CC BY
541
УДК 577.2.04
ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР HIF-1: МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ГИПОКСИИ И НОРМОКСИИ
© 2014 г. И.А. Аллилуев
Аллилуев Илья Александрович - аспирант, кафедра биохимии Alliluev Ilya Aleksandrovich - Post-Graduate Student, Depart-и микробиологии, факультет биологических наук, Южный ment of Microbiology and Biochemistry, Faculty of Biological федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов- Science, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, на-Дону, 344006, e-mail: iljukha-bio@mail.ru. Rostov-on-Don, 344006, Russia, e-mail: iljukha-bio@mail.ru.
Рассматривается роль транскрипционного фактора HIF-1 (гипоксией индуцибельный фактор-1) в развитии клеточного ответа на воздействие гипоксии, приводятся данные о строении и структурной организации субъединиц HIF-1a и HIF-1в, входящих в состав функционально активного транскрипционного фактора HIF-1, приводится обзор HIF-1-регулируемых генов, индукция транскрипции которых в условиях наступившей гипоксии обеспечивает гомеостаз кислорода, освещаются различные пути активации и ингибирования HIF-1, а также характер функционирования и регуляция активности HIF-1 в условиях гипоксии и нормоксии.
Ключевые слова: гипоксия, транскрипционный фактор HIF-1, гомеостаз кислорода.
The article considers the role of the transcription factor HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) in the development of cellular response to the hypoxia effect. The data concerning the structure and organization of subunits HIF-1a and HIF-1fi composing functionally active transcription factor HIF-1 are analyzed. Also the article describes HIF-1-regulated genes, the induced expression of these genes maintains oxygen homeostasis under hypoxia condition. Various activation and inhibition HIF-1 pathways and the activity regulation of HIF-1 in the conditions of both hypoxia and normoxia are reviewed.
Keywords: hypoxia, transcription factor HIF-1, oxygen homeostasis.
Гомеостаз кислорода у млекопитающих жестко регулируется, так как необходимо поддерживать концентрацию кислорода для осуществления кислородза-висимых процессов и в то же время минимизировать образование его активных форм, чтобы снизить уровень окислительного повреждения биологических макромолекул. В состоянии гипоксии, при котором потребность в кислороде существенно превышает его имеющуюся концентрацию в организме, запускается сложный физиологический ответ, в результате которого увеличивается транспортная мощность крови, происходят изменения в клеточном метаболизме, увеличивается синтез ATФ в реакциях гликолиза и др. Гипоксией индуцибельный фактор-1 (HIF-1) является ключевым регулятором в развитии транскрипционного ответа на гипоксическое воздействие. Кроме того, этот фактор вовлечен в патофизиологию многих заболеваний человека, включая рак, инфаркт миокарда, ишемию и преэклампсию.
Строение HIF-1
HIF-1 был открыт Semenza и Wang [1], которые обнаружили гипоксия-респонсивный элемент (hypoxia responsive element, HRE) в районе 3'-конца энхантера гена эритропоэтина. В следующем году авторы оха-
рактеризовали HIF-1 как чувствительный к концентрации кислорода белок, который в условиях гипоксии связывается с большой бороздой ДНК, тем самым вызывая увеличение экспрессии регулируемого им гена [2].
Дальнейшие исследования показали, что белок HIF-1 является транскрипционным фактором, представляет собой гетеродимер, состоящий из одной конститутивно экспрессируемой ß-субъединицы и одной кислородзависимой а-субъединицы. Молекулярная масса а-субъединицы составляет 120^130 кДа; ß-субъединицы - 91^94 кДа. Обе субъединицы на N-конце имеют bHLH (спираль-петля-спираль) и PAS (PER-ARNT-SIM) домены [3]; а-субъединица специфично связывается с ß-субъединицей, образуя гетеродимер HIF-1, в то время как HIF-1ß может выступать в качестве партнёра для димеризации с другими транскрипционными факторами семейства белков bHLH-PAS. Домен bHLH играет важную роль в связывании транскрипционного фактора HIF-1 с HRE участком ДНК, а домен PAS участвует в образовании активного димера HIF-1 [4].
В индукции регулируемых HIF-1 генов участвуют два активирующих транскрипцию домена (TAD) а-субъединицы, которые служат участком для связывания различных коактиваторов транскрипции, таких
как CBP/p300 [5]. Гидроксилирование остатка аспара-гина (Asn 803) в C-терминальном домене TAD (C-TAD) HIF-1a при участии фермента FIH-1 (фактор ингибирования HIF-1) снижает транскрипционную активность HIF-1, так как происходит ослабление взаимодействия HIF-1 с CBP/p300 [6].
