CC BY
70
МЕДИЦИНА И ЗДРАВООХРАНЕНИЕ
УДК 615.322: 574-62
ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКОВ АЗОТА НА НАКОПЛЕНИЕ И БЕЛКОВОСТЬ БИОМАССЫ CHLORELLA VULGARIS IPPAS С-2019
А. В. Митишев1, Е. Ф. Семенова2, Е. Е. Курдюков3, Я. П. Моисеев4, П. А. Полубояринов5, И. Я. Моисеева6, А. Лабес7
1,з,4,5,бпензенский государственный университет, Пенза, Россия
2Медицинская академия им. С. И. Георгиевского Крымского федерального университета им. В. И. Вернадского, Симферополь, Республика Крым, Россия
7Университет прикладных наук, Фленсбург, Германия
1Span2361@rambler.ru
2sef1957@mail.ru 3e.e.kurdyukov@mail.ru 4Moiseev_yaha@mail.ru 589502304876@yandex.ru 6moiseeva_pharm@mail.ru 7antje.labes@hs-flensburg.de
Аннотация. Использование различных источников азота в среде культивирования существенно влияло на уровень накопления биомассы хлореллы и содержание белка в ней. Наличие аммония сульфата в среде приводило к медленному росту плотности клеток хлореллы и низкому содержанию белка в биомассе глубинной культуры. Напротив, добавление в качестве источника азота водного экстракта льняного жмыха значительно увеличивало количество клеток до 8,12 • 106 КОЕ/мл на 10-е сутки и содержание белка в биомассе до 64,61 %. По суммарному содержанию незаменимых аминокислот образцы, выращенные на средах с органическими источниками азота, значительно превосходили образцы, выращенные на неорганических источниках азота, особенно по содержанию фенилаланина (0,90-1,10 % и 0,29-0,44 %, соответственно), валина (2,17-2,65 % и 1,39-1,64 %, соответственно) и треонина (2,03-2,52 % и 0,90-1,57 %, соответственно).
Ключевые слова: Chlorella vulgaris IPPAS C-2019, условия культивирования, питательная среда, источники азота, биомасса, белок хлореллы, аминокислотный состав, незаменимые аминокислоты
© Митишев А. В., Семенова Е. Ф., Курдюков Е. Е., Моисеев Я. П., Полубояринов П. А., Моисеева И. Я., Лабес А., 2021
Для цитирования: Митишев А. В., Семенова Е. Ф., Курдюков Е. Е. [и др.]. Влияние источников азота на накопление и белковость биомассы Chlorella vulgaris IPPAS C-2019 // Вестник Пензенского государственного университета. 2021. № 4. С. 123-129.
Введение
Одноклеточные водоросли занимают важное место в питании человека и животных, поскольку они богаты аминокислотами, сложными углеводами, минералами, жирами (в составе - до 85 % ненасыщенных жирных кислот), нуклеиновыми кислотами, в частности РНК (до 10 %), ДНК (до 3 %); хлорофиллом, витаминами, в том числе каротиноидами; ферментами, включая пепсин; уникальным фактором роста хлореллы и др. [1-5]. Однако производственные затраты являются самой большой проблемой при культивировании водорослей. Факторами, влияющими на рост и накопление биологически активных соединений, являются состав питательной среды, освещенность, фотопериод, температура, источники азота, источники углерода, количество инокулята, аэрация, кислород, CO2, рН. В зависимости от состава среды количество этих соединений может варьировать, например: содержание белка - от 8 до 69 %, углеводов - от 6 до 37 %, жиров - от 4 до 85 % [6]. Азот, в частности, является важнейшим макроэлементом, необходимым для синтеза нуклеиновых кислот, аминокислот, белков, пигментов. Многие одноклеточные водоросли могут утилизировать различные формы азота. Известно, что скорость роста и химический состав клеток водорослей зависят от концентрации соединений азота в культуральной среде. Исследования показывают, что азотное голодание в культуральной среде замедляет скорость роста и снижает синтез белка за счет увеличения содержания липидов или углеводов [7].
