ИНГИБИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЧАЙНЫХ КОМПОЗИЦИЙ И ИХ СОСТАВЛЯЮЩИХ ИНГРЕДИЕНТОВ НА РЕПЛИКАЦИЮ SARS-COV-2 INVITRO Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Оригинальная статья / Original article УДК 578.7

DOI: 10.18470/1992-1098-2022-2-76-90

Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro

Елена И. Казачинская1, Александр А. Чепурнов1, Юлия В. Кононова1, Арсения А. Шелемба1, Владимир В. Романюк2, Магомед Г. Магомедов3, Александр М. Шестопалов1

'Научно-исследовательский институт вирусологии Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины» (ФИЦ ФТМ СО РАН) Сибирского отделения Российской Академии наук, Новосибирск, Россия 2ООО Научно-производственная фирма (НПФ) «Золотая долина», Новосибирск, Россия 3Дагестанский государственный медицинский университет, Махачкала, Россия

Резюме

Цель. Исследование ингибирующей активности водных экстрактов чайных композиций и входящего в них растительного сырья на репликацию SARS-CoV-2 in vitro.

Материал и методы. Лабораторный штамм SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 был пассирован на культуре клеток Vero. Для приготовления водных экстрактов использовали шесть видов экспериментальных чайных композиций (не содержащих ароматизаторов) на основе черного и зеленого чая или цветов гибискуса, а также индивидуальные составляющие ингредиенты. Противовирусную (ингибирующую) активность растительных экстрактов исследовали in vitro по классической схеме нейтрализации (инактивации) вируса.

Результаты. При сравнении с основным контрольным образцом водного экстракта чаги с 50%-ной эффективной концентрацией, равной 13,72±2,99 мкг/мл против 103 ТЦПД5о/мл SARS-CoV-2, превосходящая активность обнаружена для экстрактов специи гвоздики и черного чая из Непала. Приблизительно равная ингибирующая активность выявлена для экстрактов чайных композиций на основе черного чая с добавлением травы тимьяна алтайского и специи гвоздики или с добавлением семян тмина и корня дягеля; экстрактов готовых чайных композиций на основе зеленого чая из Китая с добавлением листьев мяты перечной и цветов лаванды или с добавлением порошка кожуры апельсина и семян аниса, а также для экстрактов индивидуального растительного сырья, используемого для составления чайных композиций - это черные чаи из Индии, Аргентины, Вьетнама и Шри-Ланка, листья мяты перечной и цветы лаванды, лишайник цетрария, зеленый чай и ягоды клюквы.

Заключение. Полученные результаты позволяют предположить, что чайные композиции на основе черного и зеленого чая, с добавлением различного растительного сырья в виде обычного напитка могут быть полезны людям при инфекции COVID-19.

Ключевые слова

Чайные композиции, растительное сырье, антивирусная активность, SARS-CoV-2.

© 2022 Авторы. Юг России: экология, развитие. Это статья открытого доступа в соответствии с условиями Creative Commons Attribution License, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.

Контактное лицо

Елена И. Казачинская, доктор биологических

наук, ведущий научный сотрудник ФИЦ ФТМ СО

РАН, Новосибирск; 630559 Россия,

Новосибирская область, р/п Кольцово, 32-1.

Тел. +79095307441

Email lena.kazachinskаia@mail.ru

ORCID https://orcid.org/0000-0002-1856-6147

Формат цитирования

Казачинская Е.И., Чепурнов А.А., Кононова Ю.В., Шелемба А.А., Романюк В.В., Магомедов М.Г., Шестопалов А.М. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 in vitro // Юг России: экология, развитие. 2022. Т.17, N 2. С. 76-90. DOI: 10.18470/1992-1098-2022-2-76-90

Получена 21 марта 2022 г.

Прошла рецензирование 8 апреля 2022 г.

Принята 16 апреля 2022 г.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

SARS-CoV-2 - коронавирус тяжелого острого

респираторного синдрома;

COVID-19 - коронавирусная болезнь, 2019 г.;

ЦПД - цитопатическое действие;

ТЦПДбо/мл - 50%-ная тканевая цитопатическая

доза в мл;

СС50 - 50%-ная цитотоксическая концентрация; ЕС50 - 50%-ная эффективная концентрация.

Inhibitory activity of tea compositions and their constituent ingredients on SARS-COV-2 replication in vitro

Elena I. Kazachinskaia1, Alexander A. Chepurnov1, Yulia V. Kononova1, Arseniya A. Shelemba1, Vladimir V. Romanyuk2, Magomed G. Magomedov3 and Alexander M. Shestopalov1

'Research Institute of Virology, Federal Research Centre of Fundamental and Translational Medicine (FRCFTM), Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia 2Zolotaya Dolina Research and Production Company, Novosibirsk, Russia 3Dagestan State Medical University, Makhachkala, Russia

Principal contact

Elena I. Kazachinskaia, Doctor of Biology, Leading Researcher of the Research Institute of Virology of Federal Research Centre of Fundamental and Translational Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; Prospekt Koltsovo 32-1, Novosibirsk, Novosibirskiy region, Russia 630559. Tel. +79095307441 Email lena.kazachinsksia@mail.ru ORCID https://orcid.org/0000-0002-1856-6147

How to cite this article

Kazachinskaia E.I., Chepurnov A.A., Kononova Yu.V., Shelemba A.A., Romanyuk V.V., Magomedov M.G., Shestopalov A.M. Inhibitory activity of tea compositions and their constituent ingredients on SARS-COV-2 replication in vitro. South of Russia: ecology, development. 2022, vol. 17, no. 2, pp. 7690. (In Russian) DOI: 10.18470/1992-1098-2022-276-90

Received 21 March 2022 Revised 8 April 2022 Accepted 16 April 2022

ABBREVIATIONS LIST

SARS-CoV-2 - severe acute respiratory syndrome coronavirus;

COVID-19 - coronavirus disease, 2019; TCPDsû/ml - tissue cytopathic dose of the virus causing a 50% cytopathic effect on the infected cells/in ml;

CC50 - cytotoxic concentration; EC50 - effective concentration.

Abstract

Aim. In vitro analysis of the inhibitory activity of aqueous extracts of ready-made tea compositions and their constituent ingredients on SARS-COV-2 replication.

Material and Methods. The laboratory strain SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 was passivated on Vero cell culture. For the preparation of water extracts six types of experimental tea compositions (not containing flavorings) based on black and green tea or flowers of hibiscus as well as individual ingredients were used. Antiviral (inhibitory) activity of plant raw materials was studied in vitro according to the classical scheme of neutralization (inactivation) of the virus. Results. When compared with the main control sample of an aqueous extract of chaga (Inonotus obliquus) with a 50% effective concentration equal to 13.72±2.99 pg/ml against 103 TCPD50/ml of SARS-CoV-2, superior activity was found for extracts of the spice Syzygium aromaticum L. and black tea from Nepal. Approximately equal inhibitory activity was detected for extracts of tea compositions based on black tea with the addition of the grass Thymus altaicus and the spice S. aromaticum L. or with the addition of seeds of Carum carvi L. and the root of Angelica archangelica L. In addition, such activity was detected for extracts of tea compositions based on green tea from China with the addition of leaves of Mentha piperita L. and flowers of Lavandula angustifolia Mill. or with the addition of the peel of Citrus sinensis L. and seeds of Pimpinella anisum L. Extracts from individual plant raw materials used to make tea compositions were black teas from India, Argentina, Vietnam and Sri Lanka, leaves of M. piperita L. and flowers of L. angustifolia Mill. Cetraria islandica lichen, green tea and berries of Oxycoccus also showed antiviral activity. Conclusion. The results obtained suggest that tea compositions based on black and green tea with the addition of various plant raw materials in the form of a regular drink can be useful to people with COVID-19 infection.

Key Words

Tea compositions, raw materials of herbs, antiviral activity, SARS-CoV-2.

