CC BY
26
Экология
УДК 579.22:[661.691.1+628.9] DOI: 10.24412/1728-323X-2023-2-5-8
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХЛОРЕЛЛЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОЕДИНЕНИЙ СЕЛЕНА И СВЕТОДИОДНОГО ДОСВЕЧИВАНИЯ
О. Е. Князева, старший преподаватель ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет архитектуры и строительства», kolchina_o.e@mail.ru, г. Пенза, Россия
Аннотация. Особый интерес представляет микроводоросль хлорелла, так как она является неприхотливой фотоавтотрофной культурой и благодаря свету, необходимому для ее жизнедеятельности, способна быстро расти. Продукция метаболитов хлореллы зависит от характеристик источника света, а решающее значение для оптимального культивирования имеет создание фотобиореактора, разработка энергосберегающей технологии. Поскольку хлорелла является фотоавтотрофной культурой, для ускорения процесса культивирования которой необходим свет, влияющий на ее рост и метаболизм, нами были определены его источники, необходимые для создания оптимальной энергосберегающей технологии, способствующей ускорению процесса культивирования микроводоросли. Изучались параметры культивирования микроводорослей: различные типы фотобиореакто-ров, источники света, режимы освещения. В результате проведенных экспериментов было выявлено, что наиболее перспективным источникам является облучение красным светом (660 нм), который оказал наибольшее стимулирующее действие на продукцию биомассы хлореллы, что связано с большей активацией системы фитохромов. Наименьшие темпы прироста биомассы наблюдались при освещении синего света. Хлореллу культивировали в питательной среде с добавлением L-селеноцистина (0,25, 0,025 и 0,0025 мг селена /л) и оценивали антиоксидантную активность аминокислот кулонометрически. При добавлении L-селеноцистина в концентрации 0,25 мг Se/л общее содержание аминокислот в биомассе хлореллы увеличивалось на 23 %, а антиоксидантная аминокислотная активность увеличивалась на 20 %. При внесении L-селеноцистина (0,025 мг Se/л) на 6 % увеличивалось общее содержание аминокислот. В концентрации 0,0025 мг Se/л селеноцистин не оказывал существенного влияния на продукцию аминокислот хлореллы. Дозозависимая стимуляция L-селеноцистином продукции аминокислот хлореллы, а также отсутствие способности ингибировать их биосинтез создает перспективы использования L-селеноцистина как потенциального источника микроэлемента селена для биофортификации.
Annotation. Of particular interest is the chlorelk microalgae, as it is an unpretentious photoautotrophic culture and, thanks to the light necessary for its vital activity, is able to grow rapidly. The production of chlorelk metabolites depends on the characteristics of the light source, and the creation of a photo-bioreactor and the development of energy-saving technology are crucial for optimal cultivation. Since chlorella is a photoautotrophic culture, which requires light to accelerate the cultivation process, affecting its growth and metabolism, we have identified its sources necessary to create an optimal energy-saving technology that accelerates the cultivation of microalgae. The parameters of microalgae cultivation were studied: various types of photobioreactors, light sources, lighting modes. As a result of the experiments, it was revealed that the most promising sources are irradiation with red light (660 nm), which had the greatest stimulating effect on the production of chlorella biomass, which is associated with greater activation of the phytochrome system. The lowest rates of biomass growth were observed when blue light was illuminated. Chlorella was cultured in a nutrient medium with the addition of L-selenocystine (0.25, 0.025 and 0.0025 mg selenium/l) and the antioxidant activity of amino acids was evaluated coulometrically. When L-selenocystine was added at a concentration of 0.25 mg Se/l, the total amino acid content in chlorella biomass increased by 23 %, and the antioxidant amino acid activity increased by 20 %. When L-selenocystine (0.025 mg Se/l) was added, the total amino acid content increased by 6 %. At a concentration of 0.0025 mg Se/l, selenocystine had no significant effect on the production of chlorella amino acids. The dose-dependent stimulation of chlorella amino acid production by L-selenocystine, as well as the lack of the ability to inhibit their biosynthesis, creates prospects for the use of L-selenocystine as a potential source of the trace element selenium for biofortification.
Ключевые слова: микроводоросль, хлорелла, досветка, соединения селена, светодиоды, культивирование.
Keywords: microalgae, chlorella, additional illumination, selenium compounds, LEDs, cultivation.
