CC BY
6УДК 577.21:631.527:633.367
Е.Н. Сысолятин, Н.В. Анисимова, О.Г. Бабак, А.В. Кильчевский
ОЦЕНКА эФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДА SRäp-RGA-ПЦР ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ узколистного люпина
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси 220072, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: E.Sysoliatin@igс.by, N.Anisimova@igc.by, Kilchev@presidium.bas-net.by
Проведено сравнительное изучение ДНК-полиморфизма образцов люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.) с помощью методов SRAP-RGA и ISSR. Выявлены преимущества метода SRAP-RGA в сравнении с известными методиками ISSR-анализа. Проведена оценка эффективности применения различных комбинаций праймеров для определения генетического полиморфизма. Выделены наиболее информативные пары праймеров (tm/me8, p-loop/r14, p-loop/em12, p-loop/f12) с высокими значениями маркерного индекса MI.
Ключевые слова: люпин, маркер, метод SRAP-RGA.
Введение
Люпин узколистный (Lupinus angustifoli-ыа L.) - ценная для Беларуси зернобобовая культура, богатый источник высококачественного растительного кормового и пищевого белка, сбалансированного по аминокислотному составу 40% сухого вещества составляют незаменимые аминокислоты). Узколистный люпин удобен в возделывании, поскольку адаптирован к дефициту азота и фосфора, кислым, песчаным почвам. Способность к симбиотической фиксации азота определяет его сидеральные свойства, делая люпин полезным предшественником при ротации со злаковыми и другими сельскохозяйственными культурами, что способствует повышению эффективности растениеводства.
Однако распространение люпина в нашем регионе во многом лимитировано потерями урожая из-за воздействия патогенов, что является серьезной проблемой. Потери урожая люпина от болезней нередко составляют 2575%, иногда достигая полной гибели посевов. Успешное возделывание люпина невозможно без разработки и применения определенных мер защиты растений от многочисленных болезней и вредителей. Агротехнические и химические приемы иногда или недостаточно эффективны, или экономически непригодны. Одним из наиболее эффективных и экологи-
чески безопасных способов защиты люпина от болезней и вредителей, обеспечивающим интенсификацию этой области растениеводства, является создание устойчивых к болезням сортов.
Разработка и применение молекулярно-генетических методов для создания сортов позволяют ускорить процесс улучшения люпина. В современной селекции для паспортизации сортов используются различные методики маркирования хозяйственно ценных признаков. Для паспортизации люпина применяются методики с использованием белковых маркеров [1], а также ДНК-маркеров: ISSR и RAPD [2]. Однако эти методы имеют некоторые ограничения. Так, белковые маркеры не подходят для анализа культур, имеющих низкий уровень внутривидового полиморфизма, а RAPD-праймеры (по причине низкой температуры отжига) и ISSR-праймеры к двух-трехнуклеотидным повторам [3] показывают низкий уровень воспроизводимости полученных результатов.
Свою эффективность при разработке молекулярных маркеров устойчивости к биотическим факторам показали методики RGA-ПЦР (resistance gene analogs). R-гены растений содержат в своем составе консервативные последовательности, соответствующие структурным мотивам защитных R-белков. Эти последовательности, в силу
своей постоянной структуры, используются в качестве мишеней для вырожденных праймеров, с помощью которых можно осуществлять поиск возможных генов устойчивости у различных видов растений. RGA-праймеры были использованы для выделения аналогов генов устойчивости у ряда видов растений [4, 5, 6], в том числе желтого [7] и узколистного [8] люпина.