© 2022 The authors. South of Russia: ecology, development. This is an open access article under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits use, distribution and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

ВВЕДЕНИЕ

Чай и биологически активные вещества Выращивание чайного куста или камелии китайской (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, Theaceae). восходит к глубокой древности. Китай, вероятно, является центром происхождения этого растения и мировым лидером по выращиванию и производству чая как готового сырья [1]. Внешний вид сырья чая зависит от процедуры производства, т.е. степени ферментации для увеличения срока хранения [2]. Для получения зеленого чая свежесобранные листья сразу же пропаривают, чтобы предотвратить брожение, получая сухой, стабильный продукт. Этот процесс разрушает ферменты, ответственные за расщепление цветных пигментов в листьях и позволяет чаю сохранять свой зеленый цвет и природные флавоноиды - полифенолы. Поскольку зеленый чай ферментируется до улуна, а затем до черного чая, полифенольные соединения (катехины) в зеленом чае димеризуются и это приводит к различной биологической активности растительного сырья [3]. Кроме того, чайные растения синтезируют мириады ароматических соединений (например, производные летучих жирных кислот, терпенов и фенилпропаноидов/бензолоидов) в ответ на природные биотические и абиотические стрессы [4]. Качество чая, в основном, определяется химическими компонентами чайных листьев. Профили метаболитов и их количества в разных сортах чая различаются. Chen с соавт. в 14-ти сортах чая Wuyi Rock, выращенных в одном регионе, определили 49 основных метаболитов, включая flavan, proanthocyanidins, flavonol glycosides, flavone glycosides, flavonone glycosides, гидролизуемые дубильные вещества, производные фенольной кислоты, алкалоиды, аминокислоты и др. В частности, катехины, производные кемпферола и кверцетина были ключевыми метаболитами, ответственными за различение сортов [5].

Есть сообщения об ингибировании растительными полифенольными соединениями репликации вирусов, относящихся к разным семействам - это Herpes Simplex Virus (HSV-1 и HSV-2), Human gammaherpesvirus 4 типа (Epstein-Barr virus), птичий грипп H5N1, гепатиты B и C, Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1, ВИЧ), денге серотипа 2 (DENV-2), Sendai virus, Coxsackie B virus type 1, Chikungunya virus и Japanese encephalitis virus [6], а также SARS-CoV [7] и SARS-CoV-2 [2; 8]. Катехины, синтезируемые в листьях C. sinensis представляют собой смесь различных изомеров и их конъюгатов с галловой кислотой. Наиболее преобладающий количественно и биоактивный из катехинов сырья этого растения - это эпигаллокатехин-3-галлата (epigallocatechin-3-gallate, EGCG), особенно в зеленых сортах чая. По данным многочисленных исследований, EGCG признан многофункциональной биологически активной молекулой, обладающей противоопухолевыми, противовоспалительными, антибактериальными, антиокси-дантными и антипролиферативными свойствами в дополнение к его активности против некоторых вирусов [2; 8]. Теафлавины (Theaflavins, TFs) - еще один класс полифенолов, которые в изобилии содержатся в черных видах чая - это теафлавин (theaflavin, TF1), теафлавин-3-галлат (TF2A), теафлавин-З'-галлат (TF2B) и теафлавин-3,3'-дигаллат (TF3). Все эти TFs изучаются на предмет их

биологических свойств, в том числе и против SARS-CoV-2 [2; 8].

Новый коронавирус SARS-CoV-2 вызывает COVID-19 - заболевание, связанное с поражением эпителиальных клеток дыхательной системы и воспалением слизистой оболочки, что приводит к повреждению альвеол и в конечном итоге к пневмонии [9]. Напряженность индивидуального и коллективного иммунитета в результате перенесенного заболевания или после вакцинации еще находятся в процессе исследования [10]. В настоящее время не существует доказанных эффективных этиотропных методов лечения COVID-19 с использованием препаратов с прямым противовирусным действием. Лечение донорской плазмой реконвалесцентов может быть эффективной при наличии в ней достаточного уровня нейтрализующих антител, но при этом существует вероятность риска заражения другими, передаваемыми через кровь патогенами, включая ВИЧ, вирусы гепатита В и С [11]. В начале пандемии национальной комиссией здравоохранения КНР были рекомендованы препараты хлорохин и гидроксихлорохин (синтетические аналоги хинина) для лечения при COVID-19, но оказалось, что при их применении часто возникают побочные эффекты, такие как ухудшение зрения, тошнота, расстройство пищеварения и более тяжелые осложнения, которые могут привести к сердечной недостаточности [11]. Для лечения пациентов с COVID-19 оказались неэффективны ингибиторы ВИЧ-протеазы в сочетании Lopinavirum/Ritonavirum [12; 13]. Favipiravir - химически синтезированный ингибитор РНК-зависимой РНК-полимеразы гриппа [14], с февраля 2020 г. в КНР был одобрен для лечения при COVID-19, т.к. показал высокую активность против SARS-CoV-2 in vitro [15]. В РФ Favipiravir с мая 2020 г. одобрен для лечения COVID-19 [16], но в зарубежной литературе описываются наиболее часто наблюдаемые осложнения, связанные с его применением - это гиперурикемия (от 15,5 до 84,1% от числа пациентов) и нарушение функции печени (7,4%) [17; 18]. Remdesivir -противовирусный препарат широкого спектра действия в классе нуклеотидных аналогов [19] и несколько других доступных противовирусных препаратов и новых химических молекул также тестировались для лечения новой коронавирусной болезни [11]. Есть мнение, что исследование вирус-ингибирующих (противовирусных) свойств природных веществ, получаемых, например, при употреблении чайных композиций, может стать прогрессом в поиске эффективных средств альтернативного или дополнительного лечения при COVID-19 [2; 8], вызываемой новым коронавирусом - патогеном с еще не оцененным влиянием, например, на репродуктивное здоровье человека [20].

В представленной работе приведены результаты анализа ингибирующей активности экстрактов готовых чайных композиций и растительного сырья (индивидуальных ингредиентов для их составления) на репликацию SARS-CoV-2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Чайные композиции

Использовали шесть готовых чайных композиций, не содержащих ароматизаторов, из них два вида на основе зеленого - состав №1: зеленый чай+листья мяты перечной+цветы лаванды и состав №2: зеленый

чай+кожура апельсина+семена аниса; три вида на основе черного чая - состав №3: черный чай+трава тимьяна алтайского+специя гвоздика; состав №4: черный чай+семена тмина+корень дягеля и состав №5: черный чай+ягоды клюквы+цетрария. Состав №6: цветы гибискуса+кожура апельсина+специя корица. Разработка и производство чайных композиций ООО НПФ «Золотая долина», г. Новосибирск. Под определением «трава» подразумевается наземная часть растения, состоящая из стебля, листьев и соцветий.

Растительное сырье (ингредиенты для чайных композиций)

Зеленый чай из Китая и несколько видов черного чая, импортированных из Аргентины, Вьетнама, Индии, Шри-Ланка и Непала. Все растительное сырье и специи (2020 г. заготовки и закупки) предоставлены ООО НПФ «Золотая долина» (г. Новосибирск). Места сбора или страна-поставщик растительного сырья: горный Алтай, РФ - лишайник цетрария (Cetmria isbndica L., Parmeliaceae); Алтайский край, РФ - корень дягеля (Angelica archangelica L., Apiaceae) и трава тимьяна алтайского (Thymus altaicus, Lamiaceae); Крым - цветы лаванды (Lavandula angustifolia Mill., Lamiaceae); Египет - листья мяты перечной (Mentha piperita L., Lamiaceae); Вьетнам - специя гвоздика (Syzygium aromaticum L., Myrtaceae); Морокко - кожура апельсина (Citrus sinensis L., Rutaceae); Польша - семена аниса (Pimpinella anisum L., Apiaceae) и семена тмина (Carum carvi L., Apiaceae); Индия - специя корица (Cinnamomum L., Lauraceae); Финляндия - ягоды клюквы (Oxycoccus, Ericaceae); Нигерия - цветы гибискуса (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae).

Контрольные образцы - корень солодки голой (Glycyrrhiza glabra L., Fabaceae), выращенный в Южном Урале; плодовое тело базидиального гриба чага (Inonotus obliquus, Basidiomycota) и листья кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L., Onagraceae) собраны авторами на Салаирском кряже Маслянинского района Новосибирской области. Ферментация листьев E. angustifolium L., проведена на производственных площадях ООО НПФ «Золотая долина» (г. Новосибирск).

