Научная статья на тему 'Действие акадезина на клетки рака молочной железы в условиях гипоксии'

Действие акадезина на клетки рака молочной железы в условиях гипоксии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
304
26
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АКАДЕЗИН / РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ / ЛИНИЯ КЛЕТОК MCF-7 / ГИПОКСИЯ / ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ / ACADESINE / BREAST CANCER / MCF-7 CELL LINE / HYPOXIA / TRANSCRIPTION FACTORS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Щербаков А.М., Вавилов Н.Э., Андреева О.Е., Тяглов Б.В., Миронов А.С.

Производное рибозида акадезин (5‑аминоимидазол-4‑карбоксамид-1‑β-D-рибофуранозид) проходит клинические испытания как перспективный противоопухолевый препарат. Внутриклеточная мишень акадезина аденозинмонофосфат-активируемая протеинкиназа (АМРК, adenosine monophosphate-activated protein kinase) – важный регулятор энергетического метаболизма. Правомерно предположить, что акадезин окажется активен в условиях гипоксии опухолей. В нормоксии (инкубация клеток в атмосфере с 21 % кислорода) акадезин вызывал торможение пролиферации и гибель клеток аденокарциномы молочной железы, в том числе линии трижды негативного рака. При снижении парциального давления кислорода до 1 % (экспериментальная гипоксия) акадезин ингибировал активацию промотор-репортерной конструкции, обусловленную транскрипционным фактором HIF-1α (hypoxia inducible factor 1 alpha). Этот эффект наблюдали при действии акадезина в концентрациях, сопоставимых с цитотоксическими. Акадезин сохранял цитотоксичность в условиях гипоксии и снижал обусловленную гипоксией устойчивость клеток линии MDA-MB-231 к действию цисплатина. Эти результаты расширяют область применения акадезина и позволяют предположить его эффективность в комбинированных режимах лекарственной терапии рака молочной железы, в том числе для опухолей с низкой оксигенацией.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Щербаков А.М., Вавилов Н.Э., Андреева О.Е., Тяглов Б.В., Миронов А.С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Effect of acadesine on breast cancer cells under hypoxia

The riboside derivative acadesine (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranoside) is currently being tested in clinical trials as a promising anti-tumor drug. Intracellular target of acadesine is adenosine monophosphate-activated protein kinase (АМРК), an important regulatory molecule of energy metabolism. It is expected that acadesine would be active in tumors under hypoxia conditions. In normoxia (cells incubated in 21 % oxygen), acadesine inhibited proliferation and induced cell death of breast adenocarcinoma, including the triple negative breast cancer line. When oxygen partial pressure was decreased to 1 % (experimental hypoxia), acadesine inhibited activation of reporter construct responsive to HIF-1α (hypoxia inducible factor 1 alpha) transcription factor. This effect was observed for acadesine in concentrations close to cytotoxic. Acadesine retained cytotoxicity under hypoxia and decreased the survival of the MDA-MB-231 cell line when used in combination with cisplatin. These results considerably widen acadesine’s field of application and allow to assume its efficacy in chemotherapy combination regimens for breast cancer, including the tumors with low oxygenation.

Текст научной работы на тему «Действие акадезина на клетки рака молочной железы в условиях гипоксии»

�лекса с Bcl-xL с последующим усилением апоптоза и, соответственно, чувствительности клетки к химиотерапевтическим агентам [19, 20].

Среди белков-партнеров AMPK, регулирующих выживаемость опухолевых клеток при действии противоопухолевых препаратов, важную роль играет транскрипционный фактор, опосредующий эффекты гипоксии (hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF-1a) [21, 22]. На линии рака предстательной железы DU145 показано, что AMPK участвует в регуляции НШ-1а-зависимых процессов [21]. В. Faubert и со-авт. обнаружили значительное снижение экспрессии HIF-1a в клетках с подавленной экспрессией AMPK [23], однако данные о действии агонистов AMPK (метформин, акадезин) на активность HIF-1a отсутствуют. Мы предположили, что акадезин влияет на активность HIF-1a в клетках РМЖ и регулирует их выживаемость.