Разрешающая способность методов анализа с помощью вырожденных праймеров повышается в комбинации с методом SRAP (sequence-related amplified polymorphism), который основывается на амплификации открытых рамок считывания [9]. При этом применяются 2 праймера длиной 17 или 18 нуклеотидов, состоящие из нескольких элементов. Один из этих элементов -основная последовательность длиной от 13 до 14 оснований, где первые 10 или 11 оснований, начиная с 5'-конца, представляет собой последовательность неспецифического состава («последовательность-заполнитель»), за которой следует последовательность CCGG в прямом и AATT в обратном прай-мере. Праймеры с участками CCGG предпочтительно садятся в пределах открытых рамок считывания из-за наличия GC-повторов преимущественно в кодирующих областях. Последовательность AATT обратного прай-мера чаще встречается в областях промоторов и интронов, которые более подвержены изменениям в ДНК [10]. За основной последовательностью на З'-конце следуют три селективных нуклеотида, которые обеспечивают специфичность реакции амплификации. Поскольку SRAP-праймеры имеют высокую температуру отжига (50 °С и выше) и не содержат в своем составе многочисленных повторяющихся элементов, этот метод характеризуются большей воспроизводимостью результатов, чем методики ISSR и RAPD. Так как при данном методе предпочтительно амплифицируются открытые рамки считывания, обнаруженный с его помощью ДНК-полиморфизм имеет большую вероятность быть связанным с фенотипическим проявлением признаков.
N. Mutlu et al. [11] показали высокую эффективность выявления полиморфизма с помощью различных комбинаций RGA- и SRAP-
праймеров по сравнению с чистыми методами RGA и SRAP. Учитывая низкую специфичность используемых праймеров, данные методы могут быть применены на различных культурах для поиска полиморфизма и создания маркеров генов, определяющих устойчивость растений к заболеваниям.
Цель нашей работы - установление возможности использования SRAP-RGA-анализа для исследования полиморфизма аналогов генов устойчивости у люпина узколистного, проведение сравнительного исследования эффективности методов SRAP-RGA-анализа и ISSR-анализа для дифференциации генотипов.
Материалы и методы
В нашем исследовании были использованы образцы L. angustifolius из коллекции Белорусского государственного университета. Для работы отобраны 12 образцов люпина узколистного различного генетического и эколого-географического происхождения: Yorrel, Wonga, Tanjil, Fest, Illyarrie, (Австралия); Брянский 1121, Немчиновский 846, Брянский 1272 (Россия); Миртан, Першацвет, Ашчадны (Беларусь); Frost (США).
Выделение ДНК из генеративных и вегетативных органов осуществляли с помощью набора «Нуклеосорб» (ОДО «Праймтех») комплектации С. В качестве источника ДНК использовали молодые верхушечные листья растений. Растительную ткань предварительно гомогенизировали путем растирания с жидким азотом или встряхивания с металлическими бусами. Выделение ДНК проводили в трех биологических повторностях.
Концентрацию полученного раствора ДНК определяли методом спектрофотометрии на приборе NanoDrop 2000.
Для изучения образцов люпина узколистного использовали праймеры к трансмембранному (TM) домену (5' -ARNGCTARNGGNARNCC-3') и p-loop домену (5' -GGNGGNGTNGGNAANACNAC-3') R-генов устойчивости к заболеваниям [4]. Каждый из этих праймеров был использован в различных комбинациях с 7 SRAP-праймерами при постановке реакций амплификации, что в итоге дало 14 комбинаций SRAP-RGA-праймеров. Список использованных SRAP-праймеров представлен в табл. 1.
Таблица 1
Список БЯАР-праймеров, использованных в работе
Название По следовательно сть 5'-3' Ссылка
Me8 tgagtccaaaccggact [11]
F12 cgaatcttagccggagc [12]
F16 gatccagttaccggcac [12]
Em12 GACTGCGTACGaattCTC [11]
Em5 GACTGCGTACGaattAAC [11]
r9 GACACCGTACGaattTGA [12]
r14 CGCACGTCCGTaattAAC [12]
Реакцию амплификации проводили в смеси объемом 20 мкл. Состав смеси был следующим: 1 ед. Taq-полимеразы ^аЫ), 1х ПЦР-буфер, 5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 500 пмоль/мкл БЯАР-праймера, 500 пмоль/ мкл ЯОА-праймера, 0,5 мкл тотальной геномной ДНК.
Амплификацию начинали плавлением ДНК при 94 °С в течение 5 мин, затем проводили 5 циклов: 94 °С - 1 мин, 38 °С - 1 мин, 72 °С -1 мин 15 с; а затем 35 циклов: 94 °С - 45 с, 50 °С - 1 мин, 72 °С - 1 мин 15 с; заключительную элонгацию осуществляли при 72 °С в течение 5 мин [11].
