CC BY
28
�лекса с Bcl-xL с последующим усилением апоптоза и, соответственно, чувствительности клетки к химиотерапевтическим агентам [19, 20].
Среди белков-партнеров AMPK, регулирующих выживаемость опухолевых клеток при действии противоопухолевых препаратов, важную роль играет транскрипционный фактор, опосредующий эффекты гипоксии (hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF-1a) [21, 22]. На линии рака предстательной железы DU145 показано, что AMPK участвует в регуляции НШ-1а-зависимых процессов [21]. В. Faubert и со-авт. обнаружили значительное снижение экспрессии HIF-1a в клетках с подавленной экспрессией AMPK [23], однако данные о действии агонистов AMPK (метформин, акадезин) на активность HIF-1a отсутствуют. Мы предположили, что акадезин влияет на активность HIF-1a в клетках РМЖ и регулирует их выживаемость.
Материалы и методы
Линии клеток и культивирование. Клетки РМЖ человека линий MCF-7, HCC1395 и MDA-MB-231 получены из American Type Culture Collection (США) и хранились в криобанке РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Идентичность линий подтверждали с помощью анализа коротких тандемных повторов (GORDIZ, Россия). Линии MCF-7, HCC1395 и MDA-MB-231 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, ПанЭко, Россия), содержавшей 10 % эмбриональной сыворотки телят (HyClone, CША), пируват натрия (0,11 мг/мл) (ПанЭко, Россия) и 50 ед./мл гентамицина (ПанЭко, Россия), при температуре 37 °С в 5 % СО2 при относительной влажности 80—85 %. В экспериментах использовали культуры в логарифмической стадии.
Оценка цитотоксичности. Этот показатель определяли в МТТ-тесте, основанном на восстановлении жизнеспособными клетками 3- [4,5-диметилтиа-зол-2]-2,5-дифенилтетразолбромида [24]. Значение IC50 (концентрация препарата, при которой выживает 50 % клеток) вычисляли в GraphPad Prism методами нелинейной регрессии. Исследования влияния гипоксии на клетки РМЖ проводили в двухгазовом инкубаторе Binder (Германия) с возможностью снижения парциального давления кислорода до 1 %.
Оценка HIF-1a-зависимой трансактивации гена-репортера. Для определения транскрипционной активности HIF-1a клетки линии MCF-7 трансфици-ровали плазмидой, содержащей репортерный ген лю-циферазы под контролем респонсивного элемента, активируемого гипоксией (hypoxia response element,
N
CS
И
ш u
X ш
и
N
CS
И
ш U
ж ш
и
HRE-LUC). Плазмида HRE-LUC была предоставлена G. Melillo [25]. Для трансфекции использовали Metafectene PRO (Biontex Laboratories, Германия). Для котрансфекции использовали плазмиду, содержащую ген ß-галактозидазы под контролем промотора цитоме-галовируса (pCMV-ß-gal). Активность этого промотора не регулируется гипоксией. Определение активности люциферазы проводили на планшетном люминометре TECAN Infinite M200Pro (Promega, США) согласно рекомендациям производителя; уровень ß-галактозидазы определяли по стандартному протоколу на анализаторе MultiScanFC (ThermoScientific, США). HIF-1a-зависимую трансактивацию выражали в условных единицах как отношение активности люциферазы к активности ß-галактозидазы. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Каждый опыт воспроизводили не менее 3 раз. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ DATAPLOT и GraphPad Prism.
Иммуноблоттинг. Для проведения иммуноблоттин-га клетки на стадии 80 % монослоя лизировали в 150 мкл буфера следующего состава: 50 мM Трис-HCl pH 7,4, 1 % Igepal CA-630, 150 мM NaCl, 1 мM этиленди-аминтетраацетата, 1 мМ дитиотрейтола, по 1 мкг/мл апротинина, леупептина и пепстатина, по 1 мM фторида натрия и ортованадата натрия. Образцы инкубировали на льду 20 мин, затем центрифугировали (10 000g, 10 мин, при температуре 4 °С), проводили электрофорез в 10 % полиакриламидном геле, перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану и иммуно-блоттинг. Содержание общего и фосфорилированного AMPK и mTOR определяли с помощью антител Cell Signaling Technology (США). Детекцию выполняли с вторичными антителами к иммуноглобулину кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, США) в системе для анализа LAS 4000 (GE HealthCare, США).
