CC BY
119
I I I I I I
[Hein
Искусственный гаметогенез: дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в гаметы
Т.В. Лопатина
С развитием методов выделения, культивирования и направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] человека перед учёными и врачами открылись заманчивые перспективы заместительной клеточной трансплантации для лечения многих дегенеративных заболеваний. Уже получено большое количество многообещающих результатов, касающихся дифференцировки ЭСК в различные типы тканей. Наиболее интересным и перспективным направлением этих работ является получение половых клеток из ЭСК. Эти работы могут дать возможность не только исследовать биологические процессы в гаметах и гаметогенез, но и стать одним из способов лечения бесплодия и инструментом для искусственного поддержания ЭСК в будущем. Историю выделения половых клеток из ЭСК можно считать новейшей, поскольку она насчитывает чуть более пяти лет. Известно, что в эмбриональном развитии ЭСК дают начало половым клеткам в процессе гаметогенеза. Несколько исследовательских групп попытались получить гаметоподобные клетки из ЭСК in vitro.
Основываясь на успешных экспериментах по дифферен-цировке ЭСК во многие типы клеток и тканей, Hans Scholer с коллегами в Max Planck Institute of Molecular Medicine [Германия] и University of Pennsylvania [США] решил проверить,
нет ли среди множества стволовых клеток на разных стадиях дифференцировки тех, которые могут быть предшественниками гамет. Ученые ввели ген зеленого флюоресцирующего белка в стволовые клетки мыши таким образом, что он начинал синтезироваться только в половых клетках. Через несколько дней культивирования некоторые группы клеток стали спонтанно синтезировать зеленый белок и маркерные белки, специфичные для половых клеток. Еще через некоторое время эти клетки морфологически стали походить на овогонии. Клетки выжили в культуре несколько месяцев и, что более удивительно, начали выделять половые гормоны [эстрадиол]. Они определили экспрессию специфических генов, необходимых для синтеза эстрадиола, в мелких клетках, составляющих основу агрегата, положительного по зелёному белку. В 2003 году Karin Hubner из группы Scholer опубликовала статью в Science [1], в которой описала превращение эмбриональных стволовых клеток мыши в овоцитоподобные клетки. Интересно, что Hubner использовала протокол культивирования в среде без каких-либо специфических факторов роста или питающих клеток, тем самым показав возможность спонтанного гаметогенеза из ЭСК. Среди отобранных по экспрессии маркерного зеленого белка клеток стали появляться те, которые экспрессируют Vasa-специфический
I I I I I I
[Ж^ШП
белок постмиграционных герминальных клеток, то есть тех эмбриональных клеток, которые вступили на путь диффе-ренцировки в гаметы и локализовались обособленно [2].
На 26-й день культивирования овоцитоподобные клетки отделялись от окружавших их клеток и свободно плавали в среде. Они были покрыты прозрачной оболочкой, напоминавшей zona pellucida. Большинство этих клеток были 50-70 микрометров в диаметре, что сравнимо с размерами настоящих овоцитов [3]. Также они экспрессировали маркерные белки овоцитов: ZP1, ZP2, ZP3, Fig-alpha, GDF-9 [4-8], и белки, специфичные для мейоза: DMC1, SCP3/COR1 [9], SCP/SYN1 [10]. Добавление в среду гонадотропина приводило к формированию структуры, по морфологии напоминающей полярное тельце, что говорит о том, что «овоцит» может пройти первую фазу мейоза. На 43-й день культивирования эти «овоциты» образовывали группы клеток, которые по экспрессируемым генам и морфологии соответствовали пре-димплантационным эмбрионам. Они развивались до стадии морулы. Ученые посчитали эти формирования партенотами -эмбрионами, полученными от активированной, но неопло-дотворенной яйцеклетки.
В то же время была опубликована работа по получению мужских половых клеток из ЭСК [11 ]. Toyooka Y. с коллегами показали, что герминальные стволовые клетки, выделенные из эмбриональных телец, при пересадке в яичко мышей, способны дифференцироваться в таком микроокружении в «морфологически зрелые» сперматозоиды. Для этих клеток была подтверждена способность успешно передавать свой геном в бластоцисту при инъекции в овоцит.