Введение
Зеленые водоросли в естественных условиях испытывают воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды [1]. Однако в процессе эволюции с изобретением фотобиореакторов стало возможным контролировать и регулировать воздействие факторов. В настоящее время стал актуальным вопрос об интенсификации процесса культивирования одноклеточных водорослей с целью их дальнейшего использования в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и энергетичес-
кой промышленности [2]. Широкомасштабное промышленное производство биомассы микроводорослей, а также расширение их спектра использования, требуют поиска высокопродуктивных штаммов и оптимизации условий для возможности их культивирования.
Цель данного исследования: проанализировать эффективность применения досвечивания светодиодными источниками процесс культивирования микроводоросли хлорелла, а также исследование влияния соединений селена на аминокислотный состав биомассы хлорелла.
400 I
5001
6001
7001
А А Полный спектр R = 70,9 %, В = 20,8 %
l,0l 1,0 - *
1U
380 460 540 630 700 780
Синий 440 нм
Красный 660 нм
Светодиод полного спектра: 70,9 % красного, 20,8 % синего, 8,5 % других длин волн (400—840 нм)
Рис. 1. Спектральные характеристики используемых светодиодов
Модели и методы определялись задачами и ц елями исследования. В связи с этим использовались следующие методы:
— теоретического уровня: анализ и изучение литературных источников по данной проблеме, законодательных актов среды;
— эмпирического уровня: наблюдение,
— практического уровня: эксперимент, разработка рекомендаций по интенсификации процесса культивирования микроводоросли хлореллы.
В работе использовали планктонный штамм одноклеточной водоросли Chlorella vulgaris ИФР № C-111. Растворы для питательной среды готовились согласно ТУ 9291-00-12001826—05 [3]. Маточную культуру суспензии хлореллы вносили в термостатируемый биореактор объемом 6 л в количестве 20 % от объема емкости [4]. Оставшийся объем заполняли питательной средой. Микроводоросль была выращена на четырех световых режимах: красном (6 светоиодов; 660 нм), синем (6 светодиодов; 440 нм), красно-синем (3:3 светодиодов соответственно; 440 нм, 660 нм), «полном спектре» (6 фитосветодиоидов; 400—480 нм, 600—780 нм).
Культивирование хлореллы проводили в фо-тобиореакторе в течение 3—4 последовательных циклов. Каждый цикл включал 10 ч освещения свето диодами и 14 ч — темновой период [5].
Для оценки накопления биомассы ежедневно проводили подсчет клеток в гемоцитометре и измеряли оптическую плотность на фотометре КФК-3-01 при 400 нм. Концентрацию суспензии хлореллы (N) в клетках на 1 мл рассчитывали по формуле N = kD, где N — количество клеток, k — коэффициент пропорциональности (1 134 000), D — оптическая плотность.
В работе использовали: набор белковых аминокислот (Sigma-Aldrich LAA21) и L-селеноцис-тин, синтезированный по методике 1. Планктонный штамм микроводоросли Chlorella vulgaris ИФР № C-111 культивировали в фотобиореак-торе (объем 1 л). L-селеноцистин добавляли в биореактор на 2 сутки культивирования в растворе 0,1 М HCl в трех концентрациях из расчета 0,25, 0,025 и 0,0025 мг селена/л культуральной жидкости.
В контрольные пробы селеноцистин не добавляли. На четвертые сутки биомассу хлореллы отделяли центрифугированием (3000 об. мин, 3 мин) и высушивали в сушильном шкафу (55 °C). Аминокислотный состав сухой биомассы определяли после кислотного гидролиза (около 0,1 г биомассы, 10 мл 6М HCl, 16 ч, 110 °С). Гидролизаты обрабатывали фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) в щелочной среде и анализировали полученные ФТК-производные методом капиллярного элект-
Таблица 1
Варианты освещения при выращивании хлореллы
№ варианта Светодиоды (LED) Длина волны, нм Ширина спектра, нм Световой поток, лм Световая отдача, лм/Вт Мощность, Вт (Вт/л)
1 6 красных светодиодов 3GR-R 650—670 20 25—35 29,8—41,7 6 (1)
2 6 синих светодиодов 430—450 20 15—25 12,6—21 6 (1)
3 3 красных + 3 синих светодиодов 6 (1)
4 светодиод полного спектра Параметры 20—30 16,8—25,2 6 (1)
(Full spectrum) см. рис. 1
20,4 19,2 18 16,8 15,6 14,4 13,2 12 10,8 9,6 8,4 7,2 6
4,8 , 3,6 1 2,4 (С- ' 1,2 -
Красный свет (количество клеток) среднее значение Синий свет (количество клеток) среднее значение Красно-синий свет (количество клеток) среднее значение „ - ' Полный спектр (количество клеток) среднее значение и "
0
0,84
1,68
2,52 Время, сутки
3,36
4,2
Рис. 2. Накопление биомассы хлореллы при различных вариантах освещения
рофореза («Капель 105 М», детектор спектро-фотометрический, 254 нм). Антиоксидантную активность аминокислот определяли на кулоно-метрическом анализаторе «Эксперт-006». Электрогенерацию брома проводили из водных 0,2 М растворов КВг в 0,1 М H2SO4 при силе тока 5,0 мА. Антиоксидантную активность аминокислот определяли, как количество электричества (Кл), затраченного на титрование 10 мкмоль вещества.
