблица 5. Состав жирных кислот КМРК, полученного с дрожжами R. mucilaginosa 111 Table 5. Fatty acid composition of FMPCs obtained with the yeast R. mucilaginosa 111
% к сумме % к сумме кислот % to the amount of acids
№ Жирные кислоты Fatty acids кислот % to the amount of acids № Жирные кислоты Fatty acids
1 1,1-dimethoxy-; n-Nonanal 0,10±0,03 10 9-Hexadecenoic acid 6,46±0,31
dimethyl acetal C11H24O2 Palmitoleic acid C16:1(9)
2 Decanoic acid 0,25±0,10 11 Hexadecanic acid 13,70±0,81
Capric acid С10:о Palmitic acid С16:0
3 Octanedioic acid Suberic acid C8H14O4 0,06±0,02 12 10-Heptadecenoic acid C17H32O2 1,50±0,12
4 Dodecanoic acid Lauric acid С12:0 1,56±0,45 13 Heptadecanoic acid Margaric acid C17H34O2 0,39±0,09
5 Benzophenone Diphenylketone (C6H5)2CO 0,07±0,03 14 2-Hydroxyhexadecanoic acid | a-Hydroxypalmitic acid C16H32O3 0,63±0,07
6 Nonanal dimethyl acetal Cinnamic acid butyl ester С13Н16О2 0,07±0,03 15 9,12-Octadecadienoic acid Linoleic acid C18:2(9,12) 45,26±0,10
7 Tetradecanoic acid 0,98±0,26 16 9-Octadecenoic acid 24,04±0,76
Myristic acid C14H28O2 Oleic acid C18H34O2
8 Pentadecanoic acid 1,62±0,30 17 6-Octadecenoic acid 0,88±0,22
Pentadecylic acid C15:0 Petroselic acid C18H34O2
9 Heptyl benzoate C13 H18 O2 1,03±0,18 18 Octadecanoic acid 1,41±0,21
Benzoic acid, heptyl ester Stearic acid С18Н36О2
Известно, что сухая сыворотка гороха может быть использована с грибами для производства веган-микопротеина [56]. Нами же показано, что с для штамма R. mucilaginosa 111, как и с консорциума S. cerevisiae 121 и G. candidum 977 [40], жидкая гороховая сыворотка, остающаяся после получения БК, также являлась эффективной питательной средой для синтеза биомассы, что может удешевлять производство. Несмотря на одинаковую массовую долю белка в биомассе в нашем случае с разными модификаторами (58,90±3,0% и 61,68±0,40% на СВ), преимуществом исследуемой биомассы являлось наличие каротиноидов. Биосинтез каротиноидов, как белков и липидов, в биомассе R. mucilaginosa 111 протекал при относительно низкой температуре, что соответствовало
данным, показывающим, что некоторые штаммы Rhodotorula растут не только при 28-32°С [55; 56], но и при температуре - 20-24°C (R. gracilis, R. glutinis, R. mucilaginosa) [31; 56; 57]. Исследуемый штамм R. mucilaginosa 111 наиболее эффективно развивался при температуре еще более низкой (16,9°С), что подтвердило тот факт, что вид питательной среды влияет не только на количественные показатели биомассы [26], но и на температуру ее накопления. Пониженная температура выращивания гриба защитит желудочно-кишечный тракт животных от нежелательных микробиологических процессов, которые, по каким-то причинам, могут возникнуть с данным видом биомассы.
Рисунок 10. Коэффициент роста культуры Tetrahymenapyriformis на биомассе различной природы:
1 - гороховая сыворотка, 2 - нутовая сыворотка, 3 - картофельная сыворотка;
4 - консорциум S. cerevisia 121 и G. сandidum 977; 5 - дистиллированная вода
Figure 10. Growth coefficient of Tetrahymena pyriformis culture on biomasses of different natures:
1 - pea serum, 2 - chickpea serum, 3 - potato serum; 4 - consortium of S. cerevisia 121
and G. candidum 977; 5 - distilled water
a J-.
ii" I П
11 ■ 11
0,0..........
1 2 3 4 5
Гороховая сыворотка - более эффективная питательная среда для роста биомассы, чем нутовая, и особенно -картофельная сыворотка. Продуктивность биомассы R. mucilaginosa 111 на гороховой сыворотке выше, чем, например, у дрожжей R. rubra, выращенных на фруктовых отходах (7,8 мг/см3) [19], или дрожжей R. mucilaginosa CCY 20-7-31 и Р. glutinis CCY 20-2-26 (35-40 г/дм3), произраставших на картофельных отходах [28]. Активное усвоение глюкозы штаммом R. mucilaginosa 111 из гороховой сыворотки согласовывалось с данными для других дрожжей. Так, каротиногенные дрожжи R. toruloides и R. glutinis использовали глюкозу, ксилозу, арабинозу [58-60], глюкоза больше повышала содержание липидов [59]. На важность присутствия глюкозы для увеличения биомассы R. toruloides Y4 и количества липидов указано и в работе [60]. Усвоение нашим штаммом дрожжей фруктозы и глюкозы совпадало с данными для культуры R. glutinis [51; 61]. Однако, из гороховой сыворотки исследуемый штамм усваивал и галактозу, что также не противоречило данным для базидиомицетных дрожжей R. toruloides, выделенных из хвойных пород деревьев [62]. Источником энергии для синтеза биомассы и ее компонентов могла быть и сахароза [63], но ее усвоение не наблюдали.
Профиль жирных кислот биомассы R. mucilaginosa 111 соотносился с профилем состава других питательных сред и дрожжей. Полиненасыщенные жирные кислоты биомассы дрожжей Rhodotorula, Cystofilobasidiu и Sporobolomyces sp., выращенных на отходах животного жира, также большей частью были представлены линолевой кислотой (C18:2) [64], из насыщенных жирных кислот обнаружили пальмитиновую (C16:0), стеариновую кислоты (C18:0). При ферментации дрожжей на лигноцеллюлозной среде при температуре 25°C в течение 48-72 часов доминирующими жирными кислотами являлись олеиновая (C18:1), пальмитиновая (C16:0) и линолевая (C18:2) кислоты. Жирные кислоты
биомассы нашего штамма по количеству располагалось аналогичным образом: больше всего линолевой кислоты (45,26%) и олеиновой кислоты (24,04%); обнаружены пальмитиновая и стеариновые кислоты, как и у R. toruloides Y4 [65]. В данной биомассе не было линоленовой кислоты, однако присутствовали также ненасыщенные пальмитолеиновая и 10-гептадеценовая кислоты. Общее количество ненасыщенных жирных кислот для штамма было несколько выше (78,14%), чем, например, у штамма R. toruloides Y4 (63,5%), выращенном ферментацией на питательной среде с глюкозой [66].
