Научная статья на тему 'ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДОМИНАНТНЫХ МУЛЬТИЛОКУСНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО'

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДОМИНАНТНЫХ МУЛЬТИЛОКУСНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
34
8
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ЛЕН МАСЛИЧНЫЙ / ПОЛИМОРФИЗМ / ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ / ДНК-МАРКЕР

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Вакула Светлана Ивановна, Анисимова Наталья Владимировна, Титок Владимир Владимирович, Кильчевский Александр Владимирович, Хотылева Любовь Владимировна

Для оценки общего генетического разнообразия и генетических связей сортов коллекции льна масличного использованы две системы доминантных мультилокусных ДНК-маркеров - RAPD и ISSR. Более высокий уровень выявляемого полиморфизма, индекс информативности и эффективное число аллелей отмечен для RAPD-ПЦР и ISSR-маркеров к тринуклеотидным повторам генома. Обе маркерные системы генерируют кластерные дендрограммы сходной топологии, но с определенными отличиями - при построении максимально согласованного субдерева (MAST) RAPD и ISSR межсортовые дистанции совпали для 44% образцов коллекции льна.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Вакула Светлана Ивановна, Анисимова Наталья Владимировна, Титок Владимир Владимирович, Кильчевский Александр Владимирович, Хотылева Любовь Владимировна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE USE OF DOMINANT MULTILOCUS MARKERS FOR ASSESSMENT OF FLAXSEED GENETIC DIVERSITY

RAPD and ISSR, two dominant multilocus marker systems, were compared in terms of their informativeness and efficiency in the study of genetic diversity and relationships among 25 flaxseed genotypes. RAPD-PCR and 3-nucleotide motifs ISSR exhibited a higher level of polymorphism, an index of informative value and an effective number of alleles. Both marker systems generated cluster dendrograms of similar topologies but with certain differences - under the most consistent sub-tree (MAST) construction, intervarietal distances coincided only for 11 genotypes of flax.

Текст научной работы на тему «ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДОМИНАНТНЫХ МУЛЬТИЛОКУСНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛЬНА МАСЛИЧНОГО»

УДК 633.854.54:631.527

С.И. Вакула1, Н.В. Анисимова1, В.В. Титок2, А.В. Кильчевский1, Л.В. Хотылева1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДОМИНАНТНЫХ МУЛЬТИЛОКУСНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

ЛЬНА МАСЛИЧНОГО

'Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 ^Центральный ботанический сад НАН Беларуси Республика Беларусь, 220012, г. Минск, ул. Сурганова, 2в

Введение

ДНК-маркеры революционизировали весь процесс генетических и селекционных исследований, впервые появилась возможность оценки популяции по большому количеству локусов, составления генетических карт, контролируемого отбора наиболее ценных особей. Диапазон доступных генетических маркеров очень широк (изоферменты, RFLPs, RAPDs, AFLPs, SNPs, SSR и т.д.) [1]. Полезность или необходимость каждой из маркерных систем в значительной степени зависит от доступных генетических ресурсов вида и имеет тенденцию изменяться по мере развития методов ДНК-анализа.

Первые этапы почти столетней истории генетических исследований льна культурного связаны с оценкой характера наследования признаков венчика, пыльников, и цвета семени [2, 3, 4]. В последующем пионерские работы Flor по устойчивости льна к возбудителю ржавчины Melanospora lini заложили фундамент современной науки о фитоимму-нитете [5], Comstock предложил первую генетическую карту сцепления льна [6]. Развитие молекулярно-генетических методов позволило идентифицировать и клонировать некоторые гены, в частности, связанные с биосинтезом жирных кислот [7]. В настоящее время интенсивно развиваются молекулярные подходы к изучению генетики льна - проведены секвени-рование, сборка и аннотация генома [8], опубликована первая консенсусная генетическая карта [9], ряд работ посвящен поиску QTL и ассоциативному картированию хозяйственно-ценных признаков [7, 10]. В общедоступных базах данных депонировано 286 899 ESTs, 10 970 секвенированных последовательностей ДНК и РНК, 80 339 концевых последователь-

ностей BAC клонов льна культурного [12]. Особое место занимает оценка генетического разнообразия культуры и использование полученной информации для разработки стратегии его сохранения и рационального использования.