Материалы и методы

Линии клеток и культивирование. Клетки РМЖ человека линий MCF-7, HCC1395 и MDA-MB-231 получены из American Type Culture Collection (США) и хранились в криобанке РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Идентичность линий подтверждали с помощью анализа коротких тандемных повторов (GORDIZ, Россия). Линии MCF-7, HCC1395 и MDA-MB-231 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, ПанЭко, Россия), содержавшей 10 % эмбриональной сыворотки телят (HyClone, CША), пируват натрия (0,11 мг/мл) (ПанЭко, Россия) и 50 ед./мл гентамицина (ПанЭко, Россия), при температуре 37 °С в 5 % СО2 при относительной влажности 80—85 %. В экспериментах использовали культуры в логарифмической стадии.

Оценка цитотоксичности. Этот показатель определяли в МТТ-тесте, основанном на восстановлении жизнеспособными клетками 3- [4,5-диметилтиа-зол-2]-2,5-дифенилтетразолбромида [24]. Значение IC50 (концентрация препарата, при которой выживает 50 % клеток) вычисляли в GraphPad Prism методами нелинейной регрессии. Исследования влияния гипоксии на клетки РМЖ проводили в двухгазовом инкубаторе Binder (Германия) с возможностью снижения парциального давления кислорода до 1 %.

Оценка HIF-1a-зависимой трансактивации гена-репортера. Для определения транскрипционной активности HIF-1a клетки линии MCF-7 трансфици-ровали плазмидой, содержащей репортерный ген лю-циферазы под контролем респонсивного элемента, активируемого гипоксией (hypoxia response element,

N

CS

И

ш u

X ш

и

N

CS

И

ш U

ж ш

и

HRE-LUC). Плазмида HRE-LUC была предоставлена G. Melillo [25]. Для трансфекции использовали Metafectene PRO (Biontex Laboratories, Германия). Для котрансфекции использовали плазмиду, содержащую ген ß-галактозидазы под контролем промотора цитоме-галовируса (pCMV-ß-gal). Активность этого промотора не регулируется гипоксией. Определение активности люциферазы проводили на планшетном люминометре TECAN Infinite M200Pro (Promega, США) согласно рекомендациям производителя; уровень ß-галактозидазы определяли по стандартному протоколу на анализаторе MultiScanFC (ThermoScientific, США). HIF-1a-зависимую трансактивацию выражали в условных единицах как отношение активности люциферазы к активности ß-галактозидазы. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Каждый опыт воспроизводили не менее 3 раз. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ DATAPLOT и GraphPad Prism.

Иммуноблоттинг. Для проведения иммуноблоттин-га клетки на стадии 80 % монослоя лизировали в 150 мкл буфера следующего состава: 50 мM Трис-HCl pH 7,4, 1 % Igepal CA-630, 150 мM NaCl, 1 мM этиленди-аминтетраацетата, 1 мМ дитиотрейтола, по 1 мкг/мл апротинина, леупептина и пепстатина, по 1 мM фторида натрия и ортованадата натрия. Образцы инкубировали на льду 20 мин, затем центрифугировали (10 000g, 10 мин, при температуре 4 °С), проводили электрофорез в 10 % полиакриламидном геле, перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану и иммуно-блоттинг. Содержание общего и фосфорилированного AMPK и mTOR определяли с помощью антител Cell Signaling Technology (США). Детекцию выполняли с вторичными антителами к иммуноглобулину кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, США) в системе для анализа LAS 4000 (GE HealthCare, США).

Результаты и обсуждение

Цитотоксическое действие акадезина на клетки РМЖ. Акадезин получали микробиологическим способом с использованием оригинального реком-бинантного штамма [26]. Цитотоксическое действие акадезина анализировали на 3 линиях РМЖ: клетки гормонозависимого рака MCF-7, трижды негативного рака MDA-MB-231 и HCC1395. MTT-тест, проведенный после 72-часовой инкубации клеток, показал, что IC50 акадезина для клеток MCF-7 (люминальный А подтип рака) составляет 0,28 мМ. Клетки трижды негативного рака MDA-MB-231 также чувствительны к акадезину: для этой линии значение IC50 составило 0,05 мМ, для другой линии трижды негативного РМЖ HCC1395 — 0,86 мМ (средние величины по результатам 3 независимых экспериментов). Таким образом, акадезин демонстрирует достаточно высокую активность в отношении РМЖ различных молекулярных подтипов.