Приготовление растительных экстрактов Для определения 50%-ных эффективных концентраций (effective concentration, EC), ингибирующих вирусную репликацию, готовые чайные композиции (2 г/пакетик) и растительное сырье по 2 г заливали 20 мл (т.е. для получения исходной концентрации экстрактов 100 мг/мл) горячей свеже кипяченной дистиллированной водой в стеклянных емкостях, выдерживали 15 мин на механической качалке при комнатной температуре и 15 об./мин, а затем 2 часа при 37°С в покое. Настои фильтровали через капроновую ткань и использовали для исследования в свежем виде. Для выявления общей ингибирующей активности на вирус готовых чайных композиций пакетики чая (2 г) заливали свеже кипяченной дистиллированной водой в объеме стандартной чайной чашки - 150 мл в стеклянных емкостях и при остывании до комнатной температуры сразу же использовали для работы в объеме 1 мл (т.е. с концентрацией по сухому веществу - 13,33 мг/мл).

Культура клеток

Перевиваемую культуру клеток Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки) культивировали на питательной среде Игла МЕМ с L-глутамином (Биолот, Россия) с добавлением 1% Antibiotic Antimycotic Solution (SIGMA Life Science, Израиль) и 10% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) (Capricorn Scientific, ФРГ).

Вирус

Вирусный изолят был выделен в 2020 г. на культуре клеток Vero из образца мазка носоглотки больного человека, позитивного на наличие вирусной РНК SARS-CoV-2 при анализе в лаборатории по диагностике COVID-19 при ФИЦ ФТМ СО РАН. Лабораторный вирусный штамм был пассирован и депонирован в коллекции вирусов 48 ЦНИИ МО РФ под наименованием SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 [21]. Титр инфекционного SARS-CoV-2 в супернатанте питательной среды (с 2% прогретой сыворотки крови КРС от «слепого пассажа» на инфицированных клетках Vero, выращенных в культуральных флаконах объемом 175см2 (Corning, США), выражали в ТЦПД50/мл (тканевых цитопатических дозах вируса, вызывающего цитопатическое действие на инфицированные клетки в 50% лунок). Для этого проводили фиксацию инфицированных клеток, заранее выращенных в 96-луночных стерильных культуральных планшетах (Corning, США), в течение 30 мин раствором формальдегидом и 0,05%-ным раствором кристаллического фиалетового с 20% спирта, как описано [22].

Цитотоксичность растительных эктрактов определяли по 50%-ной токсичной концентрации (CC^/мл - 50% cytotoxic concentration) при нанесении препаратов на клеточную культуру Vero с разведения У в объеме 200 мкл/лунка двойным шагом (т.е. с 100 мг/мл) в лунки 96-луночного планшета или в объеме 1 мл (при концентрации 13,33 мг/мл) готовых чайных композиций в 24-х луночных планшетах (в четырех повторах в двух независимых экспериментах) и выдерживали в течение 1 часа при 37°С. Затем монослой клеток отмывали и оставляли в поддерживающей питательной среде, содержащей 2% прогретой сыворотки крови КРС. Цитотоксическое действие растительных препаратов оценивали каждые сутки (срок наблюдения 5 суток).

Противовирусную (ингибирующую) активность растительного сырья исследовали in vitro (в четырех повторах в двух независимых экспериментах) по классической схеме нейтрализации (инактивации) вируса, как нами описано недавно для исследования антител пациентов, переболевших COVID-19 [23]. Перед нанесением на монослой клеток Vero, выращенных в 96-луночных планшетах, растительные эктракты с исходной концентрацией по сухому веществу в объеме 100 мкл/лунка с разведения от 1/2 двойным шагом (т.е. с 50 мг/мл) предварительно инкубировали с инфекционным SARS-CoV-2 в течение 1 часа при 37°С. Для выявления общей ингибирующей активности готовых чайных композиций (при концентрации по сухому веществу 13,33 мг/мл) эксперименты проводили на монослое клеток, выращенных в лунках 24-х луночных планшетов. После инкубации смеси растительных экстрактов с вирусным препаратом на клетках течение 1 часа при 37°С, монослой клеток

отмывали и оставляли в поддерживающей питательной среде, содержащей 2% прогретой сыворотки крови КРС, до проявления ЦПД вируса в контрольных лунках, содержащих инфицированные клетки. Учет результатов по ингибированию вирусной репликации проводили визуально при наблюдении в инвертированный микроскоп (Микромед, Россия) при 10-кратном увеличении, а затем после фиксации клеток в течение 30 мин раствором формальдегидом и 0,05%-ным раствором кристаллического фиалетового с 20% спирта, как описано [22]. Результат оценивали в соответствии с «Руководством....» [24].

Статистическую обработку результатов по определению инфекционного титра вируса, а также по CC50 и EC50 проводили с применением метода Спирмена-Кербера в программе Excel при 95%-ном уровне надежности (р<0,05).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка токсического действия растительных экстрактов на культуру клеток Vero Как обычно, на первом этапе исследования антивирусной активности любых препаратов проводится оценка их токсического действия на культуру клеток, чувствительных к вирусу, выбранному для анализа [25]. В данном случае мы использовали культуру клеток Vero (рис. 1 а), подходящую для эффективной репликации SARS-CoV-2 (рис. 1 b). При наблюдении в течение пяти суток было заметно повышение цитотоксичности у некоторых экстрактов. Определение 50%-ных цитотоксических концентраций (СС50/мл) на 5-е сутки наблюдения (это время совпадает с проявлением ЦПД вируса с выбранными для работы инфекционными дозами в 50% лунок) показало, что, в основном, экстракты оказались токсичны для клеток при невысоких концентрациях - в диапазоне

медианных значений 100-12,5 мг/мл по сухому веществу. На рис. 2 и в таблице представлены результаты показателей СС50/мл по средним значениям с доверительными интервалами при 95%-ном уровне надежности (р<0,05) исследуемых экстрактов чайных композиций и составляющих их ингредиентов на клеточную культуру Vero. Как видно, самая низкая цитотоксичность (от 87500,0±16038,37 до 46875,0±6118,76 мкг/мл) наблюдалась для экстрактов цветов гибискуса, семян аниса, готовых чайных композиций на основе зеленого чая - №1 (зеленый чай+листья мяты перечной+цветы лаванды) и №2 (состав: зеленый чай+кожура апельсина+семена аниса), экстрактов листьев мяты перечной, лишайника цетрарии, семян тмина; чайной композиции №6 (цветы гибискуса+кожура апельсина+специя корица), чайной композиции №5 (черный чай+ягоды клюквы+цетрария), экстрактов травы тимьяна алтайского, цветов лаванды, корня солодки, чаги, ферментированных листьев кипрея, чайной композиции №4 (черный чай+семена тмина+корень дягеля), экстракта корня дягеля, чайной композиции №3 (черный чай+трава тимьяна алтайского+специя гвоздика), экстрактов зеленого чая из Китая, кожуры апельсина, ягод клюквы. У остальных экстрактов проявилась цитотоксичность при более низких концентрациях (от 37500,0±9250,0 до 10100,0±2293,67 мкг/мл) - это экстракты черного чая из Индии, Вьетнама и Шри-Ланка, специи корицы, черного чая из Непала и специи гвоздики. Все чайные композиции, приготовленные как обычный чай (пакетик 2 г на 150 мл воды), при нанесении на монослой клеток в объеме 1 мл (т.е. 13,33 мг/мл) не проявляли токсичности для клеток Vero.

По данным литературы, водные растительные экстракты, в основном, менее токсичны для клеток, чем этанольные [26; 27].