Основное количество каротиноидов в КМРК приходилось на фитоин и его производные (94,4%), остальное количество - на торулародин, торулен и в-каротин, тогда как, например, дрожжи штаммов R. glutinis и R. rubra способны синтезировать больше торулародина, торулена и в-каротина. Другим был состав и при использовании, свекловичной мелассы [67]. Это подтвердило то, что состав каротиноидов в значительной степени зависит от вида питательной среды. До настоящего времени нет единого мнения относительно путей синтеза каротиноидов в дрожжах. По мнению Simpson c соавторами [68], вначале из фитоина образуется его производное нейроспорин, который под влиянием ингибиторов или стрессовых факторов трансформируется в ликопен или в-зеака-ротин; при циклизации ликопена или дегидрировании в-зеакаротина образуется у-каротин, а при циклизации у-каротина, катализируемого в ликопинциклазой, синтезируется окрашенный в-каротин [54]. В присутствии фитоендезатуразы из молекулы у-каротина образуется торулин, который превращается в торулародин по реакциям гидроксилирования и оксигенации [55]. Фитоин и его производные обнаружены в печени, легких, толстой кишке человека, они защищают кожу от ультрафиолета, действуют как антиоксиданты и противовоспалительные агенты.
Полученная биомасса содержала все описанные здесь компоненты.
Коэффициент роста, определенный для КМРК из гороховой и нутовой сыворотки с инфузорией Tetrahymena pyriformis методом, по которому биотестировали корма [69], пищевые добавки [47] и лекарства [70], показал, что концентрат, полученный с R. mucilaginosa 111, для одноклеточной инфузории нетоксичный, что позволило сделать вывод об экологической чистоте нового штамма дрожжей и целесообразности дальнейшего тестирования продукта в целях получения его в виде кормовой добавки на животных.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные данные указывали на возможность использования жидкой гороховой сыворотки в качестве субстрата для производства КМРК с новым экологически безопасным штаммом R. mucilaginosa 111. Сыворотку получали как вторичный продукт переработки гороховой муки на пищевой концентрат, белки которого из ферментативного экстракта осаждали в изоэлектрической точке. Для синтеза нетоксичной биомассы, содержащей полноценный белок со скором незаменимых АК выше 100%, биологически эффективные липиды и каротиноиды, может использоваться штамм R. mucilaginosa 111, выделенный из вод Антарктиды. Провитаминная активность каротиноидов убывала следующим образом: производные фитоина>торулен>в-каротин>торулародин>фитоин. Относительно низкие концентрации каротиноидов в растительном сырье, дефицит полноценного белка для кормления животных и положительные результаты биоконверсии вторичного продукта переработки гороховой муки на белковый концентрат с новым безопасным штаммом R. mucilaginosa 111 позволили заключить, что данный процесс может стать перспективным путем для производства микробно-растительного концентрата, а новый штамм из рода Rhodotorula - эффективным модификатором для трансформации жидкой сыворотки в биологически активные кормовые добавки и фактором, способствующим снижению нежелательной нагрузки на биосферу в виде производственных стоков.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Matilde С., Lippolis A., Fava F., Rodolfi L. Microbes: Food for the Future // Foods. 2021. V. 10. N 5. P. 971 DOI: 10.3390/foods10050971
2. Shurson G.C. Yeast and yeast derivatives in feed additives and ingredients animal feed science and technology // Animal Feed Science and Technology. 2018. V. 235. P. 60-76. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2017.11.010
3. Martiniano S., Philippini R., Franco-Marcelino P.R. Effect of selenium uptake on growth metabolism in yeasts for the production of enriched single-cell protein using agro-industrial by-products // Biomass Conversion and Biorefinery. 2022. V. 12. P. 3975-3983. D0I:10.1007/s13399-020-00885-w
4. Kieliszek M., Kot A., Bzducha-Wróbel A., Stanistaw Btazejak
5. Biotechnological use of Candida yeasts in the food industry: A review // Fungal Biology Reviews. 2017. V. 31. N 4. P. 185-198. DOI: 10.1016/j.fbr.2017.06.001
5. Колодина Е.Н., Артемьева О.А., Котковская Е.Н., Павлюченкова О.В., Переселкова Д.А. Изучение биологической безопасности дрожжей рода Candida как
потенциального источника кормового белка // Вестник ОрелГАУ. 2016. Т. 5. N 62. С. 72-78. DOI:10.15217/48484
6. Серба Е.М., Соколова Е.Н., Фурсова Н.А., Волкова Г.С., Борщева ЮА., Курбатова Е.И., Куксова Е.В. Получение биологически активных добавок на основе обогащенной дрожжевой биомассы // Хранение и переработка сельхозсырья. 2018. Т. 2. С. 74-79.
7. Frengova G.I., Beshkova D.M., Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia: Yeasts of Biotechnological Importance // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2009. V. 36. N 2. P. 163-180. DOI: 10.1007/s10295-008-0492-9
8. Young A.J., Lowe G.M., Young A.J. and Lowe G.M. Antioxidant and Prooxidant Properties of Carotenoids // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2001. V. 385. N 1. P. 20-27. DOI: 10.1006/abbi.2000.2149
9. Шашкина М.Я., Шашкин П.Н., Сергеев А.В. Роль каротиноидов в профилактике наиболее распространенных заболеваний. Лекарственная терапия // Российский биотерапевтический журнал. 2010. Т. 9. N 1. С. 77-86.