Хлорелла, выращенная на стандартных средах, содержит 40-55 % белка, до 20 % углеводов, 5-15 % липидов и до 10 % минеральных веществ [8-10]. Качество белка C. vulgaris эквивалентно или даже превосходит качество других белков растительного происхождения, дрожжей, соевой муки и молока [11-13]. Качество белка определяется в основном его аминокислотным составом [14]. В составе хлореллы присутствуют все незаменимые аминокислоты - треонин, валин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, триптофан, гистидин и аргинин [15, 16]. Аминокислотный состав белка C. vulgaris полностью соответствует стандарту, предложенному для питания человека Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), а также Продовольственной и сельскохозяйственной организацией (ФАО) [17, 18]. Согласно данным авторов Lafargaa T. et al., аспарагиновая и глутаминовая кислоты составляют большую часть от общего количества их аминокислотной фракции [19]. Аминокислоты, содержащиеся в лекарственном растительном сырье, играют важную роль в биосинтезе биологически активных соединений, способствуют снижению патологических и повреждающих эффектов, обусловленных окислительными воздействиями различной природы [20]. В настоящее время исследования влияния условий культивирования сосредоточены на увеличении содержания липидов как биотоплива, при этом относительно мало изучаются факторы, влияющие на накопление и качественные показатели белка. В связи с этим целью настоящего исследования является изучение влияния различных источников азота на рост культуры и содержание аминокислот в биомассе штамма хлореллы С-2019. Для достижения данной цели были поставлены задачи: подбор оптимального источника азота для накопления биомассы и повышения белкового синтеза; изучение качественного и количественного состава белка хлореллы.
Цель. Изучение влияния различных источников азота на рост глубинной культуры и содержание аминокислот в биомассе хлореллы.
Материалы и методы
Объектом исследования являлась биомасса штамма IPPAS C-2019 Chlorella vulgaris Beyerinck (авторы Семенова Е. Ф., Преснякова Е. В., Шпичка А. И., Митишев А. В., 2016), который является мутантом, селекционированным в лаборатории Пензенского госу-дарственного университета из популяции штамма Chlorella vulgaris BIN (автор Богданов Н. И., 1999).
Культивирование штамма IPPAS C-2019 проводили полунепрерывным глубинным способом на жидких питательных средах и с применением перемешивающего устройства -качалки LS 110 при 170 об/мин при естественном и искусственном освещении с помощью люминесцентных ламп с длиной волны от 400 до 700 нм и интенсивностью освещения 6 000 люкс на расстоянии 5 см от культуры, 16-часовом фотопериоде (16 : 8) и температуре 26 ± 2 °С, исходном рН среды 7,0 и при внесении 20 % (по объему) инокулята в течение 14 дней. Использовали среду следующих составов, г/л: MgSO4X7^O - 2,5; KH2PO4 - 1,25; FeSÜ4 X7H2O - 0,003; ЭДТА - 0,037; в качестве источников азота - калия нитрат или аммония сульфат, или натрия нитрат, или экстракт соевой муки, или экстракт льняного жмыха в концентрациях 15 ммоль/л; и 1 мл раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов, г/л: H3BO3 - 2,860; МПО2Х4Н2О - 1,810; ZnSÜ4X7H2Ü - 0,222; M0O3 - 0,017; NH4VO3 - 0,023; CUSO4X5H2O - 0,00001; Co(NO3)2X4H2O - 0,146; KJ - 0,083; NaWO4xH2O - 0,033; NiSO4(NH4)SO4X6H2O - 0,198. Раствор микроэлементов содержит незначительное количество азота, которое оказывает минимальное влияние на проведение эксперимента.
Плотность клеточной суспензии определяли ежесуточно нефелометрическим методом с использованием фотоколориметра КФК-3.01 (в качестве контроля служила прозрачная жидкая питательная среда для культивирования хлореллы) и в камере Горяе-ва [21]. Мутность суспензии измеряли при длине волны 500 нм (зеленый светофильтр) в 11 последовательных разведениях. Отделение биомассы проводили центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин.