Двадцать пять генотипов, представленных в нашей коллекции льна масличного, составляют только 4,33*10"4 часть от 53 000 образцов льна, депонированных в мировых банках генетических ресурсов [13]. Оценка разнообразия, сконцентрированного в таком небольшом наборе сортов, требует применения эффективных маркерных систем с высоким уровнем разрешающей способности и информативности, легко дискриминирующих уникальные генотипы.

Цель исследования - оценка генетического разнообразия коллекции сортов льна масличного с использованием двух маркерных систем - RAPD-ПЦР и ISSR-ПЦР. Обе системы представлены мультилокусными, доминантными маркерами с неизвестной локализацией в геноме [14], оценку их эффективности проводили с учетом трех аспектов: а) общая эффективность выявления полиморфизма; б) дискриминационная способность, то есть эффективность различения двух генотипов в изучаемом наборе сортов; в) способность маркерной системы прогнозировать генетические связи и сходство изучаемых образцов.

Материалы и методы

Растительный материал исследований -25 генотипов льна масличного различного эколого-генетического происхождения: Antares, Mivast, Atalante (Франция); Blue Chip (Венгрия); Glenelg (Австралия); Deep Pink (Нидерланды); Linota, SU-1-10, Omega, (США);

К 5827 (Уругвай); Gold Flax, McGregor, Somme, Л-6582, К-6570, Flanders (Канада); Raluca, Sandra (Чехия); Cyan (Польша); K-239S (Китай); Воронежский, К-5627, Небесный, ^Ф); ЛМ-1, ЛМ-2, (Беларусь).

Экстракцию и очистку ДНК проводили из навески 200 мг трех этиолированных проростков льна с использованием набора Genomic DNA Purification Kit #K0512 (Thermo Scientific, CŒA) согласно инструкции изготовителя. Для дополнительной очистки использовали про-теиназу К (из расчета 0,1 цг на 1 цл раствора для лизиса клеток), трихлорметан.

Pеакционная смесь П! IP объемом 15 мкл содержала: 50 мМ KCI; 20 мМ трис-HCI (pH 9,0); 2,5 мМ MgCI2; 0,25 мМ каждого dNTP; 0,01 нМ праймера; 1 ед. Taq-полимеразы, 10-15 нг ДНК для RAPD-^P и 50-100 нг для ISSR-ПЦР Нуклеотидные последовательности RAPD- и ISSR-праймеров представлены в табл. 1.

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе Professional Basic (Biometra, Германия) в следующем температурном режиме: R^D-^^: начальная денатурация -4 мин при 94 °C ; 40 циклов: 94 °C - 4 мин; 94 °C - 1 мин, 37 °C - 1 мин, 72 °C - 2 мин; терминальная элонгация - 4 мин 72 °C. ISSR-ПИр: начальная денатурация 4 мин при 94 °C; 35 циклов: 94 °C - 50 с, 48-56 °C - 50 с, 72 °C -1 мин 10 с; терминальная элонгация - 4 мин

72 °С. Оптимальные температуры отжига для ISSR-праймеров определяли по результатам проведения ПЦР в градиенте температур 4856 °С. Продукты амплификации разделяли в 1,8%-ном агарозном геле.

Эффективность генетических маркеров (RAPD, ISSR) для оценки и описания полиморфизма коллекции льна масличного оценивали по параметрам, предложенным в работах Powell et al. [15], Bootstein et al. [16], Morgante et al. [17], Tessier et al [18]. Сравнение средних значений проводили с использованием двустороннего ¿-критерия Стьюдента в программной среде Statistica 10.0 (StatSoft, США). На основании суммарной бинарной матрицы генетического анализа с помощью программного пакета DarWin 6.0 по алгоритму невзвешенного парно-группового среднего (UPGMA) были рассчитаны матрицы сходства генотипов в дистанциях Жаккарда и построены иерархические агломеративные дендрограммы. Функционалы качества иерархической кластеризации были рассчитаны автоматически с использованием программных пакетов Darwin 6.0 [19] и T-REX online [19]. Для оценки соответствия генетических связей, выявленных с использованием двух маркерных систем, были использованы процедуры MAST (Maximum agreement sub-tree) [20] и Quartet tree distance [21], реализованные в программном пакете Darwin 6.0.