10. Кузьминова Е.В., Семененко М.П., Кощаев А.Г., Трошин А.Н. Биологические функции каротиноидов при воспроизводстве крупного рогатого скота // Научный журнал КубГАУ. 2017. Т. 129. С. 1124-1136. DOI: 10.21515/1990-4665129-080
11. Lowe G.M., Booth L.A., Young A.J., Bilton R.F. Lycopene and beta-carotene protect against oxidative damage in HT29 cells at low concentrations but rapidly lose this capacity at higher doses // Free Radical Research. 1999. V. 30. N 2. P. 141-151. DOI: 10.1080/10715769900300151
12. Saini R.K., Keum Y.-S., Daglia M., Rengasamy K.R. Dietary carotenoids in cancer chemoprevention and chemotherapy: A review of emerging evidence // Pharmacological Research. 2020. V. 155. Article Number: 104730. DOI: 10.1016/j.phrs.2020.104730
13. Zhao B., Ren B., Guo R., Zhang W., Ma S., Yao Y., Yuan T., Liu Z., Liu X., Zhao B., et al. Supplementation of lycopene attenuates oxidative stress induced neuroinflammation and cognitive impairment via Nrf2/NF-KB transcriptional pathway // Food and Chemical Toxicology. 2017. V. 109. Pt 1. P. 505-516. DOI: 10.1016/j.fct.2017.09.050
14. Kaulmann A., Bohn T., Kaulmann A., et al. Carotenoids, inflammation, and oxidative stress-implications of cellular signaling pathways and relation to chronic disease prevention // Nutrition Research. 2014. V. 34. N 11. P. 907-929. DOI: 10.1016/j.nutres.2014.07.010
15. Juhyun Shin, Min-Ho Song, Jae-Wook Oh, Young-Soo Keum, Ramesh Kumar Saini, Pro-oxidant Actions of Carotenoids in Triggering Apoptosis of Cancer Cells: A Review of Emerging Evidence // Antioxidants. 2020. V. 9. N 6. p. 532. DOI: 10.3390/antiox9060532
16. Оразова С.Б., Карпенюк Т.А., Шарипов К.О., Азимханова Б.Б., Гончарова А.В. Изучение жирнокислотного состава и антимикробной активности суммарных экстрактов липидов зеленых микроводорослей // Вестник Казахского Национального медицинского университета. 2017. Т. 3. С. 240-242.
17. Saini R.K., Keum Y-S. Microbial platforms to produce commercially vital carotenoids at industrial scale: An updated review of critical issues // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2019. V. 46. N 5. P. 657-674. DOI: 10.1007/s10295-018-2104-7
18. Кощаев А.Г., Калюжный С.А., Кощаева О.В., Гавриленко Д.В., Елисеев М.А. Функциональные кормовые добавки из каротинсодержащего растительного сырья для птицеводства // Научный журнал КубГАУ. 2013. Т. 93. С. 334-343.
19. Korumilli T., Susmita M. Carotenoid production by Rhodotorula sp. on fruit waste extract as a sole carbon source and optimization of key parameters // Iranian Journal of
Chemistry & Chemical Engineering-International. 2014. V. 33. P. 89-99.
20. Tang W., Wang Y., Zhang J., Cai Y., He Z. Biosynthetic Pathway of Carotenoids in Rhodotorula and Strategies for Enhanced Their Production // Applied microbiology and biotechnology. 2019. V. 29. N 4. P. 507-517. DOI: 10.4014/jmb.1801.01022
21. Moline M., Flores M.R., Libkind D., del Carmen D.M., Farias M.E., van Broock M. Photoprotection by carotenoid pigments in the yeast Rhodotorula mucilaginosa: the role of torularhodin // Photochemical & Photobiological Sciences. 2010. V. 9. P. 11451151. DOI: 10.1039/c0pp00009d
22. Buzzini P., Innocenti M., Turchetti B., Libkind D., van Broock M., Mulinacci N. Carotenoid profiles of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces and Sporidiobolus // Canadian Journal of Microbiology. 2007. V. 53. P. 1024-1031. DOI: 10.1139/W07-068
23. Matselyukh B.P., Matselyukh D.Ya., Golembiovska S.L., Gural S.V. Isolation of Phaffia rhodozyma yeasts mutants under increased carotenoid content // Biotechnologia Acta. 2014. V. 7. N 4. P. 49-53. DOI: 10.15407/biotech7.04.049
24. Alakra F., Saygun A., Ye§ilfubuk N.S. Biotechnological production of lipids and carotenoids from Rhodosporidium toruloides Y27012 // European Journal of Science and Technology. 2020. V. 19. P. 156-164. DOI: 10.31590/ejosat.708556.
25. Wu C.C., Ohashi T., Kajiura H., Sato Y., Misaki R., Honda K., Limtong S., Fujiyama K. Functional characterization and overexpression of Delta 12-desaturase in the oleaginous yeast Rhodotorula toruloides for production of linoleic acid-rich lipids // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2021. V. 131. N 6. P. 631-639. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2021.02.002
26. Caporusso A., Capece A., De Bari I. Oleaginous Yeasts as Cell Factories for the Sustainable Production of Microbial Lipids by the Valorization of Agri-Food Wastes // Fermentation-Basel. 2021. V. 7. N 2. p. 50. DOI: 10.3390/fermentation7020050
27. Papaniklaou S., Aggelis G. Lipids of oleaginous yeasts. Part I: Biochemistry of single cell oil production // European Journal of Lipid Science and Technology. 2011. V. 113. N 8. P. 1031-1051. DOI: 10.1002/ejlt.201100014
28. Marova I., Carnecka M., Halienova A., Certik M., Dvorakova T., Haronikova A. Use of several waste substrates for carotenoid-rich yeast biomass production // Journal of Environmental Management. 2012. V. 95. P. 338-342. DOI: 10.1016/j.jenvman.2011.06.018