Стабильность HIF-1a регулируется энзимати-ческими модификациями домена кислородзависимой деградации (oxygen dependent degradation domain (ODDD)), благодаря которому в условиях нормоксии происходит быстрая деградация HIF-la. В то же время в HIF-lß данный домен отсутствует. Следует отметить, что транскрипция и трансляция HIF-la в условиях гипоксии и нормоксии идут одинаково, однако при нор-моксии время полужизни фактора составляет менее 5 мин. В условиях нормоксии происходит гидроксилиро-вание пролилгидроксилазами (PHD) двух остатков пролина (Pro402 и Pro564) в домене ODD HIF-la. Гид-роксилирование делает возможным связывание белка von Hippel Lindau (pVHL) и последующую протеасом-ную деградацию HIF-la [7]. Кроме того, внутри домена ODD находится остаток лизина (Lys532), который может быть ацетилирован ацетилтрансферазой ARDl (arrest defective protein l), что, вероятно, облегчает связывание pVHL с HIF-la (рис. l) [8].
HIF-la также обладает С-терминальной и N-терми-нальной последовательностями сигнала ядерной локализации (NLS), однако только С-терминальная NLS способствует импорту HIF-la в ядро [9].
•MLH PAS сую
aooD
..... I»« .... —
Рис. 1. Структура HIF-1a
В состав HIF-1a входят N-концевые домены bHLH (basic helix-loop-helix) и PAS (PER-ARNT-SIM). Два С-терминальных TAD домена служат для связывания с коактиваторами транскрипции. Также в HIF-1a имеется область, которая обеспечивает регуляцию кислородом активности транскрипционного фактора - домен кислородзависимой деградации (домен ODD, oxygen dependent degradation domain) [4].
Вскоре после HIF-1a был открыт второй транскрипционный фактор, индуцируемый гипоксией, - HIF-2a. По аминокислотной последовательности он на 48 % гомологичен HIF-1a, образует гетеродимер с HIF-1ß и связывается с гипоксия-респонсивным элементом (HRE) ДНК. Оба белка имеют сходную структуру. В 1998 г. был обнаружен третий HIF-белок - HIF-3a [4]. Вариантом сплайсинга HIF-3a является белок IPAS (ингибитор домена PAS). IPAS функционирует как фактор негативной регуляции HIF-1. Он связывается с N-концевым регионом HIF-1a и предотвращает его связывание с ДНК. Экспрессия IPAS наблюдается в
клетках мозжечка и роговицы глаза в том случае, если необходимо остановить индуцированный гипоксией ангиогенез [10].
Гены-мишени транскрипционного фактора Н1Р-1
HIF-1 регулирует транскрипцию, связываясь с кон-сенсусной последовательностью 5'-RCGTG-3' (где 'Я' соответствует пуриновому нуклеотиду) гипоксия-респонсивного элемента (НЯЕ) в области промотора или энхансера гена-мишени [11]. В настоящее время идентифицировано более 100 различных Н№-1-регулируемых генов, которые в условиях гипоксии обеспечивают гомеостаз кислорода [9]. Белок ШБ-1 участвует не только в физиологической адаптации к гипоксии, но также играет центральную роль в генетической регуляции патофизиологических процессов, таких как ишемия, воспаление и канцерогенез [4].
Транскрипционный фактор Н№-1 обеспечивает адаптацию к гипоксии двумя путями. С одной стороны, активируя различные гены, такие как регуляторы ангиогенеза (VEGF-A, ангиопоэтин-2), эритропоэза (эритропоэтин), тонуса сосудов (гемоксигеназа-1) и обмена железа (трансферрин), что способствует лучшему снабжению тканей кислородом [4]; с другой стороны, индуцируя Н№-1-зависимую генетическую регуляцию процессов, которые осуществляют адаптацию, и выживание клеток в условиях гипоксии. Одним из ярких примером является Н1Р-1-регулируемая перестройка обмена веществ и активация гликолиза путём увеличения экспрессии переносчиков глюкозы ^ЫЫ, Glut-3) и гликолитических ферментов (гексо-киназы-1 и -2, а также фосфофруктокиназы-1) [9]. Кроме того, Н№-1-индуцируемые гены играют решающую роль в регуляции клеточной пролиферации (IGF-2), апоптозе (№Х и ВМР3), клеточной миграции и инвазии (виментин, матриксная металлопротеиназа-2, рецептор хемокина СХСЯ4), а также в регуляции уровня рН (карбоангидраза IX) (таблица) [4].
