CC BY
125
УДК 579.25 579.262
Иванова Е.С., Гуменко Р.С., Баймиев Ан.Х.
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
E-mail: iv.katerina-bio@yandex.ru
ИСКУССТВЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ НИТРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА РИЗОБИАЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
Исследована возможность создания штаммов клубеньковых бактерий с искусственно измененной регуляцией генов ниторогеназного комплекса. Получен рекомбинантный штамм Rhizobium leguminosarum 1078 с конститутивной экспрессией гена nifA, у которого в свободноживущем состоянии наблюдается нитрогеназная активность. Показана возможность индукции нитроге-назного комплекса ризобии при совместном культивировании их с рекомбинантной бактерией Е35 Enterobacter sp. с конститутивной экспрессией гена nifA.
Ключевые слова: ризобии, нитрогеназа, nifA, рекомбинантные бактерии, конститутивная экспрессия, нитрогеназная активность.
Введение
Известно, что способностью фиксировать атмосферный азот обладают только прокарио-тические организмы благодаря наличию у них особого фермента нитрогеназы, восстанавливающего молекулярный азот до аммония. Синтез и регуляцию нитрогеназы осуществляет комплекс nif-генов (от англ. nitrogen fixation) [1]. Такие микробы могут быть как свободноживущи-ми азотфиксаторами, способные расти на безазотных субстратах, используя только молекулярный азот атмосферы (Klebsiella, Azotobacter), так и симбиотически связанными с растениями. К последним относятся клубеньковые бактерии (ризобии), вступающие в высокоэффективный симбиоз с бобовыми растениями [2].
Изучение генов азотфиксации у свободно-живущих и симбиотических азотфиксаторов позволило установить сходства и различия в их структурно-функциональной организации. На сегодняшний день у ризобий найдено только 11 из 25 генов, выявленных в nif-регулоне Klebsiella, общими из которых являются гены, кодирующие структуру белков (nifHDK), а также регуляцию синтеза и созревания нитрогеназы (nifS, nifQ, nifW). Как у тех, так и у других транскрипция rnf-генов активируется продуктом гена nifA [2], [3]. Но в отличие от ризобий у несимбиотических азотфиксаторов запуск синтеза нитрогеназы происходит в ответ на потребность бактерии в азоте и ингибируется в присутствии молекулярного кислорода или связанного азота специальным белком NifL, который отсутствует у клубеньковых бактерий [4]. В то время как у симбиотических азотфиксаторов за «включение» и «выключение» rnf-генов отве-
чает растение-хозяин [5]. Поэтому большинство из них, в том числе и быстрорастущие ризобии (Rhizobium, Sinorhizobium), вступающие в симбиоз с основными представителями бобовых умеренного климата, в свободноживущем состоянии не способны фиксировать азот. Исключением является только род Azorhizobium, способный расти на безазотной среде [6].
Интересным является тот факт, что за активацию всей системы азотфиксации как у свобод-ноживущих, так и у симбиотических азотфикса-торов отвечает продукт всего лишь одного гена nifA. Это дает возможность искусственно изменять его регуляцию и, по сути, изменять азотфик-сирующий статус микроорганизма. На свободно-живущих азотфиксаторах такие работы были проведены еще в начале 80-х годов, и было показано значительное повышение азотфиксирующей активности у рекомбинантных бактерий, в геном которых был введен конститутивноэкспрессиру-ющийся ген nifA [7], [8], [9], [10], [11]. В случае же ризобий, у которых регуляция экспрессии sym-ге-нов осуществляется не только внешними факторами, но и растением-хозяином, искусственное изменение регуляции гена nifA, придаст им способность фиксировать азот ex planta, что существенно расширит границы применения клубеньковых бактерий в качестве биоудобрений.
Целью данной работы стало исследование возможности создания штаммов клубеньковых бактерий с искусственно измененной регуляцией генов нитрогеназного комплекса.
Материалы и методы
В работе были использованы штаммы клубеньковой бактерии 1078 Rhizobium leguminosarum,
выделенной из клубеньков гороха посевного (Pisum sativum), а также E35 Enterobacter sp. - ассоциативный симбионт гороха посевного. 1078 Rhizobium leguminosarum культивировали на среде YM при оптимальной температуре роста 28°С, E35 Enterobacter sp. выращивали на среде LB при температуре 37°С.
Получение векторной конструкции. С целью создания экспрессирующей плазмиды, несущей ген белка NifA, нами был амплифицирован и клонирован ген nifA 105 R. leguminosarum, который в последующем был вставлен в плазмиду pTurboGFP-B (Evrogen) под управление сильного конститутивного промотора фага Т5. Таким образом, была получена конститутивно экспресси-рующаяся векторная конструкция pTurboGFP-B nifA pBBRIori.
