CC BY
21
УДК 577.156; 577.151.64
ИОНЫ МЕТАЛЛОВ - АКТИВАТОРЫ ФАКТОРА, ИНДУЦИРУЕМОГО ГИПОКСИЕЙ
А.И. Осипьянц1*, Н.А. Смирнова1, А.Ю. Христиченко1, С.В. Никулин1, А.А. Захарянц 3, В.И. Тишков2,3*, И.Г. Газарян12, А.А. Полозников1
(1ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; ЪООО «Инновации и высокие технологии МГУ»; *e-mail: osssip@gmail.com; vitishkov@gmail.com)
Исследована активация антигипоксической программы под действием ряда переходных и тяжелых металлов с помощью клеточных репортеров HIF1 ODD-luc и HRE-luc. Показано, что и Hg проявили себя как исключительно сла-
бые активаторы репортера HIF1 ODD-luc, что, вероятно, отражает их слабую конкуренцию за сайт связывания железа в активном центре HIF-пролилгидроксилазы. Активация под действием металлов, способных замещать железо (Mn2+, Zn2+, Cu2+ и наступает при очень высоких, субмиллимолярных концентрациях, что свидетельствует о плохой проницаемости клеточной мембраны для данных переходных металлов. Наибольшая активация наблюдается для Co2+ и Cd2+, но Cd2+ высокотоксичен даже при концентрациях выше 10 мкМ, в отличие от Co2+, активирующего в течение 24 ч оба репортера без признаков токсичности вплоть до концентрации 25 мкМ. Значительная активация Co2+ наблюдается уже в микромолярном диапазоне концентраций, которые можно рекомендовать для имитации гипоксии.
Ключевые слова: люцифераза, репортерный анализ, переходные металлы, тяжелые металлы, кобальт.
Список использованных в статье сокращений: HIF (hypoxia inducible factor) - фактор, индуцируемый гипоксией, HRE (hypoxia response element) - «элемент» гипоксического отклика, PHD - prolyl hydroxylase, pVHL (von Hippel-Lindau protein) - белок фон Хиппе-ля-Линдау.
Генетически запрограммированный отклик на гипоксию регулируется кислородзависимыми ферментами, к которым относятся и а-кетоглутарат-зависимые негеминовые диоксигеназы. В качестве субстратов этих ферментов выступают как белки (транскрипционные факторы и гистоны), так и ДНК [1]. К одним из наиболее популярных субстратов этой группы ферментов относится HIF, открытый в 1992 г. [2, 3]. HIF включает транскрипцию более 100 генов, действие которых направлено на выживание клетки в условиях нехватки кислорода. HIF состоит из двух субъединиц - а- и Р-. Стабильность первой из них регулируется гидрок-силированием остатка пролина 564, катализируемым HIF-пролилгидроксилазой (PHD) - ферментом, открытым в 2002 г., т. е. значительно позже, чем сам HIF [4]. Последовательность, содержащая гидроксилированный пролин, распознается белком фон Хиппеля-Линдау (pVHL), входящим в убиквитинлигазный комплекс, обеспечивающий убиквитинирование а-субъединицы, приводящее к ее последующей протеасомной деградации. Именно гидроксилирование пролина под действием HIF PHD можно считать основным механизмом
регуляции белковой стабильности HIF, причем эта ферментативная стадия лимитирует скорость всего многоступенчатого процесса деградации HIFa.
HIF PHD - металлозависимый фермент; атом железа координируется тремя аминокислотными остатками в активном центре HIF PHD, молекулой субстрата (a-кетоглутарата) и молекулой воды, как показано на рис. 1. Металлы, которые так же, как и железо, могут использовать в качестве координационных лигандов остатки гистидина и карбоксильные группы, должны проявлять себя как ингибиторы фермента HIF PHD. В ряде случаев именно с помощью координации других металлов, например марганца (5L9B.pdb или 4BQW.pdb) и никеля (4JZR.pdb), в активном центре рекомби-нантной HIF PHD были получены ее кристаллы и установлена кристаллическая структура.