29. Гавриленко Д.В., Кощаев А.Г. Биотехнология получения комплексной кормовой добавки для птицы // Сборник научных трудов КНЦЗВ. 2019. Т. 8. N 3. С. 165-168. DOI: 10.34617/tdf5-y729
30. Abramova I.M., Soloviev A.O., Turshatov M.V., Krivchenko V.A., Kononenko V.V. Protein feedstuff production based on microbial biomass // IOP Conference Series-Earth and Environmental Science. 2020. V. 548. Article number: 082080. DOI: 10.1088/1755-1315/548/8/082080
31. Ng H.S., Kee P.E., Yim H.S., Chen P.-T., Wei Yu-H., Lan J.C.-W. Recent advances on the sustainable approaches for conversion and reutilization of food wastes to valuable bioproducts // Bioresource Technology. 2020. V. 302. Article number: 122889. DOI: 10.1016/j.biortech.2020.122889
32. Usmani Z., Sharma M., Sudheer S., Gupta V.K., Rajeev Bhat. R. Engineered Microbes for Pigment Production Using Waste Biomass // Current Genomics. 2020. V. 21. N 2. P. 80-95. DOI: 10.2174/13892029219 99200330152007
33. Kot A.M., Btazejak S., Kieliszek M., Gientka I., Brys J., Reczek L., Pobiega K. Effect of exogenous stress factors on the biosynthesis of carotenoids and lipids by Rhodotorula yeast strains in media containing agro-industrial waste // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019. V. 35. N 10. 157 p. DOI: 10.1007/s11274-019-2732-8
34. Kot A., Btazejak S. Production of lipids and carotenoids by Rhodotorula gracilis ATCC 10788 yeast in a bioreactor using low-cost wastes // Biocatalysis and agricultural biotechnology. 2020. V. 26. N 4. Article id: 101634. DOI: 10.1016/j.bcab.2020.101634
35. Bertacchi S., Pagliari S., Cantu C., Bruni I., Labra M., Branduardi P. Enzymatic Hydrolysate of Cinnamon Waste Material as Feedstock for the Microbial Production of Carotenoids // International Journal of Environmental Research and Public Health. 2021. V. 18. N 3. Article id: 1146. DOI: 10.3390/ijerph18031146
36. Frengova G., Simova E., Beshkova D. Use of whey ultrafiltrate as a substrate for production of carotenoids by the yeast Rhodotorula rubra // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2004. V. 112. N 3. P. 133-141. DOI: 10.1385/abab:112:3:133
37. Qi F., Shen P., Hu R., Xue T., Jiang X., Qin L., Chen Y., Huang J. Carotenoids and lipid production from Rhodosporidium toruloides cultured in tea waste hydrolysate // Biotechnology for Biofuels. 2020. V. 13. N 74. DOI: 10.1186/s13068-020-01712-0
38. Schneider T., Graeff-Honninger P.S. Lipid and carotenoid production by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis cultivated on brewery effluents // Energy. 2013. V. 61. N 1. P. 34-43. DOI: 10.1016/j.energy.2012.12.026
39. Libkind D., van Broock M. Biomass and carotenoid pigment production by Patagonian native yeasts // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2006. V. 22. N 7. P. 687-692. DOI: 10.33448/rsd-v9i4.3057
40. Куликов Д.С., ^лпакова В.В., Уланова Р.В., Чумикина Л.В., Бессонов В.В. Биологическая переработка зерна гороха с получением пищевых и кормовых белковых концентратов // Биотехнология. 2020. Т. 36. N 4. С. 49-58. DOI: 10.21519/0234-2758-2020-36-4-49-58
41. Гольдштейн В.Г., Коваленок В.А., Кривцун Л.В. и др. Изучение параметров, влияющих на коагуляцию белка картофельного сока // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. N 5. С. 78-80. DOI: 10.24411/0235-2451-201810520
42. Семенов Г.В. Вакуумная сублимационная сушка. Москва: ДеЛи плюс, 2013. 264 с.
43. ГОСТ 10846-91. Зерно и продукты его переработки. Метод определения белка. M.: Стандартинформ, 2009, 8 с.
44. ГОСТ 13586.5-93. Зерно. Метод определения влажности. M.: Стандартинформ, 2009. 6 с.
45. ГОСТ Зерно. Метод определения зольности. Стандартинформ, 2019. 20 с.
46. ГОСТ 29033-91. Зерно и продукты его переработки. Метод определения жира. Стандартинформ, 2004. 5 с.
47. Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др. Пищевая химия: Лабораторный практикум. Пособие для вузов / под ред. А.П. Нечаева. СПб: ГИОРД, 2006, 304 с.
48. Dietary protein quality evaluation in human nutrition: Report of an FAO Expert Consultation, Rome: FAO, 2013. 66 p.
49. ISO 13903:2005. Корма, комбикорма. Метод определения содержания аминокислот. Стандарт информ, 2020. 20 с.
50. Ashikhmin A., Makhneva Z., Bolshakov M., Moskalenko A. Incorporation of spheroidene and spheroidenone into light-harvesting complexes from purple sulfur bacteria // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2017. V. 170. P. 99-107. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2017.03.020
51. Gall A., Henry S., Takaichi S., Robert B., Cogdell R.J. Preferential incorporation of coloured-carotenoids occurs in the LH2 complexes from non-sulphur purple bacteria under carotenoid-limiting conditions // Photosynthesis Research. 2005. V. 86. P. 25-35. DOI: 10.1007/s11120-005-3481-0
52. Черемных Е.Г., Кулешин А.В., Кулешина О.Н. Биотестирование пищевых добавок на инфузориях // Вестник РУДН, серия Экология и безопасность жизнедеятельности. 2011. Т. 3. С. 5-12.
53. Latha B.V., Jeevaratnam K., Murali H.S., Manja K.S. Influence of growth factors on carotenoid pigmentation of Rhodotorula glutinis DFR-PDY from natural source // Indian Journal of Biotechnology. 2005. V. 4. P. 353-357.