Рисунок 1. Культура клеток Vero (фото авторов) Figure 1. Vero cell culture (authors' photo)

Примечание: а - монослой чистой культуры клеток; b - ЦПД SARS-CoV-2 на инфицированные клетки Note: a - monolayer of pure cell culture; b - cytopathic effect of SARS-CoV-2 on infected cells

Рисунок 2. Показатели цитотоксичности чайных композиций и входящих в их состав ингредиентов на культуру клеток Vero в течение пяти дней наблюдения

Figure 2. Cytotoxicity indicators of tea compositions and their constituent ingredients on Vero cell culture during five days of observation

Примечание: значения CC50 представлены в мкг/мл средних значений с доверительными интервалами при уровне надежности 95% (р<0,05). Цифры на горизонтальной линии соответствуют следующим образцам (номерам) водных экстрактов: 1 - специя гвоздика; 2 - черный чай из Непала; 3 - измельченное плодовое тело чаги; 4 - черный чай из Индии; 5 - чайная композиция №3 (черный чай+трава тимьяна алтайского+специя гвоздика); 6 - листья мяты перечной; 7 - черный чай из Аргентины; 8 - цветы лаванды; 9 - черный чай из Вьетнама; 10 - черный чай из Шри-Ланка; 11 - корень солодки; 12 - чайная композиция №1 (зеленый чай+листья мяты перечной+цветы лаванды); 13 - ферментированные листья кипрея узколистного; 14 - лишайник цетрария; 15 - чайная композиция №2 (зеленый чай+кожура апельсина+семена аниса); 16 - зеленый чай из Китая; 17 - чайная композиция №4 (черный чай+семена тмина+корень дягеля;18 - ягоды клюквы; 19 - семена аниса; 20 - корень дягеля;

21 - чайная композиция №5 (черный чай+ягоды клюквы+цетрария); 22 - трава тимьяна алтайского; 23 - специя корица;

24 - кожура апельсина; 25 - семена тмина; 26 - чайная композиция №6 (цветы гибискуса+кожура апельсина+специя корица); 27 - цветы гибискуса; 28 - отрицательный контроль: кипяченая дистиллированная вода и ростовая среда для клеток Vero (1/1 по объему). Под определением «трава» подразумевается наземная часть растения, состоящая из стебля, листьев и соцветий. На темном фоне представлены показатели СС50в мкг/мл контрольных образцов: №3 - чага, №11 - корень солодки и №13 - ферментированные листья кипрея узколистного, соответственно.

Note: CC.5o/ml values are presented in ^g/ml of average values with confidence intervals at 95% reliability level (p<0.05). The numbers on the horizontal line correspond to the following samples: 1 - spice Syzygium aromaticum L. (Myrtaceae); 2 - black tea from Nepal; 3 - crushed fruit body of chaga (Inonotus obliquus, Basidiomycota); 4 - black tea from India; 5 - tea composition №3 (black tea+grass of Thymus altaicus+spice Syzygium aromaticum L.); 6 - leaves of Mentha piperita L. (Lamiaceae); 7 - black tea from Argentina; 8 - flowers of Lavandula angustifolia Mill. (Lamiaceae);9 - black tea from Vietnam; 10 - black tea from Sri Lanka; 11 - root of Glycyrrhiza glabra L. (Fabaceae); 12 - tea composition №1 (green tea+leaves of Mentha piperita L.+flowers of Lavandula angustifolia Mill.); 13 - fermented leaves of Epilobium angustifolium L. (Onagraceae); 14 - lichen Cetraria islandica L. (Parmeliaceae); 15 - tea composition №2 (green tea+peel of Citrus sinensis L.+seeds of Pimpinella anisum L.); 16 - green tea from China; 17 - tea composition №4 (black tea+seeds of Carum carvi L.+root of Angelica archangelica L.); 18 - berries of Oxycoccus (Ericaceae); 19 - seeds of Pimpinella anisum L. (Apiaceae); 20 - root of Angelica archangelica L. (Apiaceae); 21 - tea composition №5 (black tea+berries of Oxycoccus+lichen Cetraria islandica L.);

22 - grass of Thymus altaicus (Lamiaceae); 23 - cora of Cinnamomum cassia L. (Lauraceae); 24 - peel of Citrus sinensis L. (Rutaceae);

25 - seeds of Carum carvi L. (Apiaceae); 26 - tea composition №6 (flowers of Hibiscus sabdariffa L.+peel of Citrus sinensis L.+cora

of Cinnamomum cassia L.); 27 - flowers of Hibiscus sabdariffa L. (Malvaceae); 28 - negative control: boiled distilled water and growth medium for Vero cells (1/1 by volume). The definition of «grass» refers to the ground part of the plant, consisting of a stem, leaves and inflorescences. The CC.50/ml values in цg/ml of control samples are presented on a dark background: No. 3 - Inonotus obliquus, No. 11 - root of Glycyrrhiza glabra L. and No. 13 - fermented leaves of Epilobium angustifolium L. respectively.

2. Исследование ингибирующей активности растительных водных экстрактов на репликацию SARS-CoV-2

Препарат штамма SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 с исходным титром 6,15±0,07 lg ТЦПД50/мл в супернатанте инфицированных клеток от «слепого» пассажа использовали в разведениях 10-3, 10-4 и 10-5 для полноты картины возможной антивирусной активности водных растительных экстрактов. Конечное разведение 10-5 в данном исследовании соответствовало 103 ТЦПД5о/мл или 102 ТЦПД50 в объеме 100 мкл лунки 96-луночного планшета, как принято в соответствии с «Руководством...» [24] по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ или с множественностью инфицирования 0,1 MOI

(multiplicity of infection)/клетка, как описано [28]. В качестве основного контрольного образца был использован водный экстракт чаги (I. obliquus) т.к. этот базидиальный гриб в 2020 г. рассматривался Shahzad с соавт. в ряду растительных препаратов патенциально активных против SARS-CoV-2 [29], а в январе 2021 г. Teпляковой с соавт. была показана in vitro ингибирующая активность I. obliquus в виде лиофильно высушенных и концентрированных водных экстрактов в диапазоне EC50=0,75-11,6 мкг/мл против штамма nCoV/Victoria/1/2020 SARS-CoV-2, выделенного в Австралии (с исходным инфекционным титром 5,0±0,29 lg ТЦПД50/мл) по профилактической схеме эксперимента (т.е. с предварительной обработкой растительными препаратами клеток линии Vero, а затем их заражением с

MOI 0,1 ТЦПД50/клетку) [30]. В качестве дополнительного контрольного образца нами был использован экстракт корня солодки (Glycyrrhiza glabra L., Fabaceae) в связи с его применением в составе рецептур китайской медицины для лечения людей с COVID-19 [31] и т.к. по данными экспериментального исследования Tolah с соавт. показана in vitro мощная ингибирующая активность свежеприготовленного экстракта корня G. glabra L. против SARS-CoV-2 в диапазоне концентраций от 100 до 312,5 нг/мл [32]. Кроме того, в качестве дополнительного контрольного образца нами был рассмотрен экстракт ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L., Onagraceae) с известным противовоспалительным, антиоксидантным, противоопухолевым, противомикробным и обезболивающим действием, что связывают с тем, что полифенолы являются основными соединениями листьев этого растения [33], как и в листьях чая (C. sinensis) [3].

В результате нашего анализа было выявлено, что биологически активные вещества, содержащиеся в контрольном образце неконцентрированного водного экстракта чаги, ингибировали репликацию штамма SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020, выделенного в г. Новосибирске, при разведениях вирусного препарата, содержащего 103, 104 и 105 ТЦПД50/мл с EC50=13,67±2,88; 54,125±12,00 и 366,20±47,84 мкг/мл соответственно (см. табл.). При сравнении с данными приведенными в работе [30], можно отметить, что 103 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2 в наших экспериментах подавляется в сопоставимых эффективных концентрациях (по 50%-ной ингибирующей активности) с учетом разных схем инактивации вируса. По литературным данным широкая биологическая активность чаги связана с ее полисахаридами, но механизмы действия пока в стадии изучения. При этом отмечается низкая цитотоксичность препаратов этого базидиального гриба и факт, что из-за различий в среде обитания и методах экстракции состав и содержание полученных полисахаридов не одинаковы [29; 34].