Для ингибирования активности в физиологических условиях внутри клетки имеет значение не только способность иона металла замещать железо в активном центре фермента, но и его способность проникать через клеточную мембрану. В этой связи представляет интерес исследование ряда переходных и тяжелых металлов на способ-
Рис. 1. Каталитический центр ИГР-пролилгидроксилазы
ность стабилизировать и активировать ИГР, используя клеточные репортеры на основе люцифе-разы светляков.
В настоящее время существуют два типа репортеров.
1. Наиболее популярны и коммерчески доступны «промоторные» репортеры, которые представляют собой ген люциферазы под контролем промотора, активируемого определенным транскрипционным фактором за счет распознавания и взаимодействия со специфической последовательностью, в нашем случае с так называемым «элементом» гипоксического отклика (ИЯЕ). Такой репортер (ИЯЕ-1ис) [5] отличает интегральный отклик, чувствительный ко всем стадиям активации транскрипционного фактора, начиная от его стабилизации, дополнительной посттрансляцион-
ной модификации под действием ацетилаз и ки-наз, транслокации в ядро, образования комплекса с белками-активаторами транскрипции, и наконец, собственно синтеза люциферазы, активность ко -торой и детектируют. Отклик репортеров такого типа наступает со значительным запаздыванием (индукционный период около 3 ч) и невелик по абсолютной величине сигнала люминесценции по сравнению с репортерами второго типа, как показано на примере репортеров антиоксидантного отклика [6].
2. Ко второму типу относятся так называемые «фьюжен»-репортеры, позволяющие следить за интересующим белком в виде его гибрида с белком-маркером. Они специфичны исключительно к стадии стабилизации интересующего белка. Репортеры такого типа пригодны для визуализации транскрипционного фактора в клетке и для высокопродуктивного скрининга потенциальных лекарственных препаратов - активаторов транскрипционного фактора, действующих по принципу стабилизации белка.
В нашем случае предполагалось использование клеточного репортера, регистрирующего стабилизацию кислородчувствительного домена HIFa (HIF ODD - oxygen dependent degradation domain) в виде его гибридного белка с люциферазой светляков (HIF ODD-luc) [7]. Принцип действия репортера HIF ODD-luc представлен на рис. 2. Гибридный ген клонирован под контролем сильного конститутивного промотора (pCMV), который обеспечивает постоянный синтез гибридного белка, состоящего из HIF ODD домена c гидроксилируемым Pro564
Рис. 2. Принцип действия репортера HIF1 ODD-luc
(N-концевой домен гибридного белка), и фермента люциферазы (С-концевой домен) [7]. HIF ODD домен, имеющий в своем составе Pro564, является субстратом HIF PHD: Pro564 подвергается гидрок-силированию, и весь гибридный белок распознается белком pVHL, убиквитинириуется и подвергается протеасомной деградации, которая разрушает и белок люциферазы. Таким образом, в стационарном состоянии, люминесцентный сигнал репортера минимален и соответствует равновесной концентрации гибридного белка. При проведении валидации и оптимизации клеточного репортера в целях скрининга активаторов HIF было показано, что скорость-лимитирующей стадией действия клеточного репортера служит стадия, катализируемая HIF PHD. Была также проведена оценка равновесной концентрации гибридного белка (4 нМ [7]), которая оказалась намного ниже константы Миха-элиса. Таким образом, репортер функционирует в условиях ненасыщения по субстрату. Ингибиторы фермента приводят к немедленной стабилизации гибридного белка, что выражается в увеличении люминесцентного сигнала на порядки, а это позволяет сразу регистрировать накопление гибридного белка под действием ингибиторов фермента (активаторов HIF). Как было нами показано на примере изучения антигипоксических свойств флавонои-дов [8], стабилизация HIFa обязательно ведет к его активации - активаторы репортера HIF ODD-luc всегда проявляют себя как активаторы HRE-luc, но не наоборот. Активация HRE-luc может отражать стадии, отличные от стабилизации HIF-белка (см. ниже в разделе «Материалы и методы»).