Гены мишени HIF-1 [4]
Механизм регуляции Гены
Клеточная пролиферация IGF-2, TGF-а, TGF-ß3
Выживание клеток EPO, NOS-2,VEGF
Подвижность TGF-а, LRP-1
Клеточная адгезия MIC-2
Эритропоэз EPO
Ангиогенез VEGF, TGF-ß3, EG-VEGF
Тонус сосудов A1B-aдрепергический рецептор, гемоксигепaзa -1, NOS-2
Регуляция транскрипции DEC-1, NUR-77
Регуляция pH Кaрбоaпгидрaзa 9
Обмен железа Церулопгазмип, трaпсферрип, рецептор трaпсферрипa
Метаболизм глюкозы GLUT-1, GAPDH, PGK-1
Мыши, у которых ген HIF-1a не активен, так называемые HIF 1a --нокаутные мыши, являются нежизнеспособными. Их зародыши погибают уже на 11-й день эмбрионального развития. Для таких эмбрионов характерен фенотип с дефектами сердечно -сосудистой системы, а также с нарушениями образования нервной трубки. НГР-1а--эмбриональные стволовые клетки при гипоксическом воздействии наряду с пониженной пролиферацией показывают также более низкий уровень индукции экспрессии генов-мишеней HIF-1 [9]. Если мышь является гетерозиго-той, т. е. HIF-1+/-, животное развивается нормально, однако по сравнению с животными дикого типа его устойчивость к гипоксическому воздействию снижена. При продолжительной гипоксии у таких животных развивается гипертрофия правого желудочка сердца, лёгочная гипертезия, сниженное содержание эритроцитов, а также аномальные сосудистые новообразования [9].
Регуляция HIF-1a в условиях гипоксии
Уровень функциональной активности транскрипционного фактора HIF-1 преимущественно регулируется путём посттрансляционных модификаций субъединицы HIF-1a. Регуляция HIF-1a может отличаться в зависимости от типа клеток и характера стимула, а также происходить на уровне как транскрипции, так и трансляции.
В условиях нормоксии a-субъединица является нестабильной и быстро подвергается деградации [3, 4], которая контролируется путем гидроксилирования двух аминокислотных остатков пролина Pro402 и Pro564 в домене кислородзависимой деградации (ODD) HIF-1a [7]. Эти реакции катализируют специфичные пролилгидроксилазы (PHDs) HIF-1a. PHDs представляют собой 2-оксоглутарат-зависимые диок-сигеназы. Для проявления их каталитической активности необходимы ионы Fe2+. В организме человека имеются три различные PHDs HIF-1a. PHD-1 располагается исключительно в клеточном ядре, PHD-2 преимущественно локализована в цитоплазме, а PHD-3 встречается как в ядре, так и в цитоплазме [4].
Кислород взаимодействует с Fe2+, входящим в состав активного центра PHDs, причём один атом кислорода участвует в гидроксилировании пролина, в то время как второй - в превращении 2-оксоглутарата в сукцинат и CO2. Для протекания этой реакции необходим также аскорбат, который предотвращает спон-2+
танное окисление Fe2+.
Непосредственно после гидроксилирования по остаткам пролина происходит связывание HIF-1a с продуктом гена-супрессора опухолевого роста von Hippel-Lindau (pVHL), который служит субстратом для E3 -убиквитинлигазы. Это приводит к полиубик-витинилированию HIF-1a и его дальнейшей деградации при участии 26S протеасомы [7]. Остаток лизина (Lys532) может быть ацетилирован ацетилтрансфера-
зой ARD1, что, по всей видимости, облегчает связывание рУИЬ с Н№-1а [8].
Наряду с гидроксилированием по остаткам пролина в присутствии кислорода происходит также гидро-ксилирование остатка аспарагина-803 вблизи С-терминальной области (C-TAD) HIF-1a. Реакция катализируется ферментом аспарагинилгидроксилазой ИТ-1а известным как фактор ингибирования Н№ ^Щ). Вследствие этой модификации снижается эффективность связывания Н№-1а с коактиваторами транскрипции СВР/р300 [6].
Для активности PHDs и FIH необходим молекулярный кислород, следовательно, в условиях наступившей гипоксии Н№-1а не может подвергаться деградации. В настоящее время эти ферменты считаются физиологическими сенсорами кислорода. Гидро-ксилирующие ферменты помимо молекулярного ки-
т-1 2+
слорода также нуждаются в Fe для их каталитических реакций. Деградацию Н№-1а может вызывать присутствие хелаторов (десфериоксамин) или хлорида кобальта, влияние которого можно предположительно связать с заменой ионов железа ионами кобальта в активном центре PHDs [7]. Активные формы кислорода (АФК) также могут инактивировать гидро-ксилазы, вызывая их окислительную модификацию. С другой стороны, существуют определенные доказательства того, что низкая концентрация АФК может привести к стабилизации HIF-1 [12] (рис. 2).