Таблица 1

Олигонуклеотидные праймеры, использованные для анализа

№ Название Последовательность Температура, °C

1 ISSR 2 CAGCAGCAGCAGCAG 56,0

2 ISSR 4а GAGAGAGAGAGAGAGAYC 47,0

3 ISSR 5 AGAGAGAGAGAGAGAGG 50,9

4 ISSR 6 GAGAGAGAGAGAGAGAT 53,4

5 ISSR Sa GTGTGTGTGTGTGTGTYC 52,2

б ISSR 11 AGAGAGAGAGAGAGAGC 50,0

7 ISSR 12 ACACACACACACACACC 51,0

S ISSR1S AGCAGCAGCAGCAGCAGCC 47,0

9 ISSR 9 CTCCTCCTCCTCCTCCTC 55,0

10 ISSR 9a CTCCTCCTCCTCCTCCTCA 50,2

11 ISSR 22 ACACACACACACACACAA 54,5

12 ISSR 24 ACACACACACACACACTC 52,3

14 OPAH 13 TGAGTCCGCA 37

15 OPAF 16 TCCCGGTGAG 37

Продолжение табл. 1

№ Название Последовательность Температура, °С

16 OPW 19 CAAAGCGCTC 37

17 ОРАН 14 TGTGGCCGAA 37

18 ССРВ 270 GGTCGATCTG 37

19 UBC 194 AGGACGTGCC 37

20 OPA 12 TCGGCGATAG 37

21 OPB 01 GTTTCGCTCC 37

Для описания уровня информативности каждого доминантного маркера использовали следующие статистические показатели:

Электрофоретическая подвижность (ЭП), количество полиморфных локусов (Np), количество мономорфных локусов (N ), количество спектров маркера (Tp).

Общее число локусов (L) вычисляли по формуле:

L = N + N ;

p np'

Фракция полиморфных локусов (в): в = Np / L [15];

Фиксированные рецессивные локусы (V): V = n0/N [22];

Индекс информативности (PIC):

PIC = 1 - ГпрД

где pi - частота i-того ампликона, n - число локусов [16];

Маркерный индекс (MI):

MI = в х PIC [15];

Разрешающая способность (R ):

R = 21ъ> Ib = 1 - (2 х |0,5 - p|) [15];

Эффективное количество аллелей (ne): n = 1/2p.2 [17];

Вероятность неопределенности (С): с = р, (№ - 1) / N - 1),

где р1 - частота 1-того спектра, N - число генотипов [18];

Дискриминационная способность (р.):

D¡ = 1 - С [18];

Дискриминационной предел (DL)

DL = 11т (П) = 1 - Ер,2;

Эффективное количество спектров (Р):

Р = 1/(1 - DL);

Для описания маркерной системы использовался показатель среднее количество паттернов (I), а также нижеследующие, вычисляемые по формулам:

Общее число эффективных аллелей (№е):

N = 2пе [23];

Эффективное мультиплексное отношение (Е):

Е = ЬД

где - сумма локусов [15]; Эффективный индекс (А,): А. = N /и,

где и - число праймеров [23].

Результаты и обсуждение

С использованием двух маркерных систем получено 218 ампликонов (94 и 124 для RAPD- и ISSR-ПЦР, соответственно), из которых полиморфны 120 (53 и 67 для RAPD-и ISSR-ПЦР, соответственно). В зависимости от праймера, ПЦР обеспечивала синтез от 5 (ISSR 9а) до 18 (Шс 194) фрагментов в диапазоне электрофоретической подвижности

120-1700 bp. Высокая доля полиморфных локусов отмечена для праймеров: ISSR 2 (93,8%), Opaf 16 (81,82%), ISSR 18 (80,0%), Opb 01 (66,67%), ISSR 22 (63,64%), Opw 19 (63,64%), ISSR 9а (60,0%). Основные статистические показатели эффективности прай-меров в описании полиморфизма рабочей коллекции льна масличного представлены в табл. 2.