В данной работе была проанализирована способность металлов активировать клеточные репортеры обоих типов и, следовательно, стабилизировать и активировать HIF. Была изучена активация репортеров в широком диапазоне концентраций под действием ионов цинка, марганца, никеля, меди, кобальта, кадмия, свинца, золота, олова, и ртути. Полученные результаты хорошо объясняют, почему именно обработка клеток ионами кобальта так широко используется для моделирования (имитации) гипоксии.
Материалы и методы
Реактивы. В работе использовали следующие соли металлов:
HgCl2, H[Au(Cl)4], SnCl2x2H2O, CuCl2, MnCl2x4H2O, Pb(CH3COO)2x3H2O, CdSO4x8/3H2O, CoCl2x6H2O, Ni(NO3)2x6H2O, Zn(CH3COO)2.
Растворы металлов сначала готовили в воде, а
затем разбавляли в Трис-НС1-буфере (рН 7,4) для получения запасных растворов (5 мМ). Все химические реактивы были приобретены у фирмы «Sigma-Aldrich» (США), за исключением реактивов для работы с клеточными культурами («Gibco», США), а также буфера для лизиса клеток и лю-циферазного реагента BrightGlo™ («Promega», США).
Репортерный анализ HIF1 ODD-luc. Использовали клеточную линию нейробластомы человека SH-SY5Y, стабильно экспрессирующую репортер HIF1 ODD-luc [7]. Клетки культивировали до конфлюэнтности, затем разбавляли в 20 раз средой для культивирования DMEM/F12+G1utaMAX («Gibco», США) и засевали по 100 мкл в стерильные белые 96-луночные микропланшеты плотностью 25 000 клеток на лунку, потом дополнительно культивировали в течение 16 ч при 37 °С в присутствии 5% CO2. Добавляли аликво-ты стоков солей металлов до желаемой конечной концентрации и инкубировали в тех же условиях 4 или 24 ч. По окончании инкубации клетки разрушали и измеряли люминесцентный сигнал на спектрофотометре «SpectraMax M5e» («Molecular Devices», США) с помощью люциферазного реагента фирмы «Promega» (США). В качестве положительного контроля использовали циклопирокс. Люминесцентный сигнал в присутствии ионов металлов нормировали на фоновый сигнал репортера в отсутствие добавок.
Репортерный анализ HRE-luc. Вектор для экспрессии гена люциферазы светляков под контролем промотора гена енолазы, содержащего элемент гипоксического отклика (HRE, 5'-RCTGT-3'), был сконструирован ранее в целях скрининга активаторов HIF с разными механизмами действия [5]. Клеточная линия на основе иммортализованных нейронов гиппокампа мыши HT22, стабильно экспрессирующая репортер HRE-luc, позволяет идентифицировать активаторы HIF, которые работают по механизму активации транскрипции, активации связывания HIF с HRE, активации и стабилизации белка HIF (ингибиторы HIF PHD, pVHL, протеасомы). Проведение данного репортерного анализа аналогично предыдущему, за исключением того, что плотность засева составляет 10 000 клеток на лунку. Все эксперименты проводились в тройном повторе.
Результаты и обсуждение
Изучение влияния ионов металлов, имеющих высокое сродство к сульфгидрильным группам, таких как Au3+, Pb2+, Sn2+ и Hg2+ (рис. 3, А) пока-
зало, что эти металлы являются очень слабыми активаторами репортера и, следовательно, слабо конкурируют с железом за активный центр HIF PHD, формируемый карбоксильными остатками и двумя остатками гистидина (рис. 1). Данные ионы хорошо проникают через клеточную мембрану, и небольшая активация отражает их слабую конкуренцию по отношению к железу активного центра.