54. Kot A.M., Btazejak S., Kurcz A., Gientka I., Kieliszek M. Rhodotorula glutinis -potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries // Applied Microbiology and Biotechnology. 2016. V. 100. N 14. P. 6103-6117. DOI: 10.1007/S00253-016-7611-8
55. Goodwin T.W. Biosynthesis of carotenoids. The biochemistry of the carotenoids, vol. 1. Chapman and Hall / In: Goodwin TW (ed), 1980. P. 33-76. DOI: 10.1007/978-94-009-5860-9_2
56. Souza Filho P.F., Nair R.B., Andersson D., Lennartsson P.R., Taherzadeh M.J. Vegan-mycoprotein concentrate from pea-processing industry byproduct using edible filamentous fungi // Fungal Biology and Biotechnology. 2018. V. 2. N 5. pp. 5. DOI: 10.1186/s40694-018-0050-9
57. Zhang Z., Zhang X., Tan T. Lipid and carotenoid production by Rhodotorula glutinis under irradiation/high-temperature and dark/low-temperature cultivation // Bioresource Technology. 2014. V. 157. P. 149-153. DOI: 10.1016/j.biortech.2014.01.039
58. Vijayalakshmi G., Shobha B., Vanajakshi V., Divakar S., Manohar B. Response surface methodology for optimization of growth parameters for the production of carotenoids by a mutant strain of Rhodotorula gracilis // European Food Research and Technology. 2001. V. 213. N 3. P. 234-239. DOI: 10.1007/s002170100356
59. Bhosale P., Gadre R.V. Manipulation of temperature and illumination conditions for enhanced beta-carotene production by mutant 32 of Rhodotorula glutinis // Letters in Applied Microbiology. 2002. V. 34. N 5. P. 349-353. DOI: 10.1046/j.1472-765x.2002.01095.x
60. Cescut J., Fillaudeau L., Molina-Jouve C., Uribelarrea J.-L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation // Biotechnology for Biofuels. 2014. V. 7. pp. 164. DOI: 10.1186/s13068-014-0164-0
61. Wiebe M.G., Koivuranta K., Penttila M., Ruohonen L. Lipid production in batch and fed-batch cultures of Rhodosporidium toruloides from 5 and 6 carbon carbohydrates // BMC Biotechnology. 2012. V. 12. N 1. pp. 26. DOI: 10.1186/14726750-12-26
62. Yaegashi J., Kirby J., Ito M., Sun J., Dutta T., Mirsiaghi M., Sundstrom E.R., Rodriguez A., Baidoo E., Tanjore D., Pray T. Rhodosporidium toruloides: a new platform organism for conversion of lignocellulose into terpene biofuels and bioproducts // Biotechnology for Biofuels. 2017. V. 10. N 1. pp. 241. DOI: 10.1186/s13068-017-0927-5
63. Tkachenko А., Tigunova Е., Schulga S. Microbial lipids are an alternative raw material for biofuel // Microbiology and Biotechnology. 2012. V. 3. P. 17-33. DOI: 10.18524/2307-4663.2012.3(19).92616
64. Szotkowski M., Byrtusova D., Haronikova A., Vysoka M., Rape M., Shapaval V., Marova I. Study of Metabolic Adaptation of Red Yeasts to Waste Animal Fat Substrate // Microorganisms. 2019. V. 7. N 11. pp. 578. DOI: 10.3390/microorganisms7110578
65. Zhao X., Hu C., Wu S., Shen H., Zhao Z. Lipid production by Rhodosporidium toruloides Y4 using different substrate feeding strategies // Journal of industrial microbiology and biotechnology. 2011. V. 38. P. 627-632. DOI: 10.1007/s10295-010-0808-4
66. Li Y., Zhao Z. (Kent), Bai F., High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture // Enzyme and Microbial Technology. 2007. V. 41. P. 312-317. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2007.02.008
67. Червякова О.П. Получение микробной биомассы, обогащенной каротиноидами // Успехи в химии и химической технологии. 2010. Т. 24. N 11(116). С. 51-53.
68. Simpson K.O., Nakayama T.S., Chichester S.O. Biosynthesis of yeast carotenoids // Journal of Bacteriology. 1964. V. 88. N 6. P. 1688-1694.
69. Демиденко Г.А., Шуранов В.В. Оценка токсичности кормов с использованием инфузорий Paramecium caudatum // Вестник Красноярского государственного аграрного университета. 2015. Т. 10. С. 5-11.
70. Серегина О.Б., Леонидов Н.Б. Простейшие как альтернативный биологический тест-объект в фармации // Фармация. 2003. Т. 4. С. 43-45.
REFERENCES
I. Matilde С., Lippolis A., Fava F., Rodolfi L. Microbes: Food for the Future. Foods, 2021, vol. 10, no. 5, p. 971. DOI: 10.3390/foods10050971
2.Shurson G.C. Yeast and yeast derivatives in feed additives and ingredients animal feed science and technology. Animal Feed Science and Technology, 2018, vol. 235, pp. 60-76. DOI: 10.1016/j.anifeedsci.2017.11.010
3.Martiniano S., Philippini R., Franco-Marcelino P.R. Effect of selenium uptake on growth metabolism in yeasts for the production of enriched single-cell protein using agro-industrial by-products. Biomass Conversion and Biorefinery, 2020, 7 pp. DOI: 10.1007/s13399-020-00885-w
4. Kieliszek M., Kot A., Bzducha-Wróbel A., Stanistaw Btazejak S. Biotechnological use of Candida yeasts in the food industry: A review. Fungal Biology Reviews, 2017, vol. 31, no. 4, pp. 185198. DOI: 10.1016/j.fbr.2017.06.001
5.Kolodina E.N., Artem'eva O.A., Kotkovskaya E.N., Pavlyuchenkova O.V., Pereselkova D.A. The study of the biological safety of yeast of the genus Candida as a potential source of feed protein. Vestnik OrelGAU, 2016, vol. 5, no. 62, pp. 72-78. (In Russian) DOI: 10.15217/48484
6.Serba E.M., Sokolova E.N., Fursova N.A., Volkova G.S., Borshcheva Yu.A., Kurbatova E.I., Kuksova E.V. Obtaining biologically active additives based on enriched yeast biomass. Khranenie i pererabotka sel'khozsyr'ya [Storage and processing of agricultural raw materials]. 2018, vol. 2, pp. 74-79. (In Russian)
7.Frengova G.I., Beshkova D.M., Carotenoids from Rhodotorula and Phaffia: Yeasts of Biotechnological Importance. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2009, vol. 36, no. 2, pp. 163-180. DOI: 10.1007/s10295-008-0492-9
8.Young A.J., Lowe G.M., Young A.J. and Lowe G.M. Antioxidant and Prooxidant Properties of Carotenoids. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2001, vol. 385, no. 1, pp. 20-27. DOI: 10.1006/abbi.2000.2149