Акадезин, АМРК и гипоксия. В клетках акадезин превращается в фосфорилированный метаболит, ZMP (5-амино-1-р^-рибофуранозилимидазол-4-карбо-ксамид-монофосфат). Накопление ZMP приводит к индукции AMPK — сенсора изменений соотношения АМФ:АТФ. Ранее показано непосредственное участие AMPK в ответе клеток на гипоксию [21]. Мы предположили, что гипоксия может модулировать действие акадезина на AMPK-контролируемые процессы в клетках РМЖ.

Методом иммуноблоттинга установлено, что в нор-моксии акадезин вызывает незначительное накопление фосфорилированной (активированной) формы AMPK в клетках линии MCF-7 (рис. 1). В условиях гипоксии акадезин — более сильный активатор AMPK. При действии акадезина не выявлено изменений активности протеинкиназы mTOR (mammalian target of rapamycin), одного из возможных эффекторов AMPK. Это может свидетельствовать об активации других сигнальных путей в клетках РМЖ в обход mTOR.

Влияние акадезина на HIF-1a-зависимую трансактивацию. Активация транскрипционного фактора HIF-1a — важнейший механизм адаптации опухоли к гипоксии [27, 28]. HIF-la-зависимые сигналы опосредуют выживание опухоли в гипоксии. В частности, HIF1-a регулирует накопление фактора роста эндотелия сосудов в опухоли и стимуляцию неоангиогенеза [29]. Оценку влияния акадезина на HIF-la-зависимую транскрипцию проводили с помощью репортерного анализа. Клетки линии MCF-7 трансфецировали плазмидой, несущей ген люциферазы под контролем HIF-la-чувствительного промотора. Через 24 ч после трансфекции клетки помещали в инкубатор с содержанием 1 % кислорода. Через 8 ч измеряли активность люциферазы (см. Материалы и методы). На рис. 2 показано, что акадезин в относительно низких концентрациях (начиная с 0,12 мМ) снижает HIF-la-опосредованную трансактивацию. С увеличением концентрации акадезина падение активности HIF-1a нарастает; при 2 мМ акадезина трансактивирующая

Фосфо-АМРК

АМРК —• —— Фосфо-mTOR

|0||O,5 | 1 | 2 0 I0,5 1 1 1 2

Нормоксия Гипоксия

mTOR

Акадезин, мМ

Рис. 1. Гтоксическая активация AMPK — основной мишени акадезина. Клетки линии MCF-7 инкубировали с указанными дозами акадезина в нормоксии или гипоксии (1 % кислорода) в течение 24 ч. Экспрессию белков определяли методом иммуноблоттинга. AMPK — аденозинмо-нофосфат-активируемая протеинкиназа (adenosine monophosphate-activated protein kinase)

1,2-1

ш

х 0,8-н

о

а 0,6-¿ о,4-

ос

х 0,20,0

' i

Нормоксия ■

Гипоксия

л

Контроль 0,1

0,3 0,5 Акадезин, мМ

1,0

2,0

Рис. 2. Ингибирование акадезином индуцированной активности HIF-1а. Клетки MCF-7 трансфецировали плазмидой, несущей ген-репортер (люциферазу) под контролем HIF-la-чувствительного промотора. Для контроля изменений генной транскрипции, независимых от гипоксии, использовали котрансфекцию клеток плазмидойpCMV-в-gal (см. Материалы и методы). HIF-1a активировали 8-часовой инкубацией клеток в атмосфере с 1 % кислорода. HIF-la-зависимую трансактивацию выражали в условных единицах как отношение активности люцифе-разы к активности в-галактозидазы в лизатах клеток

способность HIF-1a не отличается от таковой в нор-моксии (отсутствие гипоксической индукции). Таким образом, акадезин эффективно ингибирует сигналинг, опосредованный HIF-1a, — механизм, важный для выживаемости опухолевых клеток при пониженном содержании кислорода.