Ионы металлов, которые гораздо хуже проникают через клеточную мембрану (Mn2+, Cu2+, Ni2+, Zn2), вызывают активацию репортера при очень высоких концентрациях (рис. 3, Б). При этом наибольшей амплитудой активации (в 3-4 раза) отличаются ионы Mn2+ и Zn2+, а ионы Cu2+ и Ni2+ даже при высоких концентрациях активируют репортер незначительно. Как хорошо известно, ионы Mn2+ и Zn2+ способны замещать железо в активном центре железосодержащих ферментов, включая гем-содержащие ферменты, такие как пероксидазы растений, поэтому мож-
но было ожидать значительной активации репортера уже при их микромолярной концентрации. Отсутствие такой активации можно считать следствием низкой проницаемости клеточной мембраны для этих ионов металлов.
Наибольшие амплитуды активации (в 5-7 раз) наблюдались для ионов Со и
этом Сё2+ токсичен при концентрациях выше
2+
100 мкМ, а Со не проявляет токсичности и при 500 мкМ. Следует отметить, что все эксперименты проводились при трехчасовой инкубации, чтобы детектировать стабилизаторы репортера прямого действия, т.е. действующие именно как ингибиторы ШБ РИЭ, которые конкурируют за железо активного центра фермента. В связи с высокой активностью кобальта и кадмия было проведено их дополнительное исследование с использованием двух клеточных репортеров -ШП ОВБ-1ис и ИЯЕ-1ис (рис. 4) в более низком диапазоне концентраций и при инкубации разной продолжительности (4 и 24 ч), в качестве
Рис. 3. Активация репортера ШШ ОББ-1ис под действием переходных и тяжелых металлов (инкубация 3 ч)
0
а 2 Н
1
Q Q О
ь
К «
s я
св Я Я
Й <
В 1 ^^^^ -5---^
2 ® .. -
10 15 20 Циклопирокс, мкМ
5 10 15 20
Циклопирокс, мкМ
25
о
ъ
К «
s я 3
m ?
у. <
10 15 20 Кобальт, мкМ
10 15 20 Кадмий, мкМ
25
10 15 20 Кобальт, мкМ
10 15 20 Кадмий, мкМ
Рис. 4. Активация репортеров HIFI ODD-luc (А-В) и HRE-luc (Г-Е) под действием циклопирокса (А, Г), кобальта (Б, Д), и кадмия (В, Е)
при 4 (1) и 24 (2) ч инкубации
контрольного ингибитора активности фермента был выбран циклопирокс - сильный хелатор железа (с константой около 50 мкМ), способный встраиваться в активный центр фермента в соответствии с результатами компьютерного моделирования [9].
Как следует из данных рис. 4, А-В, циклопирокс, Со2+ и Сё2+ активны в микромолярном диапазоне уже при 4 ч инкубации, однако цикло-пирокс в три раза превосходит данные металлы по амплитуде активации. При увеличении продолжительности активации до 24 ч амплитуда активации под действием циклопирокса увеличивается во много раз, но при концентрациях выше 10 мкМ появляется токсичность (рис. 4, А). Такой вывод подтверждается при рассмотрении отклика интегрального репортера ИЯЕ-1ис (рис. 4, Г) - активация ИГР-зависимой транскрипции под действием циклопирокса достигает пика при 5 мкМ и 4-часовой инкубации, а затем резко падает при дальнейшем увеличении концентрации ингибитора. При 24-часовой инкубации в данном диапазоне концентраций вообще не наблюдается активации транскрипции. Полученные результаты хорошо объясняют тот факт, что сильные хелаторы железа представляют опасность как активаторы анти-гипоксической программы, поскольку железо участвует во многих внутриклеточных процессах в составе различных белков и ферментов и его продолжительное хелатирование вызывает смерть клеток. В данном конкретном случае циклопирокс из-за высокой токсичности, появляющейся при продолжительной инкубации, не может быть предложен в качестве ингибитора, моделирующего гипоксию.