Недавно Julang Li, исследователь из University of Guelph [Канады], сообщила, что вместе с коллегами они превратили стволовые клетки, выделенные из эмбриональной кожи свиньи, в клетки, сильно напоминающие овоциты. Эксперимент Li был направлен на то, чтобы из нескольких миллионов стволовых клеток кожи 40-50-дневного зародыша свиньи можно получить гамето-подобные клетки под действием раствора, состав которого автор не описывает. Около трети агрегатов, формирующихся в культуре стволовых клеток, имели большую клетку в центре. Эти агрегаты были перенесены в среду, содержащую гонадотропин, гормон, стимулирующий образование овоцитов. Li отказалась назвать все ингредиенты этой среды, так как эти данные еще не опубликованы и не запатентованы. В 10% агрегатов сформировались очень крупные клетки, 80-100 мкм в диаметре. По форме и морфологии они очень напоминали овоциты. Также эти клетки экспрессировали около 6 генетических маркеров овоцитов. Li также сообщила, что некоторые из этих крупных клеток спонтанно формировали партеноты [12].
Исследователь из Австралии Orly Lacham-Kaplan описал способ получения гамет из предшественников, которые, якобы, спонтанно образуются из ЭСК. Эти предшественники половых клеток [embryonic germ cells, EGCs] образуют «бессмертную» колонию клеток, способных многократно делиться, не теряя своей плюрипотентности [13]. В качестве индуктора дифференцировки Kaplan использовал среду, кондиционированную активно делящимися тестикулярными клетками новорожденных мышей. Эти клетки являются источником множества цитокиновых факторов [BMP-4, SCF, LIF, FGF, GDF-9 и других], способных стимулировать диффе-ренцировку и поддерживать плюрипотентность стволовых клеток [14]. Ссылаясь на статью Karin Hubner [1], авторы не смогли повторить эксперимент с получением овоцитов, фолликула и прохождением мейоза без стимулирующих факторов. Ключевым моментом в процессе дифференцировки половых клеток in vitro Lacham-Kaplan считает получение из
эмбриональных телец предшественников этих клеток, которые образуются под влиянием неизученных, представленных в микроколичествах в эмбриональных тельцах, но необходимых факторов. Все это говорит о том, что в экспериментах искусственно воссоздаются условия для развития половых клеток, но эта технология еще до конца не изучена.
Еще один интересный и значительный результат получила группа ученых во главе с George Q. Daley из Harvard Stem Cell Institute [15]. Эксперимент Daley был основан на выделении герминальных клеток, позитивных по маркёру SSEA-1, из эмбриональных телец. Эти клетки при культивировании в среде с ретиноевой кислотой [которая стимулирует деление герминальных клеток] и ростовыми факторами давали начало самообновляемой герминальной клеточной линии [см. рис.]. Клетки линии экспрессировали «половые» маркёры [Dazl, Piwil2, Rnf17, Tdrd1 и др.]. Кроме того, у них активировались импринтируемые гены, что тоже является признаком развития половых клеток. Если же эмбриональные тельца культивировали продолжительное время, то получали более зрелые круглые клетки, напоминающие сперматиды. Их выделяли при помощи антител на акросомы [FE-J1]. Эта популяция в основном состоит из гаплоидных клеток, которые могут успешно оплодотворять овоцит и индуцировать эмбриогенез до стадии бластоцисты. Различными методами было показано участие искусственного сперматозоида в оплодотворении и взаимодействие его генома с геномом яйцеклетки. Но перенос в матку этих искусственных эмбрионов не проводили, поэтому оценить их функциональную полноценность нельзя [15].
Несмотря на многие нерешенные вопросы, технология получения половых клеток в пробирке имеет большие перспективы. Эта технология даст не только огромные возможности для изучения половых клеток, но также позволит ученым проводить перенос соматического ядра, не используя донорские овоциты, а также получать после этого клетки с аутогенными митохондриями. Более отдалённая перспектива - получение постоянно самовозобновляемого источника ЭСК. Клинические перспективы использования технологии связаны с возможностью решения проблемы бесплодия, хотя еще никто не смог успешно провести оплодотворение искусственно полученными гаметами. Giuseppe Testa в своем обзоре о возможностях практического применения искусственных половых клеток [16] упомянул даже возможность иметь детей в гомосексуальных парах.