9.Shashkina M.Ya., Shashkin P.N., Sergeev A.V. The role of carotenoids in the prevention of the most common diseases. Drug therapy. Rossiiskii bioterapevticheskii zhurnal [Russian Journal of Biotherapy]. 2010, vol. 9, no. 1, pp. 77-86. (In Russian) 10. Kuzminova E.V., Semenenko M.P., Koshchaev A.G., Troshin A.N. Biological functions of carotenoids in the reproduction of cattle. Scientific journal of KubGAU, 2017, vol. 129, pp. 11241136. (In Russian) DOI: 10.21515/1990-4665-129-080
II. Lowe G.M., Booth L.A., Young A.J., Bilton R.F. Lycopene and beta-carotene protect against oxidative damage in HT29 cells at low concentrations but rapidly lose this capacity at higher doses. Free Radical Research, 1999, vol. 30, no. 2, pp. 141-151. DOI: 10.1080/10715769900300151
12. Saini R.K., Keum Y.-S., Daglia M., Rengasamy K.R. Dietary carotenoids in cancer chemoprevention and chemotherapy: A review of emerging evidence. Pharmacological Research, 2020, vol. 155, article number: 104730. DOI: 10.1016/j.phrs.2020.104730
13. Zhao B., Ren B., Guo R., Zhang W., Ma S., Yao Y., Yuan T., Liu Z., Liu X., Zhao B., et al. Supplementation of lycopene attenuates oxidative stress induced neuroinflammation and cognitive impairment via Nrf2/NF-KB transcriptional pathway. Food and
Chemical Toxicology, 2017, vol. 109, pt. 1, pp. 505-516. DOI: 10.1016/j.fct.2017.09.050
14. Kaulmann A., Bohn T. Carotenoids, inflammation, and oxidative stress-implications of cellular signaling pathways and relation to chronic disease prevention. Nutrition Research, 2014, vol. 34, no. 11, pp. 907-929. DOI: 10.1016/j.nutres.2014.07.010
15. Juhyun Shin, Min-Ho Song, Jae-Wook Oh, Young-Soo Keum and Ramesh Kumar Saini, Pro-oxidant Actions of Carotenoids in Triggering Apoptosis of Cancer Cells: A Review of Emerging Evidence. Antioxidants, 2020, vol. 9, p. 532. DOI: 10.3390/antiox9060532
16. Orazova S.B., Karpenyuk T.A., Sharipov K.O., Azimkhanova B.B., Goncharova A.V. Study of the fatty acid composition and antimicrobial activity of total lipid extracts of green microalgae. Vestnik Kazakhskogo Natsional'nogo meditsinskogo universiteta [Bulletin of the Kazakh National Medical University]. 2017, vol. 3, pp. 240-242. (In Russian)
17. Saini R.K., Keum Y-S. Microbial platforms to produce commercially vital carotenoids at industrial scale: An updated review of critical issues. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2019, vol. 46, no. 5, pp. 657-674. DOI: 10.1007/s10295-018-2104-7
18. Koschaev A.G., Kalyuzhny S.A., Koschaeva O.V., Gavrilenko D.V., Eliseev M.A. Functional feed additives from carotene-containing vegetable raw materials for poultry farming. Nauchnyi zhurnal KubGAU [Scientific journal of KubGAU]. 2013, vol. 93, pp. 334-343. (In Russian)
19. Korumilli T., Susmita M. Carotenoid production by Rhodotorula sp. on fruit waste extract as a sole carbon source and optimization of key parameters. Iranian Journal of Chemistry & Chemical Engineering-International. 2014, vol. 33, pp. 89-99.
20. Tang W., Wang Y., Zhang J., Cai Y., He Z. Biosynthetic Pathway of Carotenoids in Rhodotorula and Strategies for Enhanced Their Production. Applied microbiology and biotechnology, 2019, vol. 29, no. 4, pp. 507-517. DOI: 10.4014/jmb.1801.01022
21. Moliné M., Flores M.R., Libkind D., del Carmen D.M., Farias M.E., van Broock M. Photoprotection by carotenoid pigments in the yeast Rhodotorula mucilaginosa: the role of torularhodin. Photochemical & Photobiological Sciences, 2010, vol. 9, pp. 1145-1151. DOI: 10.1039/c0pp00009d
22. Buzzini P., Innocenti M., Turchetti B., Libkind D., van Broock M., Mulinacci N. Carotenoid profiles of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, and Sporidiobolus. Canadian Journal of Microbiology, 2007, vol. 53, pp. 1024-1031. DOI: 10.1139/W07-068
23. Matselyukh B.P., Matselyukh D.Ya., Golembiovska S.L., Gural S.V. Isolation of Phaffia rhodozyma yeasts mutants under increased carotenoid content. Biotechnologia Acta, 2014, vol. 7, no. 4, pp. 49-53. DOI: 10.15407/biotech7.04.049
24. Alakra F., Saygün A., Yeçilçubuk N.S. Biotechnological production of lipids and carotenoids from Rhodosporidium toruloides Y27012. European Journal of Science and Technology, 2020, vol. 19, pp. 156-164. DOI: 10.31590/ejosat.708556
25. Wu C.C., Ohashi T., Kajiura H., Sato Y., Misaki R., Honda K., Limtong S., Fujiyama K. Functional characterization and overexpression of Delta 12-desaturase in the oleaginous yeast Rhodotorula toruloides for production of linoleic acid-rich lipids. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2021, vol. 131, no. 6, pp. 631-639. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2021.02.002
26. Caporusso A., Capece A., De Bari I. Oleaginous Yeasts as Cell Factories for the Sustainable Production of Microbial Lipids by the Valorization of Agri-Food Wastes. Fermentation-Basel, 2021, vol. 7, no. 2, p. 50. DOI: 10.3390/fermentation7020050
27. Papaniklaou S., Aggelis G. Lipids of oleaginous yeasts. Part I: Biochemistry of single cell oil production. European Journal of Lipid Science and Technology, 2011, vol. 113, no. 8, pp. 10311051. DOI: 10.1002/ejlt.201100014
28. Marova I., Carnecka M., Halienova A., Certik M., Dvorakova T., Haronikova A. Use of several waste substrates for carotenoid-
rich yeast biomass production. Journal of Environmental Management, 2012, vol. 95, pp. 338-342. DOI: 10.1016/j.jenvman.2011.06.018
29. Gavrilenko D.V., Koshaev A.G. Biotechnology for obtaining a complex feed additive for poultry. Collection of scientific papers KNTsZV, 2019, vol. 8, no. 3, pp. 165-168. (In Russian) DOI: 10.34617/tdf5-y729