При сравнении с активностью приготовленного нами водного экстракта чаги с EC50=13,67±2,88 мкг/мл против 103 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2 (см. рис. 3a, b и табл.), приблизительно равная ингибирующая активность (от 15,25±3,91 до 39,66±8,75 мкг/мл) выявлена для экстрактов готовых чайных композиций №3 и №4 на основе черного чая с добавлением травы тимьяна алтайского и специи гвоздики или с добавлением семян тмина и корня дягеля; экстрактов готовых чайных композиций на основе зеленого чая - №1 с добавлением листьев мяты перечной и цветов лаванды или №2 с добавлением порошка кожуры апельсина и семян аниса; а также для экстрактов индивидуального растительного сырья, используемого для составления чайных композиций - это черный чай из Индии, Аргентины, Вьетнама и Шри-Ланка, листья мяты перечной и цветы лаванды, лишайник цетрария, зеленый чай из Китая и ягоды клюквы.

Превосходящая активность чаги обнаружена для экстрактов специи гвоздики (с EC50=10,67±1,95 мкг/мл) и черного чая из Непала (с EC50=11,43±1,48 мкг/мл) (см. рис. 3a, b и табл.).

Менее эффективно, по сравнению с контрольными образцами вирусную репликацию в дозе 103 ТЦПД50/мл подавляли экстракты следующего растительного сырья (по убывающей активности от 61,02±15,66 до 366,20±47,84 мкг/мл): семена аниса, корень дягеля и трава тимьяна алтайского, чайная композиция №5 на основе

черного чая с добавлением ягод клюквы и лишайника цетрарии, специи корицы; кожуры апельсина и семян тмина. Экстракт цветов гибискуса и чайная композиция №6 на их основе с добавлением кожуры апельсина и специи корицы не проявили антивирусной активности.

По чайным композициям, свежеприготовленным в объеме 150 мл и используемых для работы в объеме 1 мл (т.е. 13,3 мг/мл) в лунках 24-луночных планшетов с добавлением 1 мл питательной среды для монослоя клеток, наблюдалась следующая картина: все чайные композиции (№1-5), содержащие черный и зеленый чай, были эффективны против 103 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2, что соотносится с данными по ЕС50/мл в разведениях этих чайных композиций, приготовленных в меньшем объеме с исходной концентрацией 100 мг/мл.

Результаты по ингибирующей активности исследованных нами экстрактов против более высоких инфекционных доз SARS-CoV-2 - это 104 и 105 ТЦПД50/мл, не во всех случаях коррелировали с результатами их активности против 103 ТЦПД50/мл, тем не менее, из экстрактов отдельных растений и чайных композиций можно выделить следующие (по убывающей активности): специя гвоздика, черный чай из Непала; чайная композиция №3 (черный чай+трава тимьяна алтайского+специя гвоздика), чайная композиция №4 (черный чай+семена тмина+корень дягеля), плодовое тело чаги и черный чай из Индии, чайная композиция №1 (зеленый чай+листья мяты перечной+цветы лаванды) и чайная композиция №2 (зеленый чай+кожура апельсина+семена аниса) (см. рис. 3a, b и табл.).

С возникновения эпидемии COVID-19 в КНР в конце 2019 г., китайские ученые первыми начали интенсивный поиск препаратов против SARS-CoV-2. С использованием метода молекулярного докинга уже в начале 2020 г. они провели виртуальный скрининг вирусных мишений (структуры белков) и их взаимодействия с молекулами известных противовирусных препаратов из доступных баз данных. Также рассматривались растения, применяемые в народной и официальной китайской медицине. В результате было обнаружено, что некоторые природные вещества, например, гликозид байкалин (Baicalin) из корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis, Lamiаceae), а также соединения катехина камелии китайской (Camellia sinensis L., Theaceae) и др. проявляют высокое сродство к связыванию с рекомбинантной вирусной протеазой PLpro SARS-CoV-2, что предполагает потенциальную полезность этих соединений в лечении COVID-19 [35]. Данные по эффективности этанольного экстракта корня шлемника байкальского и его основного ингредиента байкалина недавно в 2021 г. подтвердились и в исследовании in vitro - как в реакции по ингибированию рекомбинантной вирусной протеазы PLpro (c EC50=8,52 мкг/мл и 0,39 мкг/мл соответственно), так и в реакции по нейтрализации (при заражении клеток после их предварительной обработки разведениями экстракта) против 200 БОЕ/лунка инфекционного SARS-CoV-2 (с EC50=0,74 мкг/мл и 2,9 мкг/мл соответственно) при невысоком значении СС50=500 мкг/мл [36]. В доклиническом исследовании in vivo на трансгенных мышах, имеющих клеточные рецепторы hACE2 для проникновения SARS-CoV-2, было показано, что байкалин при пероральном введении в дозе 4 мг/сутки значительно ингибировал репликацию вируса, спасал от потери массы тела и снижал поражение легочной ткани у этих животных. При остром повреждении легких у мышей препарат улучшал дыхательную функцию, ингибировал

инфильтрацию воспалительных клеток в легких и снижал уровни IL-1P и TNF-a в сыворотке крови [37]. В обзоре, препринт которого был опубликован в PuвMed в июле 2020 г. Mhatre с соавт., сотрудники Института химической технологии г. Мумбаи (Индия), рассматривали употребление чая прогрессом в поиске эффективных средств альтернативного лечения при COVID-19 [2]. Эти же авторы использовали молекулярный анализ взаимодействия молекул полифенолов C. sinensis L. с некоторыми из возможных сайтов связывания SARS-CoV-2 и в работе, опубликованной в феврале 2021 г., предсказали, что эпигаллокатехин-3-галлат

(epigallocatechin-3-gallate, EGCG) может обладать значительной ингибирующей активностью против вирусной протеазы PLpro SARS-CoV-2 [8]. В марте 2021 г. группа китайских исследователей представила результат

по изучению материальной основы и механизму действия при COVID-19 экстракта ферментированных листьев C. sinensis L. в виде улуна под названием «Liupao tea» с целью разработки новой программы профилактики и лечения новой болезни. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии был определен состав этанольного экстракта этого вида чая. «Liupao tea» содержал галловую кислоту, EGCG, галлат эпикатехина, кофеин, рутин и эллаговую кислоту. Результаты по активности in vitro показали, что концентрация выделенного EGCG, ингибирующая рекомбинантную вирусную протеазу PLpro SARS-CoV-2 составляет 8,84 мкмоль/л, что может в определенной степени ингибировать инфекционный SARS-CoV-2 при обычном употреблении этого чайного напитка для профилактики COVID-19 [38].

Рисунок 3. Результаты по определению 50%-ной ингибирующей (эффективной) концентрации (EC50 в мкг/мл) против 103 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2

Figure 3. Results of determination of 50% inhibitory (effective) concentration (EC50 in pg/ml) versus 103 TCPD50/ml of SARS-CoV-2

Примечание: a - экстракты № 1 -18; на темном фоне представлены показатели EC50 в мкг/мл контрольных образцов (№3 - чага, №11 - корень солодки, №13 - ферментированные листья кипрея); b - экстракты № 19-27 и №20 - отрицательный контроль (кипяченая дистиллированная вода с питательной средой для клеток). Номера образцов соответствуют их нумерации в рис. 2.

Note: a - extracts No. 1 - 18; EC50 values in цд/ml of control samples are presented on a dark background (No. 3 - crushed fruit body of chaga (Inonotus obliquus, No. 11 - root of Glycyrrhiza glabra L. and No. 13 - fermented leaves of Epilobium angustifolium L.; b - extracts No. 19-27 and No. 20 - negative control (boiled distilled water with nutrient medium for cells). The sample numbers correspond to their numbering in Fig. 2.