Результаты и обсуждение
На первом этапе исследований были изучены процессы накопления биомассы в зависимости от режима освещения, благодаря фотоавтотроф-ной способности микроводоросли, способной утилизировать световую энергию, аккумулировать органические и неорганические соединения.
Так как для зеленых растений эффективность фотосинтеза зависит от длины волны падающего излучения, в основе выбора длин волн источников освещения зеленых растений лежит представление о важности двух полос — в синей (440 нм) и красной областях (660 нм) спектра, соответствующих максимумам поглощения каротиноидов и хлорофиллов, соответственно. Зеленый свет имеет низкую эффективность из-за высокого отражения его хлорофиллом.
Для определения накопления биомассы хлореллы в качестве стандартного метода использовали прямой подсчет клеток в камере Горяева и косвенный оптический метод (измерение поглощения при 400 нм на КФК). В общем, рост хлореллы согласуется со стандартной кривой роста периодической культуры микроорганизмов. Отмечаются лаг-фаза (привыкание), фаза роста и достижение стационарной фазы. Показано, что прирост оптической плотности согласуется с увеличением числа клеток. Данный метод более
предпочтителен, так как не требует долгих и утомительных операций и особенно удобен для оценки скорости роста, когда не требуются абсолютные значения концентрации клеток.
Обнаружено, что спектральный состав света оказывал влияние на процессы роста и развития хлореллы (рис. 2).
Растения обладают уникальными способно -стями аккумуляции селена и его превращения в селенсодержащий белок как более предпочтительную форму снабжения организма селеном. Известно, что биологическое действие селена до-зозависимо. При низких концентрациях селен — один из ключевых элементов функционирования антиоксидантной системы, при повышенных концентрациях селен является сильнейшим токсикантом, способен генерировать активные формы кислорода, вызывать повреждение ДНК и гибель клеток [6].
Добавление селеноцистина в питательную среду при выращивании хлореллы способствует значительному (на 23 %) увеличению общего количества аминокислот только в опытах с наиболее высокой концентрацией селена 0,25 мг Зе/л (рис. 3).
500
5 400
я я 300 11
200
I 100
о
Контроль Sec Sec Sec Sec Sec Sec 0,25 мг/л 0,025 мг/л 0,0025 мг/л Se Se Se
Рис. 3. Влияние селеноцистина на общую продукцию аминокислот в биомассе хлореллы
При более низких концентрациях селено-цистина (0,025 мг Se/л) суммарное содержание аминокислот увеличивалось лишь на 6 %, эффекта внесения L-селеноцистина в концентрации 0,0025 MrSe/л не отмечалось.
Заключение
В результате проведенных экспериментов было выявлено, что наиболее активный рост биомассы с 5—7-кратным увеличением числа клеток (от 3—5 до 25 х 106) наблюдался при освещении светодиодами красного света и — full spectrum. Полный спектр — это пурпурные LED с соотношением красного и синего света (70:20). Наименьшие темпы прироста биомассы наблюдали при освещении синим светом. Вероятно, с точки зрения количества фотонов, поглощаемых хлореллой в процессе культивирования, наиболее эффективным является красный свет (660 нм), что связано с большей активацией системы фитохромов при
освещении с большей долей красного излучения относительно синего.
Таким образом, облучение красным светом (660 нм) явно оказывало стимулирующее действие на продукцию биомассы хлореллы.
Добавление Ь-селеноцистинав концентрации 0,25 мг Зе/л при культивировании микроводоросли хлорелла способствует активации азотистого обмена: увеличению общего количества аминокислот (на 6—23 %), в т. ч. незаменимых аминокислот (на 4—30 %), и аминокислот-анти-оксидантов в ее биомассе. Существенной разницы между контрольным и опытными вариантами с Ь-селеноцистином 0,0025 мг Зе/л по содержанию аминокислот не обнаружено. Добавление Ь-селеноцистина не выявило угнетающего воздействия на микроводоросль хлореллы. Ь-селе-ноцистин может использоваться как источник микроэлемента селена для биофортификации микроводорослей.