Рис. 2. Регуляция HIF-1
В присутствии O2 происходит кислородзависимое гидроксилирование HIF-1a пролилгидроксилазами (PHDs). Далее происходит связывание HIF-1a с белком VHL, его убиквитинирование, что приводит к протеасомной деградации HIF-1a. Гипоксия или промежуточные метаболиты цикла трикарбоновых кислот могут ингибировать активность PHDs и тем самым стабилизировать HIF-1a. Стабилизированный HIF-1a взаимодействует с HIF-ip и другими коактиваторами транскрипции. Далее в ядре происходят связывание HIF-1 с HRE (Hypoxiа Responsive Element) и активация транскрипции регулируемых HIF-1 генов. Кроме того, активация MAPK (митогенактивируемая протеинкиназа) - или PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа) - сигнальных путей может вызывать независимую от кислорода индукцию HIF-1a [12].
Снижение концентрации кислорода ведет к инги-бированию механизма деградации НГР-1а. Такая индуцированная гипоксией стабилизация Н№-1а приводит к его транспорту в ядро, образованию гетероди-мера с НГР-1Р, а также к взаимодействию с коактива-торами транскрипции СВР/р300 и в конце концов к активации транскрипции регулируемых Н№-1 генов (рис. 2) [5, 9].
Индукция НГР-1а в условиях нормоксии
Наряду с индукцией активности Н№-1 в условиях гипоксии известен ряд механизмов, которые могут активировать Н№-1а в условиях нормоксии. В настоящее время обнаружены некоторые пептидные медиаторы, которые в условиях нормоксии могут вызывать повышение концентрации НГР-1а, а также увеличивать связывание Н№-1 с ДНК. К таким медиаторам принадлежат цитокины, факторы роста (эпидер-мальный фактор роста, EGF), некоторые гормоны, такие как инсулин, IGF-1и IGF-2, а также вазоактив-ные пептиды (ангиотензин II). Все упомянутые выше факторы вызывают индукцию Н№-1 также и в условиях гипоксии, что, вероятно, имеет большую функциональную значимость по сравнению с нормоксиче-ской индукцией [13].
В [14] показано, что выращивание гепатоцитов человека линии HepG2 на питательной среде, содержащей интерлейкин 1-р (ГЬ-1Р) и фактор некроза опухо-лей-а (Т№-а), приводит к повышению активности Н№-1. Интересно отметить тот факт, что ГЬ-1р при инкубации HepG2 в условиях нормоксии увеличивает не только концентрацию Н№-1, но и связывание транскрипционного фактора Н№-1 с ДНК. Т№-а также увеличивает связывание Н№-1 с НКБ, но не оказывает влияния на концентрацию Н№-1а в клеточном ядре. Однако ни ГЬ-1р, ни Т№-а не изменяют концентрации мРНК Н№-1а. Эффект IL-1P и Т№-а также был обнаружен и на других клеточных линиях.
Как правило, IL-1 и Т№-а запускают многочисленные внутриклеточные сигнальные пути, активируя фосфатидилинозитол-3-киназу (Р13К), р38 МАРК, р42/р44 МАРК, с-_|ип-киназу, ХЫК/стресс-активи-руемую протеинкиназу (SAPK), а также ядерный фактор кВ (№-кБ). Было показано, что блокада МАРК-киназного сигнального пути приводит к нарушению взаимодействия HIF-1 с коактиватором р300 [13].
Исследования [15] на клетках ткани лёгкого человека (А549) показали, что ГЬ-1р влияет на уровень функциональной активности Н№-1а двумя путями. С одной стороны, ГЬ-1р стимулирует продукцию Н№-1а посредством активации №-кВ по пути PI3K/Akt/mTOR, с другой - снижает уровень У^-зависимой деградации Н№-1а. NF-кБ играет центральную роль в регуляции опухолевого роста, Н№-1а является важным объектом в поиске подходов терапии рака.
На первичной культуре клеток почки человека в [14] было показано, что ингибирование Р13К приводит к снижению вызываемой ГЬ-1р стабилизации Н№-
1а [13]. Для индуцированного TNF-a накопления HIF-1а в нормоксических условиях также необходима Р13К-зависимая активация NF-kB [14, 15].