Таблица. Результаты по ингибирующей активности чайных композиций и входящих в их состав ингредиентов на SARS-CoV-2 in vitro против трех титров инфекционного вируса Table. Results on the inhibitory activity of tea compositions and their constituent ingredients on SARS-CoV-2 in vitro against three titers of infectious virus

EC5o в мкг/мл для трех инфекционных титров вируса

U ш _EC50 in Më/ml for three infectious virus titers

£ -а or Название

р б in о i растительного сырья СС50 в мкг/мл

r а ш ме m 0 ^ X Z Name of raw materials 105 ^ПД^/мл 104 ^ПД^/мл 103 TЦПД5o/ml СС50 in Mg/ml

of herbs 105TCPDs0/ml 104TCPD50/ml 103TCPD50/ml

1 Гвоздика (специя) Syzygium aromaticum L. (spice) 317,37±70,04 33,56±8,75 10,67±1,95 10100,0±2293,67

2 Черный чай из Непала Black tea from Nepal 317,37±70,04 67,13±17,51 11,43±1,48 10675,0±1950,0

3 Чага Chaga (Inonotus obliquus) 366,20±47,84 54,92±11,96 13,72±2,99 62500,0± 16038,71

4 Черный чай из Индии Black tea from India 634,76±140,09 109,85±23,92 15,25±3,91 37500,0±9250,0

Чайная композиция №3

(черный чай+трава тимьяна

алтайского+специя гвоздика)

5 Tea composition №3 (black tea+grass of Thymus altaicus+spice Syzygium aromaticum L.) 341,79±62,64 30,51±7,82 15,25±3,91 56250,0±17931,51

6 Листья мяты перечной Leaves of Mentha piperita L. 1953,12±501,2 158,68±35,02 16,77±4,37 75000,0±18510,0

7 Черный чай из Аргентины Black tea from Argentina 1171,87±289,36 73,23±18,08 16,77±4,37 26560,0±7220,0

Цветы лаванды

8 Flowers of Lavandula angustifolia Mill. 2148,43±560,36 170,89±31,32 18,30±4,51 68750,0±17926,66

9 Черный чай из Вьетнама Black tea from Vietnam 1074,21±280,18 317,37±70,04 30,51±6,56 34370,0±8950,0

10 Черный чай из Шри-Ланки Black tea from Sri Lanka 634,76±140,09 122,06±31,32 30,51±6,56 31250,0±8010,0

11 Корень юлодки Root of Glycyrrhiza glabra L. 3515,62±765,60 134,25±35,02 30,51±7,82 68750,0±17931,82

Чайная композиция №1

(зеленый чай+листья мяты

перечной+цветы лаванды)

12 Tea composition №1 (green tea+leaves of Mentha piperita L.+flowers of Lavandula angustifolia Mill.) 683,59±125,29 134,25±35,02 33,56±8,75 87500,0±16038,37

Ферментированные

13 листья кипрея Fermented leaves of Epilobium angustifolium L. 2148,43±560,36 732,42±95,69 33,56±8,75 62500,0±16038,37

14 Лишайник цетрария Lichen Cetraria islandica L. 5468,75±1002,41 366,20±47,84 33,56±8,75 75000,0±18510,0

Чайная композиция №2

(зеленый чай+кожура

15 апельсина+семена аниса Tea composition №2 (green tea+peel of Citrus sinensis L. +seeds of Pimpinella anisum L.) 732,42±95,69 122,06±31,32 36,61±9,03 81250,0±17931,51

16 Зеленый чай из Китая Green tea from China 1074,21±280,18 158,68±35,02 39,66±8,75 56250,0±17931,51

Чайная композиция №4

(черный чай+семена

17 тмина+корень дягеля) Tea composition №4 (black tea+seeds of Carum carvi L. +root of Angelica archangelica L.) 439,44±95,69 73,23±18,08 39,66±8,75 62500,0±16038,37

18 Ягоды клюквы Berries of Oxycoccus 23437,5±3062,43 5859,37±765,60 39,66±8,75 46875,0±6118,76

19 Семена аниса Seeds of Pimpinella anisum L. 5078,12±1115,65 366,20±47,84 61,02±15,66 87500,0±16034,9

20 Корень дягеля Root of Angelica archangelica L. 9375,0±2314,45 341,79±62,64 61,02±15,66 62500,0±16038,37

Чайная композиция №5

(черный чай+ягоды

21 клюквы+цетрария) Tea composition №5 (black tea+berries of Oxycoccus+lichen Cetraria islandica L.) 1269,53±280,18 366,20±47,84 67,13±17,51 68750,0±17920,0

22 Трава тимьяна Алтайского Grass of Thymus altaicus 4687,5±1157,22 683,59±125,29 67,13±17,51 68750,0± 17926,66

Корица (специя)

23 Cora of Cinnamomum cassia L. (spice) 3515,62±765,60 1660,15±451,78 134,25±35,02 26560,0±7220,0

24 Кожура апельсина Peel of Citrus sinensis L. 23430,0±3055,91 10937,5±2002,63 341,79±62,64 56250,0±4210,0

25 Семена тмина Seeds of Carum carvi L. 21875,0±4005,26 10156,25±2238,23 366,20±47,84 75000,0±18510,0

Чайная композиция №6

(цветы гибискуса+кожура

апельсина+корица)

26 Tea composition №6 (flowers of Hibiscus sabdariffa L.+peel of Citrus sinensis L.+cora of Cinnamomum cassia L.) 0 0 0 75000,0±18510,0

27 Цветы гибискуса Flowers of Hibiscus sabdariffa L. 0 0 0 87500,0±16034,9

Отрицательный контроль

28 Negative control: boiled distilled 0 0 0 0

water and growth medium for Vero cells

Примечание: ТЦПД5о/мл - 50%-ная тканевая цитопатическая доза в мл; EC50 - 50%-ная эффективная (вируснейтрализующая) концентрация; 0 - нет эффекта; CC50 - 50%-ная цитотоксическая концентрация на 5-е сутки наблюдения Note: TCPD5o/ml - tissue cytopathic dose of the virus causing a 50% cytopathic effect on the infected cells/in ml; EC50 effective concentration; CC50 - cytotoxic concentration on 5th day of observation

Проведенный нами анализ и результаты ингибирующей активности сырья черного и зеленого чая, а также готовых чайных композиций на их основе против SARS-CoV-2 подтверждают литературные данные о широкой антивирусной активности биологически активных веществ, содержащихся в листьях C. sinensis L. [2; 6-8]. В качестве контрольных образцов нами были использованы водные экстракты плодового тела чаги и корня солодки т.к. описана их ингибирующая активность против SARS-CoV-2 [30; 32], а также экстракт ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L., Onagraceae), широкую биологичекую активность которого связывают с тем, что полифенолы являются основными соединениями листьев этого растения [33], как и в листьях C. sinensis. При сравнении с этими контрольными образцами (с 50%-ной эффективной концентрацией (EC50) равной 13,72±2,99, 30,51±7,82 и 33,56±8,75 мкг/мл против 103 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2 соответственно) приблизительно равная антивирусная активность (от 15,25±3,91 до 39,66±8,75 мкг/мл) нами выявлена для экстрактов готовых чайных композиций на основе черного чая с добавлением травы тимьяна алтайского и специи гвоздики или с добавлением семян тмина и корня дягеля; экстрактов готовых чайных композиций на основе зеленого чая с добавлением листьев мяты перечной и цветов лаванды или с добавлением кожуры апельсина и семян аниса; а также для экстрактов

индивидуального растительного сырья, используемого для составления чайных композиций - это черный чай из Индии, Аргентины, Вьетнама и Шри-Ланка, листья мяты перечной и цветы лаванды, лишайник цетрария, зеленый чай из Китая и ягоды клюквы. Удивительно, что индивидуальные экстракты листьев мяты перечной и цветов лаванды по ингибирующей активности (16,77±4,37 и 18,30±4,51 мкг/мл) практически не уступали экстрактам сырья черного чая из Индии, Аргентины, Вьетнама и Шри-Ланка. Результаты по активности экстракта листьев мяты перечной могут стать подтверждением предсказания Sargin в начале 2021 г. о необходимости исследования этого растения для лечения короновирусной болезни в связи с его антигриппозной активностью [39]. К биологической активности эфирного масла цветов лаванды (например, противогрибковой [40]) недавно появилось сообщение об его антивирусной активности в смеси с эфирными маслами эвкалипта шаровидного (Eucalyptus globulus, Myrtaceae) и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris, Pinaceae) против вируса африканской чумы свиней (African swine fever virus) [41].