Результаты и обсуждение
Цитотоксическое действие акадезина на клетки РМЖ. Акадезин получали микробиологическим способом с использованием оригинального реком-бинантного штамма [26]. Цитотоксическое действие акадезина анализировали на 3 линиях РМЖ: клетки гормонозависимого рака MCF-7, трижды негативного рака MDA-MB-231 и HCC1395. MTT-тест, проведенный после 72-часовой инкубации клеток, показал, что IC50 акадезина для клеток MCF-7 (люминальный А подтип рака) составляет 0,28 мМ. Клетки трижды негативного рака MDA-MB-231 также чувствительны к акадезину: для этой линии значение IC50 составило 0,05 мМ, для другой линии трижды негативного РМЖ HCC1395 — 0,86 мМ (средние величины по результатам 3 независимых экспериментов). Таким образом, акадезин демонстрирует достаточно высокую активность в отношении РМЖ различных молекулярных подтипов.
Акадезин, АМРК и гипоксия. В клетках акадезин превращается в фосфорилированный метаболит, ZMP (5-амино-1-р^-рибофуранозилимидазол-4-карбо-ксамид-монофосфат). Накопление ZMP приводит к индукции AMPK — сенсора изменений соотношения АМФ:АТФ. Ранее показано непосредственное участие AMPK в ответе клеток на гипоксию [21]. Мы предположили, что гипоксия может модулировать действие акадезина на AMPK-контролируемые процессы в клетках РМЖ.
Методом иммуноблоттинга установлено, что в нор-моксии акадезин вызывает незначительное накопление фосфорилированной (активированной) формы AMPK в клетках линии MCF-7 (рис. 1). В условиях гипоксии акадезин — более сильный активатор AMPK. При действии акадезина не выявлено изменений активности протеинкиназы mTOR (mammalian target of rapamycin), одного из возможных эффекторов AMPK. Это может свидетельствовать об активации других сигнальных путей в клетках РМЖ в обход mTOR.
Влияние акадезина на HIF-1a-зависимую трансактивацию. Активация транскрипционного фактора HIF-1a — важнейший механизм адаптации опухоли к гипоксии [27, 28]. HIF-la-зависимые сигналы опосредуют выживание опухоли в гипоксии. В частности, HIF1-a регулирует накопление фактора роста эндотелия сосудов в опухоли и стимуляцию неоангиогенеза [29]. Оценку влияния акадезина на HIF-la-зависимую транскрипцию проводили с помощью репортерного анализа. Клетки линии MCF-7 трансфецировали плазмидой, несущей ген люциферазы под контролем HIF-la-чувствительного промотора. Через 24 ч после трансфекции клетки помещали в инкубатор с содержанием 1 % кислорода. Через 8 ч измеряли активность люциферазы (см. Материалы и методы). На рис. 2 показано, что акадезин в относительно низких концентрациях (начиная с 0,12 мМ) снижает HIF-la-опосредованную трансактивацию. С увеличением концентрации акадезина падение активности HIF-1a нарастает; при 2 мМ акадезина трансактивирующая
Фосфо-АМРК
АМРК —• —— Фосфо-mTOR
|0||O,5 | 1 | 2 0 I0,5 1 1 1 2
Нормоксия Гипоксия
mTOR
Акадезин, мМ
Рис. 1. Гтоксическая активация AMPK — основной мишени акадезина. Клетки линии MCF-7 инкубировали с указанными дозами акадезина в нормоксии или гипоксии (1 % кислорода) в течение 24 ч. Экспрессию белков определяли методом иммуноблоттинга. AMPK — аденозинмо-нофосфат-активируемая протеинкиназа (adenosine monophosphate-activated protein kinase)
1,2-1
ш
х 0,8-н
о
а 0,6-¿ о,4-
ос
х 0,20,0
' i
Нормоксия ■
Гипоксия
л
Контроль 0,1
0,3 0,5 Акадезин, мМ
1,0
2,0
Рис. 2. Ингибирование акадезином индуцированной активности HIF-1а. Клетки MCF-7 трансфецировали плазмидой, несущей ген-репортер (люциферазу) под контролем HIF-la-чувствительного промотора. Для контроля изменений генной транскрипции, независимых от гипоксии, использовали котрансфекцию клеток плазмидойpCMV-в-gal (см. Материалы и методы). HIF-1a активировали 8-часовой инкубацией клеток в атмосфере с 1 % кислорода. HIF-la-зависимую трансактивацию выражали в условных единицах как отношение активности люцифе-разы к активности в-галактозидазы в лизатах клеток
способность HIF-1a не отличается от таковой в нор-моксии (отсутствие гипоксической индукции). Таким образом, акадезин эффективно ингибирует сигналинг, опосредованный HIF-1a, — механизм, важный для выживаемости опухолевых клеток при пониженном содержании кислорода.