30. Abramova I.M., Soloviev A.O., Turshatov M.V., Krivchenko V.A., Kononenko V.V. Protein feedstuff production based on microbial biomass. IOP Conference Series-Earth and Environmental Science, 2020, vol. 548, article number: 082080. DOI: 10.1088/1755-1315/548/8/082080
31. Ng H.S., Kee P.E., Yim H.S., Chen P.-T., Wei Yu-H., Lan J.C.-W. Recent advances on the sustainable approaches for conversion and reutilization of food wastes to valuable bioproducts. Bioresource Technology, 2020, vol. 302, article number: 122889. DOI: 10.1016/j.biortech.2020.122889
32. Usmani Z., Sharma M., Sudheer S., Gupta V.K., Rajeev Bhat. R. Engineered Microbes for Pigment Production Using Waste Biomass. Current Genomics, 2020, vol. 21, no. 2, pp. 80-95. DOI: 10.2174/13892029219 99200330152007
33. Kot A.M., Btazejak S., Kieliszek M., Gientka I., Brys J., Reczek L., Pobiega K. Effect of exogenous stress factors on the biosynthesis of carotenoids and lipids by Rhodotorula yeast strains in media containing agro-industrial waste. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2019, vol. 35, no. 10, pp. 157. DOI: 10.1007/s11274-019-2732-8
34. Kot A., Btazejak S. Production of lipids and carotenoids by Rhodotorula gracilis ATCC 10788 yeast in a bioreactor using low-cost wastes. Biocatalysis and agricultural biotechnology, 2020, vol. 26, no. 4, article number: 101634. DOI: 10.1016/j.bcab.2020.101634
35. Bertacchi S., Pagliari S., Cantù C., Bruni I., Labra M., Branduardi P. Enzymatic Hydrolysate of Cinnamon Waste Material as Feedstock for the Microbial Production of Carotenoids. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2021, vol. 18, no. 3, article number: 1146. DOI: 10.3390/ijerph18031146
36. Frengova G., Simova E., Beshkova D. Use of whey ultrafiltrate as a substrate for production of carotenoids by the yeast Rhodotorula rubra. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2004, vol. 112, no. 3, pp. 133-141. DOI: 10.1385/abab:112:3:133
37. Qi F., Shen P., Hu R., Xue T., Jiang X., Qin L., Chen Y., Huang J. Carotenoids and lipid production from Rhodosporidium toruloides cultured in tea waste hydrolysate. Biotechnology for Biofuels, 2020, vol. 13, no. 74. DOI: 10.1186/s13068-020-01712-0
38. Schneider T., Graeff-Hönninger P.S. Lipid and carotenoid production by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis cultivated on brewery effluents. Energy, 2013, vol. 61, no. 1, pp. 34-43. DOI: 10.1016/j.energy.2012.12.026
39. Libkind D., van Broock M. Biomass and carotenoid pigment production by Patagonian native yeasts. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, vol. 22, no. 7, pp. 687692. DOI: 10.33448/rsd-v9i4.3057
40. Kulikov D.S., Kolpakova V.V., Ulanova R.V., Chumikina L.V., Bessonov V.V. Biological processing of pea grain to obtain food and feed protein concentrates. Biotechnology, 2020, vol. 36, no. 4, pp. 49-58. (In Russian) DOI: 10.21519/0234-2758-2020-36-449-58
41. Goldstein V.G., Kovalenok V.A., Krivtsun L.V. et al. Investigation of parameters influencing coagulation of protein in potato juice. Achievements of science and technology of the agro-industrial complex, 2018, vol. 32, no. 5, pp. 78-80. (In Russian) DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10520
42. Semenov G.V. Vakuumnaya sublimatsionnaya sushka [Vacuum freeze drying]. Moscow. DeLi plus Publ., 2013, 264 p. (In Russian)
43. GOST10846-91. Zerno iprodukty ego pererabotki. Metod opredeleniya belka [GOST 10846-91. Grain and products of its processing. Protein determination method]. Moscow, Standartinform Publ., 2009, 8 p. (In Russian)
44. GOST 13586.5-93. Zerno. Metod opredeleniya vlazhnosti [GOST 13586.5-93. Corn. Moisture determination method]. Moscow, Standartinform Publ., 2009, 6 p. (In Russian)
45. GOST Zerno. Metod opredeleniya zol'nosti [GOST 108472019. Corn. Ash content determination method]. Moscow, Standartinform Publ., 2019, 20 p. (In Russian)
46. GOST29033-91. Zerno i produkty ego pererabotki. Metod opredeleniya zhira [GOST 29033-91. Grain and products of its processing. Fat determination method]. Standards Publ., 2004, 5 p. (In Russian)
47. Nechaev A.P., Traubenberg S.E., Kochetkova A.A. et. al. Pishchevaya khimiya: Laboratornyy praktikum. Posobiye dlya vuzov [Food Chemistry: Laboratory Workshop. Allowance for universities]. St. Petersburg, GIORD Publ., 2006, 304 p. (In Russian)
48. Dietary protein quality evaluation in human nutrition: Report of an FAO Expert Consultation, Rome: FAO. 2013, 66 p.
49. ISO 13903:2005. Korma, kombikorma. Metod opredeleniya soderzhaniya aminokislot [ISO 13903:2005. Feeds, compound feeds. Method for determination of amino acids]. Moscow, Standartinform Publ, 2020, 20 p. (In Russian)
50. Ashikhmin A., Makhneva Z., Bolshakov M., Moskalenko A. Incorporation of spheroidene and spheroidenone into light-harvesting complexes from purple sulfur bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2017, vol. 170, pp. 99-107. DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2017.03.020
51. Gall A., Henry S., Takaichi S., Robert B., Cogdell R.J. Preferential incorporation of coloured-carotenoids occurs in the LH2 complexes from non-sulphur purple bacteria under carotenoid-limiting conditions. Photosynthesis Research, 2005, vol. 86, pp. 25-35. DOI:10.1007/s11120-005-3481-0
52. Cheremnykh E.G., Kuleshin A.V., Kuleshina O.N. Biotesting of food additives on ciliates. Vestnik RUDN, seriya Ekologiya i bezopasnost' zhiznedeyatel'nosti [Bulletin of RUDN University, series Ecology and life safety]. 2011, vol. 3, pp. 5-12. (In Russian)
53. Latha B.V., Jeevaratnam K., Murali H.S., Manja K.S. Influence of growth factors on carotenoid pigmentation of Rhodotorula glutinis DFR-PDY from natural source. Indian Journal of Biotechnology. 2005, vol. 4, pp. 353-357.