Осмысливая перспективы и возможности этой технологии, нельзя забывать о проблемах, возникающих по мере ее развития. В первую очередь, давно известно, что при культивировании клеток в геноме накапливаются мутации и меняется импринтинг, что приводит к серьезным нарушениям развития как ткани, так и организма в целом. Поэтому для использования искусственных гамет одного факта их получения недостаточно, необходимо еще и доказать их нормальное функционирование. Более серьезные проблемы могут быть связаны с применением этих гамет в экстракорпоральном оплодотворении, так как следует учитывать причины бесплодия, возможные генетические болезни пациентов. Ведь в процессе нормального оплодотворения происходит сложный и строгий отбор половых клеток, исключающий все клетки с какими-либо дефектами. Но в тоже время, изучение механизмов индукции дифференцировки половых клеток, бесспорно, имеет огромное значение для современной медицины и биологии в целом. Сейчас это одно из самых новых и перспективных направлений в биологии, и именно поэтому оно порождает множество надежд, споров и новых вопросов.
■■■ ■ I I I I I I I 4- I ■ ■ игл
ЛИТЕРАТУРА:
1. Hubner K., Fuhrmann G., Christenson L.K. et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 2003; 300[5623]: 1251-6.
2. Toyooka Y. Tsunekawa N., Takahashi Y. et al. Expression and intracellular localization of mouse Vasa-homologue protein during germ cell development. Mech. Dev. 2000; 93[1 -2]: 139-49.
3. Eppig J.J., O'Brien M.J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol. Reprod. 1996; 54[1 ]: 197-207.
4. Dong J., Albertini D.F., Nishimori K. et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature 1996; 383[6600]: 531-5.
5. East I.J., Mattison D.R., Dean J. Monoclonal antibodies to the major protein of the murine zona pellucida: effects on fertilization and early development. Dev. Biol. 1984; 104[1 ]: 49-56.
6. Liang L., Soyal S.M., Dean J. FIGalpha, a germ cell specific transcription factor involved in the coordinate expression of the zona pellucida genes. Dev. 1997; 124[24]: 4939-47.
7. Matzuk M.M. Revelations of ovarian follicle biology from gene knockout mice. Mol. Cell Endocrinol. 2000; 163[1 -2]: 61 -6.
8. Soyal S.M., Amleh A., Dean J. FIGalpha, a germ cell-specific transcription factor required for ovarian follicle formation. Dev. 2000; 127[21 ]: 4645-54.
9. Tarsounas M., Pearlman R.E., Moens P.B. Meiotic activation of rat pachytene spermatocytes with okadaic acid: the behaviour of synaptonemal complex components SYN1/SCP1 and COR1/SCP3. J. Cell Sci. 1999; 112[Pt 4): 423-34.
10. Rankin T., Talbot P., Lee E., Dean J. Abnormal zonae pellucidae in mice lacking ZP1 result in early embryonic loss. Dev. 1999; 126[17): 3847-55.
11. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100[20): 11457-62.
12. Vogel, G. Stem cells. Scientists chase after immortality in a petri dish. Science 2005. 309(5743): 1982-3.
13. Lacham-Kaplan O., Chy H., Trounson A.. Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem [ES) cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 2005; 24[2): 266-73.
14. Creemers L.B., den Ouden K., van Pelt A.M., de Rooij D.G. Maintenance of adult mouse type A spermatogonia in vitro: influence of serum and growth factors and comparison with prepubertal spermatogonial cell culture. Reproduction 2002; 124[6): 791-9.
15. Geijsen N., Horoschak M., Kim K. et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature 2004; 427[6970): 148-54.
16. Testa G., Harris J. Ethics and synthetic gametes. Bioethics 2005; 19[2): 146-66.
А