Таблица 2

Параметры генетической изменчивости, выявляемые с использованием RAPD-и ISSR-праймеров при анализе рабочей коллекции льна масличного

Праймер ЭП L N p N iip ß V r PIC R p n e T p С. j D j DL

Ubc 194 200-1600 18 8 10 0,44 0,26 0,12 3,21 1,20 15 0,06 0,94 0,91

Ccpb 270 200-1200 12 7 5 0,58 0,46 0,18 3,07 1,30 16 0,08 0,92 0,89

Opa 12 250-1300 11 5 6 0,45 0,25 0,16 2,64 1,27 11 0,10 0,90 0,87

Opaf 16 300-1110 11 9 2 0,82 0,36 0,33 5,50 1,58 27 0,00 1,00 0,96

Opah 14 120-1050 12 7 5 0,58 0,29 0,15 2,29 1,22 9 0,22 0,78 0,75

Opb 01 150-670 9 6 3 0,67 0,35 0,19 2,36 1,31 10 0,15 0,85 0,82

Opw 13 350-950 10 4 6 0,40 0,34 0,09 1,14 1,13 7 0,37 0,63 0,66

Opw 19 200-1550 11 7 4 0,64 0,18 0,16 2,21 1,23 12 0,18 0,82 0,79

ISSR 2 350-1050 15 14 1 0,93 0,47 0,22 4,14 1,34 14 0,16 0,84 0,81

ISSR 4a 250-1100 16 8 8 0,50 0,27 0,16 3,14 1,26 14 0,06 0,94 0,90

ISSR 5 300-670 8 2 6 0,25 0,19 0,07 1,00 1,13 3 0,45 0,55 0,53

ISSR 11 390-650 8 3 5 0,38 0,17 0,11 1,29 1,18 6 0,22 0,78 0,67

ISSR 12 450-1270 8 4 4 0,50 0,25 0,15 1,71 1,25 7 0,28 0,72 0,69

ISSR 6 200-1000 10 5 5 0,50 0,18 0,11 1,43 1,16 8 0,60 0,40 0,39

ISSR 8a 450-1050 7 2 5 0,29 0,24 0,06 0,57 1,10 3 0,55 0,45 0,44

ISSR 9 550-1600 7 1 6 0,14 0,05 0,06 0,64 1,11 2 0,42 0,58 0,56

ISSR 9a 950-1500 5 3 2 0,60 0,29 0,14 1,07 1,24 3 0,13 0,87 0,81

ISSR 18 350-1100 15 12 3 0,80 0,46 0,23 4,50 1,36 13 0,32 0,68 0,66

ISSR 22 400-1200 11 7 4 0,64 0,45 0,11 1,57 1,16 8 0,10 0,90 0,87

ISSR 24 450-1700 14 6 8 0,43 0,33 0,13 2,79 1,22 11 0,31 0,69 0,75

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Число эффективных аллелей на праймер (пе) отражает уровень ожидаемой гетерозиготности популяции и достигает максимума при равной частоте встречаемости всех аллельных вариантов. Для доминантных маркеров пе принимает значения от единицы до двух, но при анализе нашей коллекции показан значительно более узкий диапазон разброса значений пе - 1,10-1,58 (ISSR 8а, ОРАР 16, соответственно), что свидетельствует о сравнительно невысоком уровне ожидаемой гетерозиготности сортов коллекции. Показатель п достоверно коррелирует (г=0,5) с количеством

фиксированных рецессивных локусов (V), частота которых не превышала 0,46 для RAPD- и 0,47 для ISSR-маркеров, и в среднем составила 0,30, что указывает на сравнительно высокое генетическое разнообразие, представленное в рабочей коллекции. Для генотипов частота фиксированных рецессивных аллелей варьировала от 0,25 (Cyan) до 0,37 (K-6570), что ниже результатов, полученных при анализе выборок генофонда канадского [24] и американского льна [25] (51,2% и 45,3%, соответственно), а также 17 сортов льна-долгунца белорусской селекции (40,4%) [26].

Общее число эффективных аллелей Ne было использовано для расчета общего эффективного индекса (А), характеризующего информативность маркерной системы в описании исследуемого генофонда. Эффективный индекс составил 1,28 для RAPD-ПЦР, 1,21 - для ISSR-ПЦР, 1,24 -в среднем для двух маркерных систем, таким образом, информативность использованных систем ДНК-анализа составляет 64,0; 60,5 и 62,0% (от максимального А = 2), соответственно.