Библиографический список
1. Barkia I., Saari N., Manning S. R. Microalgae for High-Value Products Towards Human Health and Nutrition. Mar Drugs. 2019. No. 17. Р. 1—29. pii: E304. doi: 10.3390/md17050304.
2. Danesi E. D. G., Rangel-Yagui C. O., Carvalho J. C. M., Sato S. Effect of reducing the light intensity on the growth and production of chlorophyll by Spirulina platensis. Biomass Bioenergy. 2004. Vol. 26. № 4. Р. 329—335. doi: 10.1016/S0961-9534(03)00127-2.
3. ТУ 9291-003-12001826—05. Техническая инструкция на производство суспензии хлореллы — альголизанта водоемов. — Пенза: НУНИИ «Альгобиотехнологии», 2005.
4. Сосновский Е. С., Князева О. Е., Кузнецова А. В., Полубояринов П. А. Биореактор для выращивания хлореллы и исследования влияния облучения монохроматическим светом // Образование и наука в современном мире. Инновации. — 2022. — № 2 (39). — С. 60—66.
5. Кузнецова А. В., Сосновский Е. С., Князева О. Е., Полубояринов П. А. Влияние различных режимов облучения на накопление белковых фракций в клетках микроводоросли Chlorella vulgaris // Образование и наука в современном мире. Инновации. — 2023. — № 2 (45). — С. 109—118.
6. Полубояринов П. А., Моисеева И. Я., Микуляк Н. И., Голубкина Н. А., Каплун А. П. Новый синтез энантиоме-ровцистина и селеноцистина и их производных // Известия высших учебных заведений. Серия: Химия и химическая технология. — 2022. — № 65 (2). — С. 19—29.
INTENSIFICATION OF THE CHLORELLA CULTIVATION PROCESS USING SELENIUM COMPOUNDS AND ILLUMINATION
O. E. Knyazeva, Senior Lecturer at Penza State University of Architecture and Construction, kolchina_o.e@mail.ru, Russia, Penza References
1. Barkia I., Saari N., Manning S. R. Microalgae for High-Value Products Towards Human Health and Nutrition. Mar Drugs. 2019. No. 17. P. 1-29. pii: E304. doi: 10.3390/md17050304.
2. Danesi E. D. G., Rangel-Yagui C. O., Carvalho J. C. M., Sato S. Effect of reducing the light intensity on the growth and production of chlorophyll by Spirulina Platensis. Biomass Bioenergy. 2004. No. 26 (4). P. 329—335. doi: 10.1016/S0961-9534(03)00127-2.
3. TU 9291-003-12001826—05. Tekhnicheskaya instrukciya na proizvodstvo suspenzii hlorelly—al'golizanta vodoemov. Penza, NUNII "Al'gobiotekhnologii". 2005.
4. Sosnovskiy E. S., Knyazeva O. E., Kuznetsova A. V., Poluboyarinov P. A. Bioreaktor dlya vyrashchivaniya hlorelly i issle-dovaniya vliyaniya oblucheniya monohromaticheskim svetom [Bioreactor for growing chlorella and studying the effects of monochromatic light irradiation]. Obrazovanie i nauka v sovremennom mire. Innovacii. 2022. No. 2 (39). P. 60—66 [In Russian].
5. Kuznetsova A. V., Sosnovskiy E. S., Knyazeva O. E., Poluboyarinov P. A. Vliyanie razlichnyh rezhimov oblucheniya na na-koplenie belkovyh frakcij v kletkah mikrovodorosli Chlorella vulgaris [The effect of different irradiation modes on the accumulation of protein fractions in the cells of the microalgae Chlorella vulgaris]. Obrazovanie i nauka v sovremennom mire. Innovacii. 2023. No. 2 (45). P. 109—118 [In Russian].
6. Poluboyarinov P. A., Moiseeva I. Ya., Mikulyak N. I., Golubkina N. A., Kaplun A. P. Novyj sintez enantiomerov cistina i selenocistina i ih proizvodnyh. Izvestiya vysshih uchebnyh zavedenij. [New synthesis of enantiomers of cystine and seleno-cystin and their derivatives. News of higher educational institutions]. Seriya: Himiya i himicheskaya tekhnologiya. 2022. No. 65 (2). P. 19—29 [In Russian].