Похожая ситуация наблюдается и для Сё2+ (рис. 4, В, Е): при продолжительной инкубации клетки гибнут, и стабилизации гибридного белка не наблюдается (рис. 4, В). Отклик интегрального репортера ИЯЕ-1ис (рис. 4, Е) довольно интересен: стабилизация транскрипционного фактора под действием оказы-
вается недостаточной для активации транскрипции в течение 4-часовой инкубации, но при 24-часовой инкубации наблюдается активация транскрипции с пиком при концентрации 7 мкМ Сё2+. (рис. 4, Е). Характер активации прямо указывает на наличие сильной токсичности. Вероятно, Сё2+ оказывает влияние на многие вну-
триклеточные процессы, в том числе замедляет транскрипцию генов.
Что же касается эффектов Со2+, то они исключительно положительны в плане активации обоих репортеров (рис. 4, Б, Д) - токсичности не наблюдается в диапазоне концентраций до 25 мкМ при 24-часовой инкубации. Напротив, продолжительная инкубация способствует как дополнительной стабилизации транскрипционного фактора (рис. 4, Б), так и его активации (рис. 4, Д). Эффект усиления стабилизации и активации при увеличении времени инкубации позволяет предполагать, что внутриклеточная концентрация Со2+ растет с течением времени. Это предположение находит хорошее подтверждение в литературе: Со2+ проходит через внутриклеточную мембрану в результате активного АТФ-зависимого транспорта, что приводит к многократному (в 20 раз) увеличению его внутриклеточной концентрации,которая стабилизируется примерно через 10 ч [10]. Таким образом, именно многократная концентрация Со2+ внутри клетки позволяет ему эффективно конкурировать с субмикромолярным количеством железа за активность обсуждаемого фермента.
Инкубация с Со2+ в изученном диапазоне кон -центраций может рассматриваться как эффективный способ моделирования гипоксии. Однако анализ литературных данных показывает, что для имитации гипоксии используются гораздо более высокие концентрации (от 30 до 300 мкМ) в зависимости от типа клеточной культуры, при этом наблюдается активация как антигипокси-ческой программы, контролируемой И1Р1, так и антиоксидантной программы, контролируемой
транскрипционным фактором №£2, и некоторых
2+
других [11]. Концентрация Со 1-2 мМ считается острой токсической для клеток. При такой высокой концентрации из 85 генов, активированных под действием Со2+, только 7 генов были общими с набором генов, активированных гипоксией [12]. На основании полученных в нашем исследовании данных можно рекомендовать значительно более низкие (микромолярные) концентрации Со2+ для имитации гипоксии, поскольку уже при таких концентрациях происходит 3-4-кратная активация транскрипции ИГР-зависимых генов и не наблюдается токсичности вплоть до установления концентрации 25 мкМ при инкубации продолжительностью более суток.
Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-14-10226).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Rose N.R., McDonough M.A., King O.N.F., Kawamu-ra A., Schofield C.J. // Chem. Soc. Rev. 2011. Vol. 40. P. 4364.
2. Semenza G.L., Wang G.L. // Mol.Cell.Biol. 1992. Vol. 12. P. 5447.
3. Wang G.L., Semenza G.L. // J.Biol.Chem. 1993. Vol. 268. P. 21513.
4. Bruick R.K., McKnight S.L. // Science. 2001. Vol. 294. P. 1337.
5. Semenza G.L., Jiang B.H., Leung S.W., Passantino R., Concordet J.P., Maire P., Giallongo A. // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 32529.
6. Smirnova N.A., Haskew-Layton R.E., Basso M., Hushpu-lian D.M., Payappilly J.B., Speer R.E., Ahn Y.H., Rakhman I., Cole P.A., Pinto J.T., Ratan R.R., Gazaryan I.G. // Chem. Biol. 2011. Vol. 18. P. 752.