Для доминантных маркеров информационный индекс (PIC) принимает значения от 0 до 0,5. Высокое значение PIC показано для RAPD-праймера Opaf 16 (0,36), ISSR-праймеров, амплифицирующих последовательности, расположенные между тринуклеотидными повторами генома - ISSR 2 (PIC = 0,22) , ISSR 18 (PIC = 0,23). Низкоинформативны для описания рабочей коллекции льна маркеры ISSR 9 и ISSR 8a (PIC = 0,06 для обоих праймеров).

Оценка разрешающей способности праймера (Rp) позволяет идентифицировать праймеры, наиболее эффективно различающие генотипы. Среднее значение Rp использованных нами маркеров составило 2,31, высокий эффект в разделение генотипов вносят высокополиморфные праймеры Opaf 16, ISSR 18, ISSR 2. Показатели Rp достоверно коррелируют со статистикой, описывающей информативность праймеров - PIC (г = 0,9).

Количество уникальных ДНК-спектров для каждого праймера (Tp) варьировало от 2 (ISSR 9) до 27 (Opaf 16), средний показатель по коллекции - 7,67 спектров/праймер. Теоретически, в наборе из N генотипов можно выделить Nx(N - 1)/2 пар ДНК-паттернов. Исходя из соотношения Tp/L, высокое разнообразие спектров характерно практически для всех использованных в анализе RAPD-праймеров. Небольшое количество высокочастотных спектров может свидетельствовать о попадании сайтов связывания праймеров в участки ДНК, подвергавшиеся давлению очищающего отбора,

например 9 ампликонов праймера ISSR 9 организованы всего в два паттерна, представленных в коллекции в соотношении 19:9.

Вероятность неопределенности (С) и противоположный ей показатель дискриминационной способности (D) отражают вероятность наличия у двух генотипов идентичных паттернов и эффективность дискриминации генотипов на основании данных спектров амплификации. По двадцати праймерам С составила 0-0,55, с минимумом для праймеров Opaf 16, Ubc 194, ISSR 4a, Ccpb 270, эти же маркеры характеризуются высокой дискриминационной способностью относительно исследованных генотипов льна. Высока вероятность неопределенности (Cj > 0,5) для праймеров ISSR 9 и ISSR 8a.

Для генерируемых праймером различных ДНК-паттернов предложен расширенный показатель PIC - предел дискриминационной способности (DL). Высокой спектральной информативностью (DL > 0,9) характеризуются праймеры Ccpb 270, ISSR 4a, Ubc 194, Opaf 16, наименее показательны паттерны, генерируемые праймерами ISSR 6 и ISSR 8a.

Сравнение параметров RAPD- и ISSR-анализа в отношении выявления полиморфизма и дифференциации генотипов льна рабочей коллекции представлено в табл. 3. В целом, по сравнению с ISSR-, RAPD-маркеры амплифицируют больше фрагментов, с более высоким уровнем выявляемого полиморфизма и характеризуются более широкой зоной электрофоретической подвижности, кроме того, более высоким уровнем информативности и разрешающей способности, однако, согласно ¿-критерию, выявленные различия средних статистически незначимы (при а<0,05). Средние значения спектральных характеристик маркерных систем T Cj, Dj и DL, различаются достоверно, таким образом, в отношении исследуемой коллекции льна масличного RAPD-ПЦР характеризуется значимо более высокой дискриминационной способностью.

Таблица 3

Эффективность маркерных систем RAPD и ISSR в оценке полиморфизма рабочей

коллекции льна масличного

Параметр RAPD-ISSR RAPD ISSR t (RAPD-ISSR)

L 11,04 11,75 10,33 0,91

N p 6,11 6,63 5,58 0,68

Продолжение табл. 3

Параметр RAPD и ISSR RAPD ISSR t (RAPD и ISSR)

N m 4,94 5,13 4,75 0,37

EMR 0,54 0,57 0,50 0,86

V г 0,30 0,31 0,28 0,60

PIC 0,15 0,17 0,13 1,56

R в 0,21 0,24 0,18 1,37

N e 1,25 1,28 1,21 1,45

T в 10,53 13,38 7,67 2,39*

C ■ 0,22 0,14 0,30 -2,37*

D 0,78 0,86 0,70 2,37*

DL 0,75 0,83 0,67 2,44*

В работах Powell et al. [15] показатель, характеризующий фракцию и количество полиморфных локусов на анализ, носит название эффективного мультиплексного отношения (EMR). EMR - это показатель эффективности выявления ДНК-полиморфизма маркерной системой. Применительно к рабочей коллекции льна масличного и общего набора 20 доминантных маркеров (RAPD+ISSR) значение EMR составило 5,74, для набора RAPD-праймеров этот показатель выше - 6,74, для ISSR - только 5,13. По сравнению с использованным набором ISSR-праймеров, проведенный RAPD-анализ более эффективен в дифференциации генотипов льна, что подтверждают значения маркерных индексов систем (MI = 0,74 и MI = 0,99, ISSR и RAPD, соответственно).