Устойчивость клеток РМЖ к действию цисплатина в гипоксии. Снижение оксигенации приводит к значительным метаболическим изменениям в опухолевой клетке: активируются гипоксические сигнальные пути (HIF-1a, VEGF/VEGFRs, FGF, PDGF), усиливаются гликолиз и активность транспортеров глюкозы [29— 31]. Вследствие этих изменений при гипоксии может снижаться чувствительность опухоли к химиопрепара-там. На рис. 3 показано, что инкубация клеток линии MDA-MB-231 в атмосфере с 1 % кислорода снижает цитотоксичность цисплатина. Учитывая высокую активность акадезина как индуктора AMPK и ингибитора HIF-1a в гипоксии, мы предположили, что с его помощью возможно повысить чувствительность клеток к цисплатину. Комбинация цисплатина с акадезином была эффективна и в нормоксии, и в гипоксии: после 72 ч инкубации выжило менее 30 % клеток. При этом
80
X
и 70
3
CÛ 60
1 ■Û к о т 50
CÛ е 40
тн е лк 30
^ о 20
р 10
С
0
I I
Цисплатин
Акадезин
Цисплатин + акадезин
Нормоксия
Гипоксия
Рис. 3. Эффекты акадезина на выживаемость клеток рака молочной железы в гипоксии и в присутствии цисплатина. Данные МТТ-теста через 72 ч инкубации клеток линии MDA-MB-231 в нормоксии (21 % кислорода) или гипоксии (1 % кислорода); цисплатин (15мкМ), акадезин (0,25мМ); *р < 0,05 по сравнению с действием цисплатина в нор-моксии
акадезин повышает цитотоксичность цисплатина в гипоксии практически до соответствующего показателя в нормоксии, т. е. отменяет вызванное гипоксией повышение выживаемости клеток с цисплатином.
Заключение
В целом представленные данные свидетельствуют о том, что акадезин участвует в регуляции сигнальных путей АМРК/Н№-1а, поддерживающих выживание клеток РМЖ в гипоксии. Комбинирование с акаде-зином позволяет повысить цитотоксичность циспла-тина. Этот результат особенно важен, так как при гипоксии эффективность цисплатина ограничена. Таким образом, обоснована перспективность использования акадезина для снижения выживаемости клеток РМЖ в условиях гипоксии. Один из механизмов такой сенситизации — блокирование акадезином Н№-1а-зависимых молекулярных каскадов. С учетом значительной роли НШ-1а в усилении экспрессии \EGF-A соответственно, в развитии и поддержании сети вну-триопухолевых сосудистых капилляров [32] высокую эффективность может показать комбинация антиан-гиогенной терапии и акадезина.
N
ев
и ш u
X ш
и
к
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Fitzmaurice C., Dicker D., Pain A. et al. The Global Burden of Cancer 2013. JAMA Oncol 2015;1(4):
505-27.
2. Liu H.Y., Li Q.R., Cheng X.F. et al. NAMPT inhibition synergizes with NQOl-targeting agents in inducing apoptotic cell death in non-small cell lung cancer cells. Chin J Nat Med 2016;14(8):582-9.
3. Szlosarek P.W., Steele J.P., Nolan L. et al. Arginine deprivation with pegylated arginine deiminase in patients with
argininosuccinate synthetase 1-deficient malignant pleural mesothelioma: a randomized clinical trial. JAMA Oncol 2016;3(1):58-66.
4. Miraki-Moud F., Ghazaly E., Ariza-McNaughton L. et al. Arginine deprivation using pegylated arginine deiminase has activity against primary acute myeloid leukemia cells in vivo. Blood 2015;125(26):4060-8.
5. Khan A., Andrews D., Blackburn A.C. Long-term stabilization of stage 4 colon cancer using sodium dichloroacetate
therapy. World J Clin Cases 2016;4(10):336-43.
6. Glazunova VA, Lobanov K.V., Shakulov R.S. et al. Acadesine triggers non-apoptotic death in tumor cells. Acta Naturae 2013;5(3):74-8.
7. Theodoropoulou S., Kolovou P.E., Morizane Y. et al. Retinoblastoma cells are inhibited by aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) partially through activation of AMP-dependent kinase. FASEB J 2010;24(8):2620-30.
N
CS
И
ш U
ж ш
и
8. Garcia-Gil M., Pesi R., Perna S. et al. 5'-aminoimidazole-4-carboxamide riboside induces apoptosis in human neuroblastoma cells. Neuroscience 2003;117(4):811-20.