Общее содержание белка в биомассе хлореллы определяли методом Къельдаля3. Аминокислотный состав анализировали методом капельного электрофореза в системе «КАПЕЛЬ®-105М» («Люмэкс», Россия) [22]. Для определения аминокислот биомассу хлореллы подвергали кислотному гидролизу и для каждого образца регистрировали не менее двух электрофореграмм. Статистическую обработку результатов исследования выполняли согласно ГФ РФ XIV [23].
Обсуждение результатов
Для выращивания штамма Chlorella vulgaris IPPAS C-2019 использовались различные источники азота, что приводило к различному выходу биомассы и темпам роста. Различия в темпах роста плотности культуры отчетливо наблюдали на третий день культивирования. На рис. 1 представлены кривые роста штамма IPPAS C-2019 на пяти средах с различными источниками азота. Рост C. vulgaris на среде с использованием аммония сульфата в качестве источника азота был подавлен на четвертые сутки после инокуляции. По мере увеличения продолжительности культивирования плотность клеток существенно не увеличивалась, а на восьмые сутки наблюдалось значительное снижение.
Содержание белка в конечной биомассе хлореллы было значительно ниже, чем у других образцов (рис. 2).
3 ГОСТ Р 51417 - 99. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и вычисление массовой доли сырого протеина, метод Къельдаля. М., 2002. 8 с.
При использовании в качестве источников азота водных экстрактов соевой муки и льняного жмыха интенсивность роста и накопление биомассы C. vulgaris были выше, чем у остальных образцов, а максимальные значения плотности суспензии достигали 6,85 • 106 клеток/мл и 8,12 • 106 клеток/мл на 10-е сутки. При этом содержание белка в данных образцах было высоким. По ростовым показателям, включая накопление биомассы, образцы хлореллы, выращенные с использованием водного экстракта льняного жмыха, превосходили образцы, выращенные с водными экстрактами соевой муки (см. рис. 1).
Рис. 1. Кривые роста глубинных культур штамма C. vulgaris IPPAS C-2019 на средах с различными источниками азота
Калия нитрат Аммония сульфат Натрия нитрат Соевая мука Льняной жмых
Источники азота
Рис. 2. Влияние источников азота на содержание белка в биомассе хлореллы IPPAS С-2019, полученной при культивировании на средах с различными источниками азота
Согласно полученным данным, образцы альгомассы IPPAS C-2019, выращенные на средах с различными источниками азота, как правило, содержали большое количество белка, за исключением варианта с аммонием сульфата в качестве единственного источника азота в питательной среде (см. рис. 2). При использовании в качестве источника азота аммония сульфата наблюдали наименее выраженное увеличение плотности культуры и минимальное содержание белка. Напротив, добавление в качестве источника азота экстракта льняного жмыха увеличивало интенсивность роста и содержание белка в биомассе изучаемого штамма (см. рис. 2).
Полученные данные наглядно демонстрируют влияние источника азота на общее содержание белка глубинной культуры хлореллы. Белок хлореллы, выращенной на средах с добавление экстрактов соевой муки и льняного жмыха, характеризовался высоким содержанием аминокислот, в том числе незаменимых. В биомассе штамма IPPAS C-2019 в результате кислотного гидролиза идентифицировали 14 аминокислот, из которых семь являются незаменимыми: лизин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин, валин, треонин. Суммарно доля обнаруженных аминокислот в белке хлореллы составила от 7,81 до 25,5 %■
Выводы
Использование различных источников азота в среде культивирования существенно влияло на уровень накопления биомассы хлореллы и содержание белка в ней. Негативное влияние аммония, как источника, хорошо известно и было описано как критический фактор при культивировании хлореллы: было показано, что избыток внутриклеточного иона аммония или аммиака ингибирует образование АТФ в хлоропластах. Наличие аммония сульфата в среде приводило к медленному росту плотности клеток хлореллы и низкому содержанию белка в биомассе глубинной культуры. Напротив, добавление в качестве источника азота водного экстракта льняного жмыха значительно увеличивало накопление биомассы хлореллы и содержание белка в ней.