Результаты RAPD- и ISSR-типирования

коллекции сортов льна масличного сведены в бинарную матрицу и проанализированы по алгоритму иерархического кластерного анализа UPGMA с использованием дистанций Жаккарда. На основе межсортовых дистанций построены дендрограммы кластеризации (рис. 1, 2), рассчитаны погрешности анализа и функционалы качества объединения образцов (табл. 4).

Обе дендрограммы (RAPD, ISSR) характеризуются низкими показателями погрешностей кластеризации и высокими коэффициентами кофенетической корреляции, что характеризует высокое соответствие проведенного кластерного анализа UPGMA матрице межсортовых дистанций. При построении RAPD-дендрограммы получены максимальное и минимальное значения дистанций Жаккарда и сумма длины ветвей выше на 19,4; 5,7 и 26% соответствующих показателей ISSR-дерева.

Параметр RAPD ISSR

Минимальное значение матрицы дистанций 0,072 0,058

Максимальное значение матрицы дистанций 0,367 0,346

Сумма длины ветвей 2,389 1,888

Средняя погрешность 0,000 -0,001

Средняя абсолютная погрешность 0,025 0,023

Максимальная абсолютная погрешность 0,094 0,110

Квадрат средней абсолютной погрешности 0,001 0,001

Коэффициент кофенетической корреляции, гк 0,871 0,910

Таблица 4

Функционалы качества кластеризации генотипов льна

Рис. 1. Иерархическая дендрограмма кластеризации сортов льна масличного, полученная на основе

КАРБ-анализа

Рис. 2. Иерархическая дендрограмма кластеризации сортов льна масличного, полученная на основе

^Я-анализа

При соотнесении топологии RAPD- и ISSR-дендрограмм с географическим происхождением изучаемых сортов, в частности, показана высокая генетическая общность американских (SU-1-10, Linota), белорусских (ЛМ-1 и ЛМ-2), французских (Mivast и Atalante) сортов. Относительно невысокой межкластерной дисперсией характеризуются группы сортов селекции РФ, восточноевропейских стран, Канады. Оценка генетических связей, соответствующих таксономической дифференциации исследуемого генофонда льна масличного показала, что в структуре ISSR-дендрограммы сорта, относящиеся к подвидам лен-кудряш и лен-межеумок, образуют отдельные субкластеры, а представители подвидов лен-крупносемянный (Mivast) и солин (Gold Flax)

формируют отдельную группу. Полиморфизм RAPD-спектров в выявлении таксономической принадлежности сортов менее показателен.

Различия между двумя деревьями генетической классификации измеряли в «дистанциях квартетов» (quartet distance QDist), отражающих количество подмножеств из четырех объектов, топология связи между которыми в двух дендрограммах различна. Сравнение полученного значения QDist с распределением критических значений, полученных при сравнении выборки стохастических независимых дендро-грамм, показало, что для двух дендрограмм, состоящих из 25 объектов, QDist = 0,51 соответствует 1% вероятности случайного характера связи между полученными кластерными решениями. Таким образом, использование

маркерных систем RAPD и ISSR для прогнозирования генетических связей между сортами льна показало высокую степень сходимости полученных результатов.

Изоморфность двух дендрограмм можно оценить, выделив в их структуре участок, характеризующийся максимально совпадающей топологией - MAST (Maximum agreement sub-tree). «Максимально согласованное субдерево» - MAST также может быть рассмотрено в качестве графической интерпретации уровня сходства дендрограмм (максимальное значение - общее число анализируемых образцов, минимальное - 3, так как топология любых двух дендрограмм совпадает в трех точках). Результирующее дерево MAST (рис. 3) содержит 11 точек совпадения топологии RAPD- и ISSR-дендрограмм, что относительно общего количества анализируемых сортов составляет 44%.