9. Kefas B.A., Heimberg H., Vaulont S. et al. AICA-riboside induces apoptosis
of pancreatic beta cells through stimulation of AMP-activated protein kinase. Diabetologia 2003;46(2):250-4.
10. Meisse D., van de Casteele M., Beauloye C. et al. Sustained activation of AMP-activated protein kinase induces c-Jun N-terminal kinase activation and apoptosis in liver cells. FEBS Lett 2002;526(1-3):38-42.
11. Woodard J., Platanias L.C. AMP-activated kinase (AMPK)-generated signals in malignant melanoma cell growth and survival. Biochem Biophys Res Commun 2010;398(1):135-9.
12. Campas C., Lopez J.M., Santidrian A.F. et al. Acadesine activates AMPK and induces apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells but not
in T lymphocytes. Blood 2003;101(9):3674-80.
13. El-Masry O.S., Brown B.L., Dobson P.R. Effects of activation of AMPK on human breast cancer cell lines with different genetic backgrounds. Oncol Lett 2012;3(1):224-8.
14. Theodoropoulou S., Brodowska K., Kayama M. et al. Aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) inhibits the growth of retinoblastoma in vivo by decreasing angiogenesis and inducing apoptosis. PLoS One 2013;8(1):e52852.
15. Song X., Huang D., Liu Y. et al. AMP-activated protein kinase is required for cell
survival and growth in HeLa-S3 cells in vivo. IUBMB Life 2014;66(6):415-23.
16. Nieminen A.I., Eskelinen V.M., Haikala H.M. et al. Myc-induced AMPK-phospho p53 pathway activates Bak to sensitize mitochondrial apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110(20):E1839-48.
17. Wang Z., Wang N., Liu P. et al. AMPK and Cancer. EXS 2016;107:203-26.
18. Sun Y., Tao C., Huang X. et al. Metformin induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells by activating an AMPK/p53/miR-23a/ FOXA1 pathway. Onco Targets Ther 2016;9:2845-53.
19. Neise D., Graupner V., Gillissen B.F. et al. Activation of the mitochondrial death pathway is commonly mediated by a preferential engagement of Bak. Oncogene 2008;27(10):1387-96.
20. Dai H., Ding H., Meng X.W. et al. Constitutive Bak activation
as a determinant of drug sensitivity in malignant lymphohematopoietic cells. Genes Dev 2015;29(20):2140-52.
21. Lee M., Hwang J.T., Lee H.J. et al. AMP-activated protein kinase activity is critical for hypoxia-inducible factor-1 transcriptional activity and its target gene expression under hypoxic conditions in DU145 cells. J Biol Chem 2003;278(41):39653-61.
22. Liao D., Johnson R.S. Hypoxia: a key regulator of angiogenesis in cancer. Cancer Metastasis Rev 2007;26(2):281-90.
23. Faubert B., Boily G., Izreig S. et al. AMPK is a negative regulator of the Warburg effect and suppresses tumor growth in vivo. Cell Metab 2013;17(1):113-24.
24. Iselt M., Holtei W., Hilgard P. The tetrazolium dye assay for rapid in vitro assessment of cytotoxicity. Arzneimittelforschung 1989;39(7): 747-9.
25. Rapisarda A., Uranchimeg B., Sordet O. et al. Topoisomerase I-mediated inhibition of hypoxia-inducible factor 1: mechanism and therapeutic implications. Cancer Res 2004;64(4):1475-82.
26. Lobanov K.V., Errais Lopes L., Korol'kova N.V. et al. Reconstruction of purine metabolism in bacillus subtilis to obtain the strain producer of AICAR: a new drug with a wide range
of therapeutic applications. Acta Naturae 2011;3(2):79-89.
27. Ke Q., Costa M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol 2006;70(5):1469-80.
28. Kimbro K.S., Simons J.W. Hypoxia-inducible factor-1 in human breast and prostate cancer. Endocr Relat Cancer 2006;13(3):739-49.
29. Schneider B.P., Miller K.D. Angiogenesis of breast cancer. J Clin Oncol 2005;23(8):1782-90.
30. Dimova I., Popivanov G., Djonov V. Angiogenesis in cancer - general pathways and their therapeutic implications. J BUON 2014;19(1):15-21.
31. Mittal K., Ebos J., Rini B. Angiogenesis and the tumor microenvironment: vascular endothelial growth factor
and beyond. Semin Oncol 2014;41(2): 235-51.
32. Subhani S., Vavilala D.T., Mukherji M. HIF inhibitors for ischemic retinopathies and cancers: options beyond anti-VEGF therapies. Angiogenesis 2016;19(3): 257-73.