Устойчивость клеток РМЖ к действию цисплатина в гипоксии. Снижение оксигенации приводит к значительным метаболическим изменениям в опухолевой клетке: активируются гипоксические сигнальные пути (HIF-1a, VEGF/VEGFRs, FGF, PDGF), усиливаются гликолиз и активность транспортеров глюкозы [29— 31]. Вследствие этих изменений при гипоксии может снижаться чувствительность опухоли к химиопрепара-там. На рис. 3 показано, что инкубация клеток линии MDA-MB-231 в атмосфере с 1 % кислорода снижает цитотоксичность цисплатина. Учитывая высокую активность акадезина как индуктора AMPK и ингибитора HIF-1a в гипоксии, мы предположили, что с его помощью возможно повысить чувствительность клеток к цисплатину. Комбинация цисплатина с акадезином была эффективна и в нормоксии, и в гипоксии: после 72 ч инкубации выжило менее 30 % клеток. При этом

80

X

и 70

3

CÛ 60

1 ■Û к о т 50

CÛ е 40

тн е лк 30

^ о 20

р 10

С

0

I I

Цисплатин

Акадезин

Цисплатин + акадезин

Нормоксия

Гипоксия

Рис. 3. Эффекты акадезина на выживаемость клеток рака молочной железы в гипоксии и в присутствии цисплатина. Данные МТТ-теста через 72 ч инкубации клеток линии MDA-MB-231 в нормоксии (21 % кислорода) или гипоксии (1 % кислорода); цисплатин (15мкМ), акадезин (0,25мМ); *р < 0,05 по сравнению с действием цисплатина в нор-моксии

акадезин повышает цитотоксичность цисплатина в гипоксии практически до соответствующего показателя в нормоксии, т. е. отменяет вызванное гипоксией повышение выживаемости клеток с цисплатином.

Заключение

В целом представленные данные свидетельствуют о том, что акадезин участвует в регуляции сигнальных путей АМРК/Н№-1а, поддерживающих выживание клеток РМЖ в гипоксии. Комбинирование с акаде-зином позволяет повысить цитотоксичность циспла-тина. Этот результат особенно важен, так как при гипоксии эффективность цисплатина ограничена. Таким образом, обоснована перспективность использования акадезина для снижения выживаемости клеток РМЖ в условиях гипоксии. Один из механизмов такой сенситизации — блокирование акадезином Н№-1а-зависимых молекулярных каскадов. С учетом значительной роли НШ-1а в усилении экспрессии \EGF-A соответственно, в развитии и поддержании сети вну-триопухолевых сосудистых капилляров [32] высокую эффективность может показать комбинация антиан-гиогенной терапии и акадезина.

N

ев

и ш u

X ш

и

к

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Fitzmaurice C., Dicker D., Pain A. et al. The Global Burden of Cancer 2013. JAMA Oncol 2015;1(4):

505-27.

2. Liu H.Y., Li Q.R., Cheng X.F. et al. NAMPT inhibition synergizes with NQOl-targeting agents in inducing apoptotic cell death in non-small cell lung cancer cells. Chin J Nat Med 2016;14(8):582-9.

3. Szlosarek P.W., Steele J.P., Nolan L. et al. Arginine deprivation with pegylated arginine deiminase in patients with

argininosuccinate synthetase 1-deficient malignant pleural mesothelioma: a randomized clinical trial. JAMA Oncol 2016;3(1):58-66.

4. Miraki-Moud F., Ghazaly E., Ariza-McNaughton L. et al. Arginine deprivation using pegylated arginine deiminase has activity against primary acute myeloid leukemia cells in vivo. Blood 2015;125(26):4060-8.

5. Khan A., Andrews D., Blackburn A.C. Long-term stabilization of stage 4 colon cancer using sodium dichloroacetate

therapy. World J Clin Cases 2016;4(10):336-43.

6. Glazunova VA, Lobanov K.V., Shakulov R.S. et al. Acadesine triggers non-apoptotic death in tumor cells. Acta Naturae 2013;5(3):74-8.

7. Theodoropoulou S., Kolovou P.E., Morizane Y. et al. Retinoblastoma cells are inhibited by aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) partially through activation of AMP-dependent kinase. FASEB J 2010;24(8):2620-30.

N

CS

И

ш U

ж ш

и

8. Garcia-Gil M., Pesi R., Perna S. et al. 5'-aminoimidazole-4-carboxamide riboside induces apoptosis in human neuroblastoma cells. Neuroscience 2003;117(4):811-20.

9. Kefas B.A., Heimberg H., Vaulont S. et al. AICA-riboside induces apoptosis

of pancreatic beta cells through stimulation of AMP-activated protein kinase. Diabetologia 2003;46(2):250-4.