Получение рекомбинантных штаммов R. leguminosarum и Enterobacter sp. С целью создания рекомбинантных штаммов R. leguminosarum и Enterobacter sp. полученной конструкцией с помощью метода элетропорации трансформировали клетки 1078 R. leguminosarum и Е35 Enterobacter sp. Электропорацию проводили на приборе MicroPulser (BioRad, США) с использованием предустановленной программы и протокола для трансформации агробактерий в 0,1 см электропорационной кювете.
Проверка транскрипционной активности гена nifA в рекомбинантном штамме R. leguminosarum. Проверку транскрипционной активности гена nifA в рекомбинантном штамме 1078 R. leguminosarum осуществляли с помощью ОТ-ПЦР анализа; кДНК, комплементарную мРНК, получали при помощи фермента AMW-ревертазы (обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц). Для удаления ДНК из тотального препарата нуклеиновых кислот данный препарат обрабатывали ДНКа-зой свободной от РНКаз.
Определение нитрогеназной активности рекомбинантных штаммов. Определение нитрогеназной активности рекомбинантных бактерий проводили «ацетиленовым» методом, основанным на восстановлении ацетилена до этилена [12], [13]. Содержание ацетилена и этилена выявляли на газовом хроматографе Shimadzu Gas Chromatograph GC-2014 (Япония) с пламенным ионизационным детектором по времени выхода каждого газа. Объем вводимой газовой пробы 1 мл. Количе-
ство ацетилена и этилена рассчитывали по калибровочной кривой.
Результаты и обсуждение
У ризобий, как и у несимбиотических азот-фиксаторов, транскрипция структурных генов нитрогеназы активируется продуктом гена nifA. В этой связи появляется теоретическая возможность создания штаммов клубеньковых бактерий с измененной регуляцией данных генов. Бактерии R. leguminosarum в свободноживущем состоянии не способны фиксировать азот и азот-фиксирующая способность включается у них только в условиях симбиотического взаимодействия с бобовым растением в специализированных структурах, называемых клубеньками. Поскольку данные бактерии способны ассоциативно взаимодействовать с широким кругом также небобовых растений, то возможность им придания азотфиксирующей способности вне структуры клубеньков расширяет круг предполагаемых применений данных бактерий в качестве ростостимулирующих микроорганизмов.
В ходе исследования нами был получена векторная конструкция pTurboGFP-B nifA pBBRIori, содержащая ген nifA под регуляцией конститутивного промотора фага Т5 (рис. 1).
Для проверки функциональной активности полученной конструкции данная плазмида далее с помощью электропорации была трансформирована в штамм 1078 R.leguminosarum. Для того чтобы предварительно удостовериться в экспрессионной активности гена nifA в полученной конструкции, рекомбинантный штамм 1078 R.leguminosarum был подвергнут ОТ-ПЦР ана-
nifA
ColE1
Рисунок 1. Схематическое изображение вектора pTurboGFP-B nifA pBBRIori
Естественные науки
лизу. В ходе данного эксперимента была показана наработка мРНК гена nifA, что говорит о наличии транскрипционной активности этого гена в рекомбинантном штамме (рис. 2).
C целью выявления индукции нитрогеназ-ного комплекса у полученного рекомбинантно-го штамма 1078 R. leguminosarum «ацетиленовым» методом была определена его нитрогеназ-ная активность (3,1 мкг N/мл/ч). Хотя данный показатель близок к таковому у свободноживу-щих диазотрофов (3,5 мкг ^/мл/ч), главным результатом в данном опыте является сама возможность искусственной регуляции нитроге-назного комплекса у клубеньковых бактерий, что открывает большие перспективы для создания различных ростостимулирующих микробиологических препаратов на основе ризобий. Однако необходимо при этом понимать, что процесс фиксации атмосферного азота требует затраты большого количества энергии, и бактерии в естественных условиях с искусственно измененным азотфиксирующим статусом будут неконкурентоспособны. Данный факт также был отмечен в работе An с соавторами [14].
В связи с этим нами был проведен эксперимент по исследованию возможности разделения двух событий (конститутивной экспрессии гена nifA и процесса азотфиксации) на разных штаммах микроорганизмов. Для конститутивной экспрессии nifA был выбран штамм Е35 Enterobacter sp., который является ассоциативным симбионтом для многих видов растений и не содержит симбиотические гены. В дальнейшем в него была трансформирована созданная нами генно-инженерная конструкция pTurboGFP-B nifA pBBRIori. Полученный рекомбинантный штамм культивировали совместно с диким штаммом R. leguminosarum и в последующем для этой смеси также была определена нитрогеназная активность. Интересным оказался тот факт, что при совместном культивировании с рекомбинантным штаммом с конститутивной экспрессией гена nifA у R. leguminosarum дикого типа также наблюдается нитрогеназная активность (2,6 мкг ^/мл/ч), хотя и чуть меньшая, чем у рекомбинантной 1078 R. leguminosarum (3,1 мкг N/мл/ч) (рис. 3).