Заключение

Для исследования генетического разнообразия льна культурного использованы две системы мультилокусных доминантных маркеров - RAPD и ISSR. Показано, что, по сравнению с двенадцатью ISSR-маркерами, набор из восьми RAPD-праймеров более эффективен в выявлении полиморфизма коллекции льна масличного (A. = 1,28, EMR = 6,74 - для RAPD-ПЦР, A. = 1,21, EMR = 5,74 - для ISSR-ПЦР) и дифференциации генотипов льна (MI = 0,74 и MI = 0,99, ISSR и RAPD, соответственно). RAPD-праймеры амплифицируют боль-

шее количество локусов, с более высокими значениями параметров, описывающих выявляемый полиморфизм (PIC, RP, ne и др.), однако, согласно двустороннему ¿-критерию, выявленные различия средних статистически незначимы. Характеристики ДНК-спектров, генерируемых RAPD-праймерами - количество спектров на праймер (Tp), вероятность неопределенности (С), разрешающая способность (Dp, предел дискриминационной способности (DL) - значимо выше средних показателей для ISSR-спектров. Высокой эффективностью в выявлении полиморфизма дифференциации генотипов льна характеризуются ISSR-праймеры к тринуклеотидным микросателлитным повторам (ISSR 2 PIC = 0,22, ISSR 18 PIC = 0,23), что, вероятно, связано с высокой распространенностью тринукле-отидных мотивов в геноме льна. По данным Cloutier et al. [27], в геноме льна тандемные последовательности трех нуклеотидов составляют 54,6 и 68,7% от общего количества проанализированных BES-SSRs и EST-SSRs, соответственно. Повторы из двух нуклеотидов распространены реже (30,6 и 16,8% от BES-SSRs и EST-SSRs, соответственно), однако относительно более полиморфны.

UPGMA дендрограммы результатов RAPD-и ISSR-типирования хорошо соответствуют матрицам дистанций Жаккарда между генотипами льна (rk = 0,87 и rk=0,91, соответственно). Согласно полученным данным (QDist = 0,51), маркерные системы RAPD и ISSR характеризуются высоким сходством прогнозируемых

г

Г

.il

Г!

iL

Somme

Л-6582

ЛМ-2

—Небесный

Cyan

Raluca

Mivast

Воронежский Flanders

Blue Chip Antares

Рис. 3. MAST для дендрограмм, построенных на основе RAPD- и ISSR-анализов

генетических связей между сортами льна и низкой степенью расхождения топологии полученных кластерных деревьев, результирующее дерево MAST содержит 11 точек совпадения структуры RAPD- и ISSR-дендрограмм.

Таким образом, обе маркерные системы характеризуются высокой эффективностью выявления генетического разнообразия льна масличного, более выраженной в случае RAPD-ПЦР, высокая дискриминационная способность которой в отношении генотипов льна обусловлена уникальностью генерируемых ДНК-спектров. Генетические связи образцов льна, выявленные с использованием RAPD-и ISSR-маркеров, характеризуются высоким уровнем топологического сходства.

Список использованных источников

1. Cullis, C.A. Flax / C.A. Cullis // Genome mapping and molecular breeding in plants: Oilseeds; ed. K. Chittaranjan - Heidelberg: Springer-Verlag, 2007. - Vol. 2 - P. 275-295.

2. Tammes, T. The genetics of the genus Linum / T. Tammes // Bibliographica Genetica. -1928. - No. 4. - P. 1-36.

3. Shaw, F.J.K. Studies in Indian oilseeds. V The inheritance of characters in Indian linseed / F.J.K. Shaw, A.R. Khan, M. Alam / Ind. J. Ag-ric. Sci. - 1931. - Vol. 1. - P. 1-57.

4. McGregor, W.G. Inheritance of quality and quantity of oil in flax in relation to other paint characters / W.G. McGregor // Can. J. Res. C. -1937. - No. 15. - P. 362-379.

5. Flor, H.H. The complementary genic systems in flax and flax rust / H.H. Flor // Adv. Gen. - 1956. - Vol. 8. - P. 29-54.