В биомассе штамма IPPAS C-2019 после кислотного гидролиза идентифицировали 14 аминокислот, из которых семь являются незаменимыми: лизин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, метионин, валин, треонин.
Можно предположить, что значительное влияние органических источников азота на ростовые показатели и содержание метаболитов, скорее всего, связано с тем, что эти источники также содержат другие питательные вещества (углерод, микро- и макроэлементы, источник СО2).
Несмотря на многочисленные работы, в которых был продемонстрирован гетеротрофный рост для хлореллы на различных (органических) источниках азота [24], выбор оптимальных сельскохозяйственных побочных продуктов в качестве источника питательных веществ для выращивания микроводорослей расширяет возможности этого перспективного возобновляемого источника пищевых добавок и кормовых веществ.
Список литературы
1. Williams P. J. L., Laurens L. M. L. Microalgae as biodiesel & biomass feedstocks: review & analysis of the biochemistry, energe tics & economics // Energy Environ. Sci. 2010, № 3. Р. 554-590.
2. Guccione A., Biondi N., Sampietro G. [et al-]- Chlorella for protein and biofuels: From strain selection to outdoor cultivation in a Green Wall Panel photobioreactor // Biotechnology for Biofuels. 2014. № 7. Р. 84. doi: l0■ll86/l754-68з4-7-84
3. Caporgno M. P., Mathys A. Trends in microalgae incorporation into innovative food products with potential health benefits // Front. Nutr. 2018. № 5. Р. 1-10. doi: 10.3389/ fnut.2018.00058
4. Andrade L. M., Andrade C. J., Dias M. Chlorella and Spirulina microalgae as sources of functional foods, nutraceuticals, and food supplements; an overview // MOJ Food Process Technol. 2018. № 6(1). Р. 45-58. doi: 10.15406/mojfpt.2018.06.00144
5. Scieszka S., Klewicka E. Algae in food-a general review // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2018. № 57 (5). Р. 1-23.
6. Floriana Iasimone, Panico Antonio, Felice V. [et al.]. Effect of light intensity and nutrients supply on microalgae cultivated in urban wastewater: Biomass production, lipids accumulation and settleability characteristics // Journal of Environmental Management. 2018. № 223. doi: 10.1016/j.jenvman. 2018.07.024
7. Cao M., Jiaming K., Gao Y. [et al.]. Optimization of cultivation conditions for enhancing biomass, polysaccharide and protein yields of Chlorella sorokiniana by response surface methodology // Aquaculture Research. 2020. №51. Р. 2456-2471. doi: 10.1111/ are.14589
8. Богданов Н. И. Суспензия хлореллы в рационе сельскохозяйственных животных. Пенза, 2007. 48 с.
9. Богданов Н. И. Хлорелла: зеленый корм круглый год // Комбикорма. 2004. № 3. С. 66.
10. Kotrbacek V., Doubek J., Doucha J. The chlorococcalean alga Chlorella in animal nutrition: a review // J. Appl. Phycol. 2015. №27. Р. 2173-2180. doi: 10.1007/s10811-014-0516-y
11. Митишев А. В., Семенова Е. Ф., Преснякова Е. В. К вопросу разработки технологии культивирования и переработки Chlorella vulgaris для получения резиноида // Вестник ВГУ. Сер.: Химия. Биология. Фармация. 2017. № 4. С. 62-65.