В данном случае механизм индукции нит-рогеназного комплекса является предметом для дальнейших исследований. Но тот факт, что запуск нитрогеназного комплекса клубеньковых бактерий может осуществляться за счет
наработки белка №£А в других бактериях, делает возможным создание бинарных препаратов биоудобрений, где каждый составляющий штамм данного препарата по отдельности не будет терять своих конкурентоспособных свойств. Данный механизм индукции также дает возможность получать различные комбинации микроорганизмов, а также мобилизиро-вать нитрогеназную активность аборигенных штаммов ризобий.
Заключение
Таким образом, показана возможность искусственной регуляции генов нитрогеназ-ного комплекса. Получен рекомбинантный
Рисунок 2. ОТ-ПЦР анализ транскрипционной активности гена nifA в клетках рекомбинантных бактерий. М - 100п.н. маркер; 1 - амплификация
тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинантных бактерий; 2 - ОТ-ПЦР анализ рекомбинантных бактерий; 3 - амплификация тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинантных бактерий после обработки ДНКазой
А. Рекомбинантный штамм R. leguminosarum; Б. Смесь бактерий рекомбинантного штамма Enterobacter sp. и R. leguminosarum дикого типа.
Рисунок 3. Хроматограммы анализа нитрогеназной активности бактерий
штамм Rhizobium leguminosarum 1078, у которого в свободноживущем состоянии наблюдается нитрогеназная активность. Также показана возможность индукции нитрогеназного
комплекса ризобий при совместном культивировании их с рекомбинантной бактерией Е35 Enterobacter sp. с конститутивной экспрессией гена nifA.
11.09.2014
Список литературы:
1. Halbleib C.M., Ludden P.W. Regulation of Biological Nitrogen Fixation // Journal of Nutrition. - 2000. - V. 130. - №5. - P. 1081-1084.
2. Тихонович И.А., Проворов Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та. - 2009. - 210 с.
3. Камински П., Батут Ж., Боистард П. Контроль симбиотической фиксации азота ризобиями. В кн.: Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Под ред. Г. Спайнка и др. СПб.: Бионт. - 2002. - C. 465-492.
4. Klipp W., Masepohl B., Gallon J.R. et al. Genetics and Regulation of Nitrogen Fixation in Free-Living Bacteria. New York: Kluwer academic publishers. - 2004. 300 p.
5. Martinez M., Palacios J.M., ImperialJ. et al. Symbiotic Autoregulation of nifA Expression in Rhizobium leguminosarum bv. Viciae // Journal of bacteriology. - 2004. -V. 186. - №19. - P. 6586-6594.
6. Lee K-B, Backer P., Aono T. et al. The genome of the versatile nitrogen fixer Azorhizobium caulinodans ORS571 // BMC Genomics. - 2008. - V. 9. - P. 271-271.
7. Li J., Li Y., Jin H., Wang J. Regulation of nif gene expression in an associative diazotroph, Enterobacter gergoviae 57-7 // Acta Microbiol. - 1994. - V. 34. - P. 333-338.
8. Buchanan-Wollaston A. V., Cannon A. V., Beynon J. L., Cannon F.C. Role of the nifA gene product in the regulation of nif expression in Klebsiella pneumoniae // Nature. - 1981. - V. 294. - P. 776-778.
9. Kennedy C., Robson C. L. Activation of nif gene expression in Azotobacter by the nifA gene product of Klebsiella pneumoniae // Nature. - 1983. - V. 301. - P. 626-628.
10. Zhu J., Yu. G, Jiang Q. et al. Effect of nifA product on suppression of Nif- phenotype of gln mutation and constitutive synthesis of nitrogenase in Klebsiella pneumonia // Sci Sin. - 1983. - V. 26. - P. 1258-1268.
11. Uozumi T., Tonouchi N., Nam J. H. et al. Cloning and expression of the nifA gene of Klebsiella oxytoca in K. pneumoniae and Azospirillum lipoferum // Agric Biol Chem. - 1986. - V. 50. - P. 1539-1544.
12. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1986. - 136 с.
13. Минеев, В. Г. Практикум по агрохимии: учеб. пособие. - 2-е изд. перераб. и доп. / Под ред. академика РАСХН В. Г. Минеева. - М.: Изд-во МГУ. - 2001. - 689 с.
14. An Q., Dong Y., Wang W., Li Y., J. Li. Constitutive expression of the nifA gene activates associative nitrogenixation of Enterobacter gergoviae 57-7, an opportunistic endophytic diazotroph // Journal of Applied Microbiology. - 2007. - V. 103. -P. 613-620.
Сведения об авторах:
Иванова Екатерина Сергеевна, младший научный сотрудник Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, e-mail: iv.katerina-bio@yandex.ru
Гуменко Роман Сергеевич, аспирант лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук,
e-mail: о990@mail.ru
Баймиев Андрей Ханифович, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, доктор биологических наук, доцент,
e-mail: baymiev@anrb.ru
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71