6. Comstock, V.E. Association among seed and agronomic characteristics in isogenic lines of flax / V.E. Comstock, J.H. Ford, B.H. Beard // Crop Sci. - 1963. - Vol. 3. - P. 171-172.

7. SSR-based linkage map of flax (Linum usitatissimum L.) and mapping of QTLs underlying fatty acid composition traits / S. Cloutier [et al.] // Mol. Breed. - 2011. - Vol. 28. -P. 437-451.

8. The genome of flax (Linum usitatissi-mum L.) assembled de novo from short shotgun sequence reads / Z. Wang [et al.]. // Plant J. -2012. - Vol. 72, No. 3. - P. 461-473.

9. Integrated consensus genetic and physical maps of flax (Linum usitatissimum L.) / S. Cloutier

// Theor. Appl. Genet. - 2012. - Vol. 125, No. 8. -P. 1783-1795.

10. Association mapping of seed quality traits using the Canadian flax (Linum usitatissimum L.) core collection / B.J. Soto-Cerda // Theor. Appl. Genet. - 2014. - Vol. 127, No. 4. - P. 881-896.

11. National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

12. Diederichsen, A. Cultivated flax and the genus Linum L. Taxonomy and germplasm conservation / A. Diederichsen, K. Richards // Flax The genus Linum; ed. A.D. Muir, N.D. Westcott. -London: Taylor & Francis Ltd, 2003. - P. 23-33.

13. Хлесткина, Е.К. Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и в селекции / Е.К. Хлесткина // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2013. - Т. 17, № 4/2. -С.1044-1054.

14. Perrier, X. Data analysis methods / X. Per-rier, A. Flori, F. Bonnot // Genetic diversity of cultivated tropical plants; ed.: P. Hamon, et al. -Science Publishers, 2003. - P. 43-76.

15. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis / W. Powell [et al.] // Mol. Breed. -1996. - Vol. 2. - P. 225-238.

16. Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorphisms / D. Bootstein [et al.]. // Am. J. Hum. Genet. - 1980. - Vol. 32. - P. 314-331.

17. Genetic mapping and variability of seven soybean sample sequence repeat loci / M. Mor-gante [et al.]. // Genome. - 1994. - Vol. 37. -P. 763-769.

18. Optimization of the choice of molecular markers for varietal identification in Vitis vinif-era L. / C. Tessier [et al.]. // Theor. Appl. Genet. - 1999. - Vol. 98. - P. 171-177.

19. T-REX: a web server for inferring, validating and visualizing phylogenetic trees and networks / A. Boc [et al.]. // Nucleic Acids Research. - 2012. - Vol. 40 (W1). - P. W573-W579.

20. Finden, C.R. Obtaining common pruned trees / C.R. Finden, A.D. Gordon // Journal of Classification. - 1985. - № 2. - P. 255-276.

21. Computing the quartet distance between evolutionary trees / D. Bryant [et al.] // Proceedings of the Eleventh Annual ACM-SIAM Symposium on Discrete Algorithms. - N.Y.: ACM Press, 2000. - P. 285-286.

22. RAPD analysis of 54 North American flax cultivars / Y.-B. Fu [et al.] // Crop Science. -2003. - Vol. 43. - P. 1510-1515.

23. Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs and AFLPs / I. Pejic [et al.]. // Theor. Appl. Genet. - 1998. - Vol. 97. - P. 12481255.

24. RAPD Analysis of 54 North American Flax Cultivars / Y.-B. Fu [et al.]. // Crop Sci. -2003. - Vol. 43, No. 4. - P. 1510-1115.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

25. Fu, Y.-B. Effectiveness of bulking procedures in measuring population-pairwise simi-

larity with dominant and codominant genetic markers / Y.-B. Fu // Theor. Appl. Genetic. -2000. - Vol. 100, No. 8. - P. 1284-1289.

26. Лемеш, В.А. Молекулярные маркеры в изучении генетических ресурсов/ В.А. Лемеш // Молекулярная и прикладная генетика: сб. научн. тр. - 2008. - Т. 12, № 4. - C. 94-104.

27. Simple sequence repeat marker development from bacterial artificial chromosome end sequences and expressed sequence tags of flax (Linum usitatissimum L.) / S. Cloutier [et al.] // Theor Appl Genet. - 2012. - Vol. 125, № 4. -P. 685-694.

Дата поступления статьи 10 августа 2015 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.