54. Kot A.M., Btazejak S., Kurcz A., Gientka I., Kieliszek M. Rhodotorula glutinis -potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 2016, vol. 100, no. 14, pp. 6103-6117. DOI: 10.1007/s00253-016-7611-8
55. Goodwin T.W. Biosynthesis of carotenoids. The biochemistry of the carotenoids, vol 1. Chapman and Hall. In: Goodwin T.W. (ed). 1980, pp. 33-76. DOI: 10.1007/978-94-009-5860-9_2
56. Souza Filho P.F., Nair R.B., Andersson D., Lennartsson P.R., Taherzadeh M.J. Vegan-mycoprotein concentrate from pea-processing industry byproduct using edible filamentous fungi. Fungal Biology and Biotechnology, 2018, vol. 2, no. 5, p. 5. DOI: 10.1186/s40694-018-0050-9
57. Zhang Z., Zhang X., Tan T. Lipid and carotenoid production by Rhodotorula glutinis under irradiation/high-temperature and dark/low-temperature cultivation. Bioresource Technology, 2014, vol. 157, pp. 149-153. DOI: 10.1016/j.biortech.2014.01.039
58. Vijayalakshmi G., Shobha B., Vanajakshi V., Divakar S., Manohar B. Response surface methodology for optimization of growth parameters for the production of carotenoids by a mutant strain of Rhodotorula gracilis. European Food Research and Technology, 2001, vol. 213, no. 3, pp. 234-239. DOI: 10.1007/s002170100356
59. Bhosale P., Gadre R.V. Manipulation of temperature and illumination conditions for enhanced beta-carotene production by mutant 32 of Rhodotorula glutinis. Letters in Applied Microbiology, 2002, vol. 34, no. 5, pp. 349-353. DOI: 10.1046/j.1472-765x.2002.01095.x
60. Cescut J., Fillaudeau L., Molina-Jouve C., Uribelarrea J.-L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels, 2014, vol. 7, no. 164. DOI: 10.1186/s13068-014-0164-0
61. Wiebe M.G., Koivuranta K., Penttila M., Ruohonen L. Lipid production in batch and fed-batch cultures of Rhodosporidium toruloides from 5 and 6 carbon carbohydrates. BMC Biotechnology, 2012, vol. 12, no. 1, pp. 26. DOI: 10.1186/14726750-12-26
62. Yaegashi J., Kirby J., Ito M., Sun J., Dutta T., Mirsiaghi M., Sundstrom E.R., Rodriguez A., Baidoo E., Tanjore D., Pray T. Rhodosporidium toruloides: a new platform organism for conversion of lignocellulose into terpene biofuels and bioproducts. Biotechnology for Biofuels, 2017, vol. 10, no. 1, pp. 241. DOI: 10.1186/s13068-017-0927-5
63. Tkachenko А., Tigunova Е., Schulga S. Microbial lipids are an alternative raw material for biofuel. Microbiology and Biotechnology, 2012, vol. 3, pp. 17-33. DOI: 10.18524/2307-4663.2012.3(19).92616
64. Szotkowski M., Byrtusova D., Haronikova A., Vysoka M., Rape M., Shapaval V., Marova I. Study of Metabolic Adaptation of Red Yeasts to Waste Animal Fat Substrate. Microorganisms, 2019, vol. 7, no. 11, pp. 578. DOI: 10.3390/microorganisms7110578
65. Zhao X., Hu C., Wu S., Shen H., Zhao Z. Lipid production by Rhodosporidium toruloides Y4 using different substrate feeding strategies. Journal of industrial microbiology and biotechnology, 2011, vol. 38, no. 5. pp. 627-632. DOI: 10.1007/s10295-010-0808-4
66. Li Y., Zhao Z. Kent, Bai F., High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture. Enzyme and Microbial Technology, 2007, vol. 41, pp. 312-317. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2007.02.008
67. Chervyakova O.P. Obtaining microbial biomass enriched with carotenoids. Uspekhi v khimii i khimicheskoi tekhnologii [Advances in chemistry and chemical technology]. 2010, vol. 24, no. 11(116), pp. 51-53. (In Russian)
68. Simpson K.O., Nakayama T.S., Chichester S.O. Biosynthesis of yeast carotenoids. Journal of Bacteriology. 1964, vol. 88, no. 6, pp. 1688-1694.
69. Demidenko G.A., Shuranov V.V. Evaluation of feed toxicity using Paramecium caudatum ciliates. Vestnik Krasnoyarskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Bulletin of the Krasnoyarsk State Agrarian University]. 2015, vol. 10, pp. 5-11. (In Russian)
70. Seregina O.B., Leonidov N.B. Protozoa as an alternative biological test object in pharmacy. Farmatsiya [Pharmacy]. 2003, vol. 4, pp. 43-45. (In Russian)
КРИТЕРИИ АВТОРСТВА
Валентина В. Колпакова спланировала научную работу, обработала и проанализировала данные, написала рукопись. Рузалия В. Уланова получила экспериментальные данные, написала рукопись. Дмитрий С. Куликов получил экспериментальные
AUTHOR CONTRIBUTIONS
Valentina V. Kolpakova planned, processed and analysed the material and participated in writing the manuscript. Ruzaliya V. Ulanova obtained experimental and participated in writing the manuscript. Denis S. Kulikov obtained experimental data, designed the tables, graphic material
данные, оформил таблицы, графический материал, литературу. Валентина А. Гулакова провела опыты и получила результаты. Лина В. Васильева описала методики выращивания штамма, оформила результаты. Юлия Ю. Берестовская, Елена Г. Черемных, Александр А. Ашихмин получили экспериментальные данные. Все авторы в равной степени несут ответственность при обнаружении плагиата, самоплагиата или других неэтических проблем.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
and sourced literature. Valentina A. Gulakova conducted experiments and obtained results. Lina V. Vasilyeva described methods for growing the strain and undertook presentation of the results. Yulia Yu. Berestovskaya, Elena G. Cheremnykh and Alexander A. Ashikhmin obtained experimental data. All authors are equally responsible for plagiarism, self-plagiarism or other ethical transgressions.
NO CONFLICT OF INTEREST DECLARATION
The authors declare no conflict of interest.
ORCID
Валентина В. Колпакова / Valentina V. Kolpakova https://orcid.org/0000-0002-7288-8569 Рузалия В. Уланова / Ruzaliya V. Ulanova https://orcid.org/0000-0002-6315-721 Денис С. Куликов / Denis S. Kulikov https://orcid.org/0000-0003-2171-0522 Валентина А. Гулакова / Valentina A. Gulakova https://orcid.org/0000-0001-8393-9256 Лина В. Васильева / Lina V. Vasilyeva https://orcid.org/0000-0002-9811-9602 Юлия Ю. Берестовская / Yulia Yu. Berestovskaya https://orcid.org/0000-0002-6185-820X Елена Г. Черемных / Elena G. Cheremnykh https://orcid.org/0000-0001-5166-4462 Александр А. Ашихмин / Alexander A. Ashikhmin https://orcid.org/0000-0001-6978-8017