Для сравнения эффективности наряду с перечисленными 8ЯАР-ЯОА-маркерами были использованы наиболее пригодные для паспортизации различных сортов узколистного люпина КБЯ-маркеры ЦВС810, К2, КЗ [2].
^БЯ-типирование осуществляли в ПЦР-смеси объемом 20 мкл, которая содержала 2 ед. Taq-полимеразы ^аЫ), 1х ПЦР-буфер, 5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 50 пмоль праймера, 100 нг тотальной геномной ДНК.
Амплификацию начинали плавлением ДНК при 94°С в течение 5 мин, затем проводили 40 циклов: 94 °С - 45 с, 52 °С - 45 с, 72 °С -
1 мин 30 с. Финальную элонгацию проводили при 72 °С в течение 7 мин. Завершали реакцию охлаждением смеси до 16 °С.
Продукты амплификации разделяли в
2 %-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете.
Результаты реакции амплификации в виде воспроизводимых ДНК-профилей были
вручную зарегистрированы для всех образцов и занесены в бинарную матрицу, где 0 обозначал отсутствие бэнда, а 1 - наличие. Первоначальная оценка праймеров была осуществлена путем учета общего количества бэндов в профилях, а также количества полиморфных бэндов и их отношения к общему числу бэндов в профиле. Для оценки эффективности различных комбинаций праймеров были использованы такие параметры как мера информационного полиморфизма (рolymorphism information content, PIC), эффективное мультиплексное отношение (effective multiplex ratio, EMR), разрешающая способность (resolving power, Rp) и маркерный индекс (marker index, MI). Величину PIC рассчитывали по формуле для доминантных маркеров PIC. = 2f (1 - fi), где PIC. - мера информационного полиморфизма локуса i; f - частота, с которой встречался амплифицированный фрагмент; (1 - f) - частота, с которой встречалось отсутствие амплификации фрагмента [13, 14, 15]. Частота f представляет собой отношение количества образцов, у которых в локусе i амплифици-ровался фрагмент, к общему количеству изученных образцов.
Полученная бинарная матрица была использована для построения филогенетического дерева по методу невзвешенного попарного среднего (UPGMA) с помощью программы DARwin v. 6.0.13 [16]. Дендрограмму строили исходя из полученных данных эффективности SRAP-RGA-маркеров. Для определения достоверности построенного дерева был проведен бутстрап-анализ с выборкой из 1000 реплик.
Результаты и обсуждение
Первоначальная оценка результатов амплификации показала, что все 14 комбинаций SRAP-RGA-праймеров давали четко детектируемые продукты амплификации (рис. 1).
Количество фрагментов в полученных профилях варьировало от 4 (в комбинации p-loop/ me8) до 15 (в комбинациях tm/f12, p-loop/r14). Всего с помощью использованных комбинаций праймеров был получен 121 продукт амплификации, длина которых находилась в диапазоне 100-1700 п.н. Из общего числа полученных фрагментов 35 (28,9%) были полиморфными у различных образцов люпина, использованных нами в исследовании. В двух комбинациях праймеров (tm/em5 и tm/r14) полиморфных фрагментов обнаружено не было. Процент полиморфных фрагментов в зависимости от комбинации праймеров варьировал в диапазоне от 10% (tm/r9) до 50% (p-loop/em12).
При определении показателя PIC для каждой комбинации вычисляли среднее значение PIC по всем локусам данной пары праймеров. Наименьшее значение PIC показывали комбинации праймеров tm/r9 и p-loop/me8 (0,15). Наибольшую меру информационного полиморфизма показала пара tm/f16 (0,44). Приемлемые для дальнейшей работы значения PIC были характерны для пар прай-меров tm/Em12 (0,42), p-loop/f16 (0,38), p-loop/r9 (0,33), p-loop/f12 (0,31), tm/f12 (0,28), p-loop/em5 (0,27), p-loop/em12 (0,27), p-loop/r14 (0,25).
Величина эффективного мультиплексного отношения (EMR) зависит от доли полиморфных фрагментов. Наибольшее значение этого показателя наблюдалось у пар праймеров p-loop/r14 (3,27) и tm/me8 (2,08). Наименьшую эффективность показали пары праймеров tm/ f16 (0,11) и tm/r9 (0,10).