В заключении следует отметить, что в противоположность индуцированной гипоксией стабилизации при нормоксии активация HIF-1 зависит от типа клетки.
Выводы
Значительные достижения последних десятилетий в понимании молекулярного механизма адаптации организма к гипоксии привели к выяснению природы кислородных сенсоров, которые передают информацию об изменении концентрации кислорода в клетке ключевым транскрипционным регуляторным белкам (HIF-1a и HIF-2a). Однако множество вопросов всё ещё остаётся без ответа, включая функции HIF-3a, взаимодействие между HIF-1a и HIF-2a, тонкую регуляцию процессов, идущих при участии HIF, PHDs, FIH-1 и VHL, а также роли активных форм кислорода в активации HIF. Эти процессы имеют прямое отношение к развитию болезней человека. Вероятно, их глубокое понимание окажет помощь при поиске новых эффективных методов коррекции острых и хронических гипоксических состояний.
Литература
1. Semenza G.L., Wang G.L. A nuclear factor induced by hy-
poxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation // Molecular and Cellular Biology. 1992. № 12. P. 5447-5454.
2. Wang G.L., Semenza G.L. General involvement of hypoxia-
inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993. № 90. Р. 4304-4308.
3. Wang G.L., Semenza G.L. Purification and characterization
of hypoxia-inducible factor 1 // The J. of Biological Chemistry. 1995. № 270. Р. 1230-1237.
4. Semenza G.L. Hypoxia-inducible factors in physiology and
medicine // Cell. 2012. № 148. Р. 399-408.
5. Jiang B.H., Zheng J.Z., Leung S.W., Roe R., Semenza G.L.
Transactivation and inhibitory domains of hypoxia-inducible factor 1alpha. Modulation of transcriptional activity by oxygen tension // The J. of Biological Chemistry. 1997. № 272. Р. 19253-19260.
6. Lando D., Peet D.J., Whelan D.A., Gorman J.J., Whitelaw
M.L. Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch // Science. 2002. № 295. Р. 858-861.
7. Ivan M., Kondo K., Yang H., Kim W., Valiando J., Ohh M.,
Salic A., Asara J.M., Lane W.S. Kaelin W.G. HIF alpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxyla-tion: implications for O2 sensing // Science. 2001. № 292. Р. 464-468.
8. Jeong J.W., Bae M.K., Ahn M.Y., Kim S.H., Sohn T.K.,
Bae M.H., Yoo M.A., Song E.J., Lee K.J., Kim K.W. Regulation and destabilization of HIF-1alpha by ARD1-mediated acetylation // Cell. 2002. № 111. Р. 709-720.
9. Weidemann A., Johnson R.S. Biology of HIF-1alpha // Cell Death and Differentiation. 2008. № 15. Р. 621-627.
10. Makino Y., KanopkaA.,Wilson W.J., TanakaH., PoellingerL.
Inhibitory PAS domain protein (IPAS) is a hypoxia-
inducible splicing variant of the hypoxia-inducible factor-3a locus // The J. of Biological Chemistry. 2002. № 277. Р. 32405-32408.
11. Semenza G.L., Jiang B.H., Leung S.W., Passantino R.,
Concordet J.P., Maire P., Giallongo A. Hypoxia Response Elements in the Aldolase A, Enolase 1, and Lactate Dehydrogenase A Gene Promoters Contain Essential Binding Sites for Hypoxia-inducible Factor 1 // The J. of Biological Chemistry. 1996. № 271. Р. 32529-32537.
12. Denko N.C. Hypoxia, HIF1 and glucose metabolism in the solid
tumor // Nature Reviews Cancer. 2008. № 8. Р. 705-713.
13. Hellwig-Bürgel T., StiehlD.P., Katschinski D.M., Marxsen J.,
Kreft B., Jelkmann W. VEGF production by primary human
Поступила в редакцию_
renal proximal tubular cells: requirement of HIF-1, PI3-kinase and MAPKK-1 signaling // Cellular Physiology and Biochemistry. 2005. № 15. P. 99-108.
14. Hellwig-Burgel T., Rutkowski K., Metzen E., Fandrey J.,
Jelkmann W. Interleukin-1p and tumor necrosis factor-a stimulate DNA binding of hypoxia-inducible factor-1 // Blood. 1999. № 94. P. 1561-1567.
15. Jung Y.J., Isaacs J.S., Sunmin L., Trepel J., Neckers L. IL-ip
mediated up-regulation of HIF-la via an NFkB/COX-2 pathway identifies HIF-1 as a critical link between inflammation and oncogenesis // The FASEB J. 2003. № 17. P. 2115-2117.
23 апреля 2014 г.