В экспериментах in vitro мы обнаружили не значительно превосходящую активность чаги (13,72±2,99 мкг/мл) для индивидуальных экстрактов черного чая из Непала (11,43±1,48 мкг/мл) и специи гвоздики (10,67±1,95 мкг/мл) против 103 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2. Хорошо известная кулинарная пряность

Syzygium aromaticum L. (высушенный бутон цветка этого растения обозначается английским названием «clove», происходящим от латинского слова "clavus" (гвоздь), с древних времен использовалась в народной медицине при многих респираторных заболеваниях, таких как кашель, простуда, астма, бронхит или синусит, в виде ароматерапии. Специя гвоздика является одним из ингредиентов чаев, используемых в тропической Азии для облегчения кашля [42]. Интересными свойствами специи гвоздики и ее компонентов являются описанные в литературе обезболивающие свойства (благодаря наличию вещества класса фенолов - евгенона (Eugenol (4-allyl-2-methoxyphenol), а также антитромботического, иммуностимулирующего и антибактериального эффектов [42]. В тоже время ингредиенты специи гвоздики обладают противовоспалительными и противовирусными свойствами. Описана

ингибирующая активность этанольных и метанольных экстрактов специи гвоздики на вирус простого герпеса (herpes simplex virus, HSV) [43] и на рекомбинантную протеазу вируса гепатита С [44]. Показано, что евгенол в чистом виде способен in vitro ингибировать репликацию вирусов гриппа A [45] и Эбола [46].

В наших экспериментах менее эффективно, по сравнению с контрольными образцами (экстрактами чаги, корня солодки и ферментированных листьев кипрея), репликацию SARS-CoV-2 в дозе 103 ТЦПД50/мл подавляли экстракты следующего растительного сырья (по убывающей активности от 61,02±15,66 до 366,20±47,84 мкг/мл): семян аниса, корня дягеля и травы тимьяна алтайского, чайной композиции на основе черного чая с добавлением ягод клюквы и лишайника цетрарии, пряности корицы; кожуры апельсина и семян тмина. Цветы гибискуса и чайная композиция на их основе не проявили ингибирующей активности на SARS-CoV-2, хотя в литературе есть сообщения об антивирусной активности этого растения. Например, водного экстракта цветов H. sabdariffa L., концентрированного выпариванием, против HSV-2 за счет его биоактивного соединения - протокатехиновой кислоты [47] или водного экстракта против вируса гриппа A [48].

В настоящее время поиск новых молекул природного происхождения с антивирусной активностью против COVID-19 основан на этноботанических исследованиях, которые позволяют проводить инвентаризацию растений в определенной географической зоне или стране, затем проводить фитохимические и фармакологические исследования. Например, основываясь на молекулярном докинге веществ, выделенных из эктрактов 67-ми растений, ученые из Морокко нашли три молекулы, которые очень интересны как с химической, так и с биологической стороны в качестве ингибиторов протеазы SARS-CoV-2 - это каротиноид кроцин (Crocin) из рылец шафрана посевного (Crocus Sativus L., Iridaceae), сердечный гликозид дигитоксигенин (Digitoxigenin) из семян олеандра (Nerium Oleander, Apocynaceae) и сесквитерпеновый спирт ß-эудесмол (ß-Eudesmol) из эфирного масла лавра благородного (Lauris Nobilis L., Lauraceae). Авторы считают, что синтез этих молекул и оценка их активности in vitro и in vivo против SARS-Cov-2 могут быть интересны в клиническом плане [49]. Экстракты или чистые соединения, выделенные из лекарственных растений, таких как полынь однолетняя (Artemisia annua, Asteraceae),

корейская мята (Agastache rugosa, Lamiaceae), астрагал перепончатый (Astragalus membranaceus, Fabaceae), солодка уральская (Glycyrrhizae uralensis, Fabaceae) и др., могут обладать многообещающим ингибирующим действием против SARS-CoV-2, как считают авторы в обзоре [50].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования актуальны в настоящее время. Анализ ингибирующей активности чайных композиций и составляющих их ингредиентов против SARS-CoV-2, можно оценить как положительный результат и определить цели для дальнейших исследований по поиску растительных препаратов и индивидуальных химических соединений, содержащихся в них. В этом плане интересны растения, произрастающие на территории нашей страны, возможно, с уже исследованной биологической активностью. Например, это произрастающий повсеместно кипрей узколистный (Epilobium angustifolium L., Onagraceae) [33] или лишайник вида цетрария (Cetraria islandica L., Parmeliaceae) с высокими запасами природного сырья в горном Алтае и описанной активностью in vitro против вирусов гриппа субтипов A/H3N2 и A/H5N1 [51]. Перспективными для дальнейших исследований могут быть растения, водные экстракты которых проявили ингибирующую активность и против более высоких инфекционных доз SARS-CoV-2 - 104 и 105 ТЦПД50/мл, это в первую очередь - специя гвоздика, черный чай из Непала, плодовое тело чаги и черный чай из Индии. На основании результатов по ингибирующей активности 104 и 105 ТЦПД50/мл SARS-CoV-2 можно предположить, что чайные композиции на основе черного и зеленого чая или с добавлением растительного сырья в виде обычного напитка могут быть полезны при инфекции COVID-19.

На стадии оформления наших результатов для публикации, в PubMed появилась статья японских исследователей по анализу активности экстрактов зеленого и черного чая против SARS-CoV-2 in vitro. Ishimoto c соавт. использовали коммерческое сырье зеленого и черного чая (пакетики по 2,2 г) производства Mitsui Norin Co., Ltd (Тзкио, Япония), экстрагировали в 140 мл горячей очищенной воды в течение 15 мин и фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры (Merck Millipore) с диаметром пор 0,2 нм. Для оценки противовирусной активности экстракты смешивали с препаратом инфекционного SARS-CoV-2 (штамм JPN/TY/WK-521) и, перед нанесением на культуру клеток линии VeroE6, смеси выдерживали при комнатной температуре (25°С) в течение разного времени - 10 и 30 сек, а также 1; 5; 10 или 30 мин. Показано, что по истечению 2-х суток адсобции суспензии обработанных вирионов на клетки, водные экстракты зеленого и черного чая снижали вирусный титр на 5 lg (при сравнении с контролем инфицированных клеток), начиная с первой точки предварительной (перед инфицированием) выдержки смеси в течение 10 сек. Таким образом, авторы предполагают, что наличие полифенолов в ферментированных листьях C. sinensis L., т.е. в чайном сырье и, соответственно, в чайных напитках, может быть дешевым и приемлемым средством для снижения вирусной нагрузки SARS-CoV-2 во рту и верхних отделах желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей [52].

БЛАГОДАРНОСТЬ

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №20-04-60010 «Изучение разнообразия, циркуляции и патогенного потенциала коронавирусов в природных резервуарах на территории Западной и Восточной Сибири» и №20-04-60212 «Комплексный эколого-вирусологический мониторинг коронавирусов в экосистемах Дальнего Востока». ACKNOWLEDGMENT

The work was supported by grants from the Russian Foundation for Basic Research No. 20-04-60010 "Studying the diversity, circulation and pathogenic potential of coronaviruses in natural reservoirs in Western and Eastern Siberia" and No. 20-04-60212 "Integrated ecological and virological monitoring of coronaviruses in the ecosystems of the Far East".