Показатель разрешающей способности (Rp) используют для отражения способности прай-
Основные показатели эффективности маркеров,
Рис. 1. SRAP-RGA-профили разных сортов люпина, комбинация праймеров p-loop/r14
мера устанавливать различия между генотипами. Среди комбинаций SRAP-RGA наибольшая разрешающая способность была характерна для праймеров p-loop/r14 (2,17), тогда как наименьшая - для tm/r9 и p-loop/me8 (0,17).
Маркерный индекс (MI) представляет собой произведение величины информационного полиморфизма (PIC) и эффективного мультиплексного отношения (EMR) [13] и используется для определения общей полезности различных праймеров при генотипи-ровании. Наилучшие результаты по этому показателю показали праймеры p-loop/r14 (0,81). Низкие значения маркерного индекса были характерны для праймеров tm/f16 (0,05), tm/r9 (0,02) и p-loop/me8 (0,04). Вычисленные показатели по всем комбинациям SRAP-RGA и по ISSR-маркерам представлены в табл. 2.
Таблица 2
ычисленные для каждой комбинации праймеров
Комбинация праймеров n n p % n p PIC Rp EMR MI
tm/me8 12 5 41,67 0,24 1,50 2,08 0,49
tm/f12 15 3 20,00 0,28 1,00 0,60 0,17
tm/f16 9 1 11,11 0,44 0,67 0,11 0,05
tm/Em12 14 3 21,43 0,42 2,00 0,64 0,27
Продолжение табл. 2
Комбинация праймеров n n p % n p PIC Rp EMR MI
tm/r9 10 1 10,00 0,15 0,17 0,10 0,02
p-loop/me8 4 1 25,00 0,15 0,17 0,25 0,04
p-loop/f12 7 3 42,86 0,31 1,17 1,29 0,40
p-loop/f16 7 2 28,57 0,38 1,00 0,57 0,21
p-loop/em5 13 4 30,77 0,27 1,50 1,23 0,33
p-loop/em12 6 3 50,00 0,27 1,00 1,50 0,40
p-loop/r9 9 2 22,22 0,33 1,17 0,44 0,15
p-loop/r14 15 7 46,67 0,25 2,17 3,27 0,81
UBC810 13 9 69,23 0,29 3,33 6,23 1,79
IS2 14 3 21,43 0,15 0,5 0,64 0,10
IS3 17 5 29,41 0,26 1,67 1,47 0,38
Примечание. n - общее количество бэндов, n - количество полиморфных бэндов, % n - процент полиморфных бэндов, PIC - мера информационного полиморфизма, Rp - разрешающая способность, EMR - эффективное мультиплексное отношение, MI - маркерный индекс.
У праймеров tm/f16 при близком к максимально возможному для доминантных маркеров (0,5) [13] значении PIC (0,44), были низкие показатели разрешающей способности (0,67), эффективного мультиплексного отношения (0,11) и один из самых низких маркерных индексов (0,05). Такая высокая мера информационного полиморфизма объясняется тем, что распределение частот встречаемости единственного фрагмента этого маркера близка к 70% (обнаружен у 8 образцов из 12). Поскольку в случае доминантных маркеров паттерном считается и наличие и отсутствие фрагмента, соотношение аллелей будет близким к 30:70 (P1 = 0,3; Р2 = 0,7), а это соответствует высокому PIC [13].
Исходя из полученных показателей, наибольшую эффективность выявления полиморфизма в подобранной нами коллекции образцов показали SRAP-RGA-праймеры p-loop/ r14 с одним из самых высоких показателей разрешающей способности и маркерного индекса (MI), несмотря на то, что показатель PIC у этой пары праймеров был относительно невысоким (0,25). Также сравнительно высокий маркерный индекс показывали комбинации праймеров tm/me8, p-loop/f12, p-loop/em12.
ISSR-праймеры на подобранной нами коллекции образцов имели низкие или умеренные значения PIC в диапазоне от 0,15 (у IS2) до 0,29 (у UBC810). Праймер UBC810 показал высо-
кие значение EMR (6,23) и маркерного индекса (1,79), что обусловлено большим количеством локусов ISSR-маркеров. Показатели остальных ISSR-праймеров были примерно на уровне или ниже значений SRAP-RGA-маркеров.