7. Smirnova N.A., Rakhman I., Moroz N., Basso M., Payap-pilly J., Kazakov S., Hernandez-Guzman F., Gaisina I.N.,
Kozikowski A.P., Ratan R.R., Gazaryan I.G. // Chem. Biol. 2010. Vol. 17. P. 380.
8. Smirnova N.A., Kaidery N.A., Hushpulian D.M., Rakhman I.I., Poloznikov A.A., Tishkov V.I., Karup-pagounder S.S., Gaisina I.N., Pekcec A., Leyen K.V., Kazakov S.V., Yang L., Thomas B., Ratan R.R., Gazaryan I.G. // Aging Dis. 2016. Vol. 7. P. 745.
9. Ma T.C., Langley B., Ko B., Wei N., Gazaryan I.G., Zareen N., Yamashiro D.J., Willis D.E., Ratan R.R. // Neurobiol. Dis. 2013. Vol. 49. P. 13.
10. Kasten U., Hartwig A., Beyersmann D. // Arch.Toxicol. 1992. Vol. 66. P. 592.
11. Permenter M.G., Dennis W.E., Sutto T.E., Jackson D.A., Lewis J.A., Stallings J.D. // PLoS One. 2013. Vol. 8. P. e83751.
12. Malard V., Berenguer F., Prat O., Ruat S., Steinmetz G., Quemeneur E. // BMC. Genomics. 2007. Vol. 8. P. 147.
Поступила в редакцию 22.11.17
METAL IONS AS ACTIVATORS OF HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR
A.I. Osipyants1*, N.A. Smirnova1, A.Yu. Khristichenko1, S.V. Nikulin1, A.A. Zakhariants3, V.I. Tishkov2,3*, I.G. Gazaryan12, A.A. Poloznikov1
(1D. Rogachev National Medical Research Center for Pediatric Hematology, Oncology and Immunology of Healtcare Ministry of Russia; M.V. Lomonosov Moscow State University, Chemistry Faculty; 3Innovations and High Technologies MSU Ltd; *e-mail: osssip@gmail.com, vitishkov@gmail.com)
Activation of antihypoxic program under the action of a number of transition and heavy metals has been studied using cell-based HIF1 ODD-luc and HRE-luc reporters. It has been demonstrated that Au3+, Pb2+, Sn2+, Hg2+ are weak HIF1 ODD-luc activators, likely reflecting their weak competition for the iron-binding site in the active center of HIF prolyl hydroxylase. Metals capable of replacing iron -
submillimolar concentrations, which indicates low permeability of the cell membrane for transition metals. The highest activation is observed for Co2+ and Cd2+, however, Cd2+ is highly toxic even at 10 ^M, in contrast to Co2+, which activates both reporters without toxicity signs up to 25 ^M for 24 h. A significant activation by Co2+ is observed already in low micromolar range of concentrations, which can be recommended for use in hypoxia mimicking.
Key words: luciferase, reporter assay, transition metals, heavy metals, cobalt.
Сведения об авторах: Осипьянц Андрей Игоревич - науч. сотр. лаборатории биохимии и энзимологии ФГБУ «Национальный медицинско-исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии (НМИЦ ДГОИ) им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ (osssip@gmail.com); Смирнова Наталья Алексеевна - ст. науч. сотр. лаборатории биохимии и энзимологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ, канд. биол. наук (nasmirno@yahoo.com); Христиченко Анна Юрьевна - лаб.-иссл. ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ (hristik14@gmail.com); Никулин Сергей Вячеславович - мл. науч. сотр. ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ (nikulin.c.b@gmail.com); Захарянц Арпеник Ашотовна - мл. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук (arpesha@inbox.ru); Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук (vitishkov@gmail.com); Газарян Ирина Георгиевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, сотр. ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ; вед. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук (igazaryan@gmail.com); Полозников Андрей Александрович - зав. лабораторией биохимии и энзимологии ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения РФ, канд. хим. наук (аndrey.poloznikov@gmail.com).