10. Meisse D., van de Casteele M., Beauloye C. et al. Sustained activation of AMP-activated protein kinase induces c-Jun N-terminal kinase activation and apoptosis in liver cells. FEBS Lett 2002;526(1-3):38-42.

11. Woodard J., Platanias L.C. AMP-activated kinase (AMPK)-generated signals in malignant melanoma cell growth and survival. Biochem Biophys Res Commun 2010;398(1):135-9.

12. Campas C., Lopez J.M., Santidrian A.F. et al. Acadesine activates AMPK and induces apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells but not

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

in T lymphocytes. Blood 2003;101(9):3674-80.

13. El-Masry O.S., Brown B.L., Dobson P.R. Effects of activation of AMPK on human breast cancer cell lines with different genetic backgrounds. Oncol Lett 2012;3(1):224-8.

14. Theodoropoulou S., Brodowska K., Kayama M. et al. Aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) inhibits the growth of retinoblastoma in vivo by decreasing angiogenesis and inducing apoptosis. PLoS One 2013;8(1):e52852.

15. Song X., Huang D., Liu Y. et al. AMP-activated protein kinase is required for cell

survival and growth in HeLa-S3 cells in vivo. IUBMB Life 2014;66(6):415-23.

16. Nieminen A.I., Eskelinen V.M., Haikala H.M. et al. Myc-induced AMPK-phospho p53 pathway activates Bak to sensitize mitochondrial apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110(20):E1839-48.

17. Wang Z., Wang N., Liu P. et al. AMPK and Cancer. EXS 2016;107:203-26.

18. Sun Y., Tao C., Huang X. et al. Metformin induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells by activating an AMPK/p53/miR-23a/ FOXA1 pathway. Onco Targets Ther 2016;9:2845-53.

19. Neise D., Graupner V., Gillissen B.F. et al. Activation of the mitochondrial death pathway is commonly mediated by a preferential engagement of Bak. Oncogene 2008;27(10):1387-96.

20. Dai H., Ding H., Meng X.W. et al. Constitutive Bak activation

as a determinant of drug sensitivity in malignant lymphohematopoietic cells. Genes Dev 2015;29(20):2140-52.

21. Lee M., Hwang J.T., Lee H.J. et al. AMP-activated protein kinase activity is critical for hypoxia-inducible factor-1 transcriptional activity and its target gene expression under hypoxic conditions in DU145 cells. J Biol Chem 2003;278(41):39653-61.

22. Liao D., Johnson R.S. Hypoxia: a key regulator of angiogenesis in cancer. Cancer Metastasis Rev 2007;26(2):281-90.

23. Faubert B., Boily G., Izreig S. et al. AMPK is a negative regulator of the Warburg effect and suppresses tumor growth in vivo. Cell Metab 2013;17(1):113-24.

24. Iselt M., Holtei W., Hilgard P. The tetrazolium dye assay for rapid in vitro assessment of cytotoxicity. Arzneimittelforschung 1989;39(7): 747-9.

25. Rapisarda A., Uranchimeg B., Sordet O. et al. Topoisomerase I-mediated inhibition of hypoxia-inducible factor 1: mechanism and therapeutic implications. Cancer Res 2004;64(4):1475-82.

26. Lobanov K.V., Errais Lopes L., Korol'kova N.V. et al. Reconstruction of purine metabolism in bacillus subtilis to obtain the strain producer of AICAR: a new drug with a wide range

of therapeutic applications. Acta Naturae 2011;3(2):79-89.

27. Ke Q., Costa M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol 2006;70(5):1469-80.

28. Kimbro K.S., Simons J.W. Hypoxia-inducible factor-1 in human breast and prostate cancer. Endocr Relat Cancer 2006;13(3):739-49.

29. Schneider B.P., Miller K.D. Angiogenesis of breast cancer. J Clin Oncol 2005;23(8):1782-90.

30. Dimova I., Popivanov G., Djonov V. Angiogenesis in cancer - general pathways and their therapeutic implications. J BUON 2014;19(1):15-21.

31. Mittal K., Ebos J., Rini B. Angiogenesis and the tumor microenvironment: vascular endothelial growth factor

and beyond. Semin Oncol 2014;41(2): 235-51.

32. Subhani S., Vavilala D.T., Mukherji M. HIF inhibitors for ischemic retinopathies and cancers: options beyond anti-VEGF therapies. Angiogenesis 2016;19(3): 257-73.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.