Дендрограмма, построенная по методу UPGMA на основании бинарной матрицы результатов SRAP-RGA-анализа, представлена на рис. 2.
В результате анализа с помощью SRAP-RGA-праймеров для каждого из изученных образцов люпина удалось получить уникальный набор полиморфных фрагментов. Для полной дифференциации всех образцов было достаточно трех комбинаций SRAP-RGA (p-loop/r14, tm/me8, p-loop/f12). В то же время результаты анализа образцов узколистного люпина с помощью 3-х отобранных ISSR-праймеров не позволили дифференцировать образцы Illyarrie и Fest. На построенной на основании SRAP-RGA-анализа дендро-грамме в обособленные кластеры при уровне бутстрап поддержки >50 выделились группы сортов Немчиновский 846, Першацвет, Fest; Брянский 1272, Миртан, Frost; Ашчадны, Брянский 1121, что свидетельствует об их генетическом сходстве. В структуре дендро-граммы кластеры выделились не по географическому признаку. Причиной этому может быть активный обмен селекционным материалом при создании сортов.
—66—
23
-81-
-с
•Немчиновский 846
Першацвет
«Fest
41
-Wonga
-Tanjil
-Ашчадны
34
г-Ашчар
22
Брянский 1121
- Yorrel
-illyarrie
64
—66—
•Брянский 1272 -.Миртан
Frost
0-
0.1
Рис. 2. Дендрограмма образцов узколистного люпина построенная по методу UPGMA на основании данных SRAP-RGA-анализа с помощью комбинаций прай-меров с наибольшим маркерным индексом tm/me8, p-loop/r14, p-loop/em12, p-loop/f12
Заключение
В работе проведено исследование полиморфизма аналогов генов устойчивости у образцов люпина узколистного (Lupinus angustifolius L.). Дана оценка эффективности применения 14 различных комбинаций RGA-и SRAP-праймеров для генотипирования узколистного люпина. В 12 из 14 комбинаций SRAP-RGA-праймеров были обнаружены полиморфные фрагменты. Значение PIC варьировало в диапазоне от 0,15 до 0,44. По результатам вычисления маркерного индекса наибольшую пригодность для типирования подобранных образцов узколистного люпина показали пары праймеров p-loop/r14 (MI = 0,81) и tm/me8 (MI = 0,49), которые планируется использовать в дальнейшей работе по разработке маркеров к интересующим генам.
Показано преимущество метода SRAP-RGA для выявления ДНК-полиморфизма узколистного люпина, связанное с более высоким значением показателя меры информационного полиморфизма (PIC), чем у ISSR-маркеров. С применением SRAP-RGA-анализа для каждого образца удалось получить уникальный набор полиморфных фрагментов, что позволило полностью их дифференцировать. Анализ, проведенный с помощью ISSR-праймеров, не показал различий между образцами Illyarrie и Fest. Таким
образом, методом SRAP-RGA удалось выявить полиморфизм, который не выявлялся методом ISSR-ПЦР.
На построенной дендрограмме в кластеры выделились 3 группы сортов: Немчиновский 846, Першацвет, Fest; Брянский 1272, Миртан, Frost; Ашчадны, Брянский 1121, что свидетельствует об их генетическом сходстве.
Уровень полиморфизма, который показали SRAP-RGA-праймеры, позволяет проводить работу по генотипированию сортов узколистного люпина. В ходе дальнейших исследований для поиска молекулярных маркеров R-генов планируется сопоставить выявленный полиморфизм с фенотипическим проявлением устойчивости узколистного люпина к грибным болезням.
Cписок использованных источников
1. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян: методические указания / под ред. В.Г. Конарева. - СПб, 2000. - 186 с.
2. Артюхова, А.В. Паспортизация сортов люпина методами ISSR-PCR и RAPD-PCR для биотехнологических исследований: авто-реф. дис. ... канд. биол. наук: 03.01.06, 03.02.07 / А.В. Артюхова; Брянский гос. ун-т им. акад. И Г. Петровского. - Уфа, 2011. - 22 с.