12. Becker E. W. Microalgae as a source of protein // Biotechnol. Adv. 2007. № 25. Р. 207-210. doi: 10.1016/j.biotechadv.2006.11.002
13. Kovac D., Simeunovic J., Babic O. [et al.]. Algae in food and feed // Food Feed Res. 2013. №40. Р. 21-31.
14. Madeira M. S., Cardoso C., Lopes P. A. [et al.]. Microalgae as feed ingredients for livestock production and meat quality: A review // Livest. Sci. 2017. № 205. Р. 111-121. doi: 10.1016/ j.livsci.2017.09.020
15. Kholif A. E., Elghandour M. M. Y., Salem A. Z. M. [et al.]. The effects of three total mixed rations with different concentrate to maize silage ratios and different levels of microalgae Chlorella vulgaris on in vitro total gas, methane and carbon dioxide production // J. Agric. Sci. 2017. № 155. Р. 494-507. doi: 10.1017/ S0021859616000812
16. Lamminen M., Halmemies-Beauchet-Filleau A., Kokkonen T. [et al.]. Comparison of microalgae and rapeseed meal as supplementary protein in the grass silage based nutrition of dairy cows // Anim. Feed Sci. Technol. 2017. № 234. Р. 295-311. doi: 10.1016/ j.anifeedsci.2017.10.002
17. Thorp J. M., Bowes R. E. Carbon sources in riverine food webs: new evidence from amino acid isotope techniques // Ecosystems. 2016. № 20. Р. 1029-1041.
18. Safi C., Zebib B., Merah O. [et al.]. Morphology, composition, production, processing and applications of Chlorella vulgaris: A review // Renew. Sustain Energy Rev. 2014. № 35. Р. 265-278. doi: 10.1016/j.rser.2014.04.007
19. Lafargaa T., Acien-Fernandeza F. G., Garcia-Vaquerob M. Bioactive peptides and carbohydrates from seaweed for food applications: Natural occurrence, isolation, purification, and identification // Algal Research. 2020. № 48. Р. 101909. doi: 10.1016/j.algal.2020.101909
20. Курдюков Е. Е., Семенова Е. Ф., Водопьянова О. А. [и др.]. Аминокислотный состав сырья стевии различного происхождения // Химия растительного сырья. 2021. № 1. С. 113-119. doi: 10.14258/jcprm.2021017695
21. Mitishev A., Semenova E., Presnyakova V. [et al.]. Nephelometric method for determination of growth parameters of Chlorella culture // MEPhl's Section of the Scientific Session on "Breakthrough directions of scientific research at MEPhI: Development prospects within the Strategic Academic Units", KnE Engineering. Moscow, 2018. Р. 206-212. doi: 10.18502Zkeg.v3i6.2994
22. Методика измерений массовой доли аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием капиллярного электрофореза «Капель» М-04-38-2009. СПб. : Люмэкс-маркетинг, 2014. 49 с.
23. Государственная фармакопея Российской Федерации. Т. 2. Изд. XIV. М. : Министерство здравоохранения РФ, 2018. С. 3262.24.
24. Xian-Ming Shi, Xue-Wu Zhang, Feng Chen. Heterotrophic production of biomass and lutein by Chlorella protothecoides on various nitrogen sources / / Enzyme and Microbial Technology. 2000. Vol. 27, Iss. 3-5. P. 312-318. doi: 10.1016/S0141-0229(00)00208-8
Информация об авторах
Митишев Александр Владимирович, старший преподаватель кафедры «Общая и клиническая фармакология», Пензенский государственный университет.
Семенова Елена Федоровна, кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник кафедры «Фармация», Медицинская академия им. С. И. Георгиевского Крымского федерального университета им. В. И. Вернадского.
Курдюков Евгений Евгеньевич, кандидат фармацевтических наук, доцент, доцент кафедры «Общая и клиническая фармакология», Пензенский государственный университет.
Моисеев Яков Петрович, студент, Пензенский государственный университет.
Полубояринов Павел Аркадьевич, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, доцент кафедры «Общая и клиническая фармакология», Пензенский государственный университет.
Моисеева Инесса Яковлевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой «Общая и клиническая фармакология», Пензенский государственный университет.
Лабес Антье, доктор естественных наук, профессор, Университет прикладных наук (Фленсбург, Германия). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