3. Prince, L. ISSR Genotyping of Endangered Plants Using an Optimized Workflow/ L. Prince // Application Note ISSR Plant Genotyping. [Electronic resource]. - Mode of access: http:// tool s.thermofi sher.com/content/sfs/brochures/ cms_077418.pdf?CID=fl-WE18818. - Date of access: 15.08.2015.
4. Kanazin, V. Resistance gene analogs are conserved and clustered in soybean. / V. Kanazin, L.F. Marek, R.C. Shoemaker // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1996. - N 93. - P. 746-750.
5. Barely disease resistance gene analogs of the NBS-LRR class: identifiaction and mapping. / L.H. Madsen [et al.] // Molecular Genetics and Genomics. - 2003. - N 269. - P. 150-161.
6. A PCR-based approach for isolating pathogen resistance genes from potato with potential for wide application in plants. / D. Leister [et al.] // Nature Genetics. - 1996. -N 14. - P. 421-429.
7. Li, D. The Ncm-1 gene for resistance to Cucumber mosaic virus in yellow lupin
(Lupinus luteus): molecular studies and marker development. PhD thesis / D. Li; Murdoch University. - 2012. - 201 p.
8. A PCR-based molecular marker applicable for marker-assisted selection for anthracnose disease resistance in lupin breeding / M. You [et al.] // Cell Mol Biol Lett. - 2005. - Vol. 10. N 1. - P. 123-134 / Erratum in: Cell Mol Biol Lett. - 2005. - Vol. 10. - N 2. - P. 363.
9. Li, G. Sequence-related amplifed polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica / G. Li, C.F. Quiros // Theor Appl Genet. - 2001. - N 103. - P. 455-461.
10. Snowdon, R. Oilseed rape / R. Snowdon, W. Lühs, W. Friedt // Genome mapping and molecular breeding in plants. - Vol. 2: Oilseeds / C. Kole, (ed.). - Springer, Berlin Heidelberg, 2007. - P. 55-114.
11. Development of SRAP, SRAP-RGA, RAPD and SCAR markers linked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant / N. Mutlu [et al.] // Theor Appl Genet. - 2008. -Vol. 117. - N 8. - P. 1303-1312.
12. Genetic diversity of wild Medicago sativa by sequence-related amplified polymorphism markers in Xingjiang region, China / J.-X. Ma [et al.] // Pak. J. Bot. - 2013. - N 45. - P. 20432050.
13. Чесноков, Ю.В. Оценка меры информационного полиморфизма генетического разнообразия / Ю.В. Чесноков, А.М. Артемьева // Сельхозбиология. - 2015. - № 5. -С.571-578.
14. AFLP Markers Reveal High Polymorphic Rates in Ryegrasses (Lolium Spp.) / R. Roldan [et al.] // Molecular Breeding. - 2000. -Vol. 6. N 2. - P. 125-134.
15. Seyit, A.K. Comparison of effectiveness of ISSR and RAPD markers in genetic characterization of seized marijuana (Cannabis sativa L.) in Turkey / A.K. Seyit, E.H. Erdogan, P. Emine // African Journal of Agricultural Research. - 2010. - Vol. 5. N 21. - P. 2925-2933.
16. Perrier, X. DARwin software / X. Perrier, J.P. Jacquemoud-Collet / [Electronic resource]. -2006. - Mode of access: http://darwin.cirad.fr/ -Date of access: 15.08.2015.
E.N. Sysoliatin, N.V. Anisimova, o.G. Babak, A.V. Kilchevsky
estimation of srap-rga pcr method effectiveness for genotyping narrow-leaved lupin
Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus Minsk BY-220072, Republic of Belarus
Comparative study of blue lupine (Lupinus angustifolius L.) samples was conducted with SRAP-RGA and ISSR methods. The advantages of SRAP-RGA method in comparison with known techniques were shown. Various combinations of primers were tested for effectiveness of genetic polymorphism detection. The most informative primer pairs (TM/ME8, p-loop/r14, p-loop/em12, p-loop/f12) with high marker index MI were selected.
Key words: lupin, marker, SRAP-RGA method.
Дата поступления статьи 30 сентября 2016 г.