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Yu X., Xiao J., Chen S., Yu Y., Ma J., Lin Y., Li R., Lin J., Fu Z., Zhou Q, Chao Q, Chen L., Yang Z, Liu R. Metabolite signatures of diverse Camellia sinensis tea populations // Nat Commun. 2020. V. 11. N 1. Article number: 5586. DOI: 10.1038/s41467-020-19441-1

2. Mhatre S., Srivastava T., Naik S., Patravale V. Antiviral activity of green tea and black tea polyphenols in prophylaxis and treatment of COVID-19: A review // Phytomedicine. 2021. V. 85. Article number: 153286. DOI: 10.1016/j.phymed.2020.153286

3. Wang L., Song J., Liu A., Xiao B., Li S., Wen Z., Lu Y., Du G. Research Progress of the Antiviral Bioactivities of Natural Flavonoids // Nat Prod Bioprospect. 2020. V. 10. N 5. P. 271-283. DOI: 10.1007/s13659-020-00257-x

4. Zeng L., Watanabe N., Yang Z. Understanding the biosyntheses and stress response mechanisms of aroma compounds in tea (Camellia sinensis) to safely and effectively improve tea aroma // Crit. Rev. Food Sci. 2019. N 59. P. 2321-2334. DOI:

10.1080/10408398.2018.1506907

5. Chen S., Li M., Zheng G., Wang T., Lin J., Wang S., Wang X., Chao Q, Cao S., Yang Z., Yu X. Metabolite Profiling of 14 Wuyi Rock Tea Cultivars Using UPLC-QTOF MS and UPLC-QqQ MS Combined with Chemometrics // Molecules. 2018. V. 23. N 2. P. 104. DOI: 10.3390/molecules23020104

6. Zakaryan H., Arabyan E., Oo A., Zandi K. Flavonoids: promising natural compounds against viral infections // Arch Virol. 2017. V. 162. N 9. P. 2539-2551. DOI: 10.1007/s00705-017-3417-y

7. Jo S., Kim S., Shin D.H., Kim M.-S. Inhibition of SARS-CoV 3CL protease by flavonoids // J Enzyme Inhib Med Chem. 2020. V. 35. N 1. P. 145-151. DOI: 10.1080/14756366.2019.1690480

8. Mhatre S., Naik S., PatravaleV. A molecular docking study of EGCG and theaflavin digallate with the druggable targets of SARS-CoV-2 // Comput Biol Med. 2021. N 129. Article number: 104137. DOI: 10.1016/j.compbiomed.2020.104137

9. Ahn D.-G., Shin H.-J., Kim M.-H., Lee S., Kim H.-S., Myoung J., Kim B.-T., Kim S.-J. Current Status of Epidemiology, Diagnosis, Therapeutics, and Vaccines for Novel Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) // J Microbiol Biotechnol. 2020. V. 30. N 3. P. 313-324. DOI: 10.4014/jmb.2003.03011

10. Hodgson S.H., Mansatta K., Mallett G., Harris V., Emary K.R.W., Pollard A.J. What defines an efficacious COVID-19 vaccine? A review of the challenges assessing the clinical efficacy of vaccines against SARS-CoV-2 // Lancet Infect Dis. 2021. V. 21. N 2. Article number: e26-e35. DOI: 10.1016/S1473-3099(20)30773-8

11. Abd El-Aziz T.M., Stockand J.D. Recent progress and challenges in drug development against COVID-19 coronavirus (SARS-CoV-2) - an update on the status // Infect Genet Evol. 2020. N 83. Article number: 104327. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104327

12. Report FDA. Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Revokes Emergency Use Authorization for Chloroquine and Hydroxychloroquine. URL: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-revokes-emergency-use-authorization-chloroquine-and (дата обращения: 25.03.2021)

13. Report World Health Organization. URL:

https://www.who.int/ru/news/item/04-07-2020-who-discontinues-hydroxychloroquine-and-lopinavir-ritonavir-treatment-arms-for-covid-19 (дата обращения: 25.03.2021)

14. Furuta Y., Komeno T., Nakamura T. Favipiravir (T-705), a broad spectrum inhibitor of viral RNA polymerase // Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2017. V. 93. N 7. P. 449-463. DOI: 10.2183/pjab.93.027

15. Li G., Clercq E.D. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) // Nat Rev Drug Discov. 2020. V. 19. N 3. P. 149-150. DOI: 10.1038/d41573-020-00016-0

16. Report. The drug was approved for the treatment of COVID-19 in the hospital settings in Russia on May 29, 2020, after an ongoing open-label randomized clinical trial had recruited 60 subjects on favipiravir. URL:

https://economictimes.indiatimes.com/industry/healthcare/biotech /pharmaceuticals/russian-drug-to-treat-covid-to-be-delivered-to-hospitals-in-june/articleshow/76131135.cms/2020 (дата обращения: 22.08.2020)

17. Doi Y., Hibino M., Ryota H., Michiko Y., Kasamatsu Y., Hirose M., Mutoh Y., Homma Y., Terada M., Ogawa T. et al. A Prospective, Randomized, Open-Label Trial of Early versus Late Favipiravir Therapy in Hospitalized Patients with COVID-19 // Antimicrob Agents Chemother. 2020. V. 64. N 12. Article number: e01897-20. DOI: 10.1128/AAC.01897-20

18. Joshi S., Parkar J., Ansari A., Vora A., Talwar D., Tiwaskar M., Patil S., Barkate H. Role of favipiravir in the treatment of COVID-19 // Int J Infect Dis. 2021. N 102. P. 501-508. DOI: 10.1016/j.ijid.2020.10.069

19. Pardo J., Shukla A.M., Chamarthi G., Gupte A. The journey of remdesivir: from Ebola to COVID-19 // Drugs Context. 2020. N 9. Article number: 2020-4-14. DOI: 10.7573/dic.2020-4-14

20. Batiha O., Al-Deeb T., Al-Zoubi E., Alsharu E. Impact of COVID-19 and other viruses on reproductive health // Andrologia. 2020. V. 52. N 9. Article number: e13791. DOI: 10.1111/and.13791

21. Чепурнов А.А., Шаршов К.А., Казачинская Е.И., Кононова Ю.В., Казачкова Е.А. и др. Антигенные свойства изолята коронавируса SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020, выделенного от пациента в Новосибирске // Журнал инфектологии. 2020. Т. 12. N 3. С. 42-50. DOI: 10.22625/2072-67322020-12-3-42-50

22. Case J.B., Bailey A.L., Kim A.S., Chen R.E., Diamond M.S. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2 // Virology. 2020. N 548. P. 39-48. DOI: 10.1016/j.virol.2020.05.015

23. Kazachinskaia E.I., Chepurnov A.A., Shcherbakov D.N, Kononova Yu.V., Shanshin D.V., Romanova V.D., Khripko O.P., Saroyan T.A., Gulyaeva M.A., Voevoda M.I., Shestopalov A.M. IgG Study of Blood Sera of Patients with COVID-19 // Patogens. 2021. V. 10. N 11. Article number: 1421. DOI: 10.3390/patogens10111421

24. Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Минздрав РФ, ЗАО «ИИА «Ремедиум, Москва. 2000. 398 с.

25. Hassan S.T.S., Berchova-Bimova K., Sudomova M., Malanik M., Smejkal K., Rengasamy K.R.R. In Vitro Study of Multi-Therapeutic Properties of Thymus bovei Benth. Essential Oil and Its Main Component for Promoting Their Use in Clinical Practice // J. Clin. Med. 2018. N 7. Article number: 283. DOI: 10.3390/jcm7090283

26. Cheng H.-Y., Lin L.-T., Huang H.-H., Yang C.-M., Lin C.-C. Yin Chen Hao Tang, a Chinese prescription, inhibits both herpes simplex virus type-1 and type-2 infections in vitro // Antiviral Res. 2008. V. 77. N 1. P. 14-9. DOI: 10.1016/j.antiviral.2007.08.012

27. Trujillo-Correa A.I., Quintero-Gil D.C., Diaz-Castillo F., Quiñones W., Robledo S.M., Martinez-Gutierrez M. In vitro and in silico antidengue activity of compounds obtained from Psidium guajava through bioprospecting // BMC Complement Altern Med. 2019. V. 19. N 1. Article number: 298. DOI: 10.1186/s12906-019-2695-1

28. Nyayanit D.A., Sarkale P., Baradkar S., Patil S., Yadav P.D., Shete-Aich A., Kalele K., Gawande P., Majumdar T., Jain R., Sapkal G. Transcriptome & viral growth analysis of SARS-CoV-2-infected Vero CCL-81 cells // Indian J Med Res. 2020. V. 152. N 1 & 2. P. 70-76. DOI: 10.4103/ijmr.IJM R_2257_20

29. Shahzad F., Anderson D., Najafzadeh M. The Antiviral, Anti-Inflammatory Effects of Natural Medicinal Herbs and Mushrooms and SARS-CoV-2 Infection // Nutrients. 2020. V. 12. N 9. Article number: 2573. DOI: 10.3390/nu12092573

30. Теплякова Т.В., Пьянков О.В., Скарнович М.О., Бормотов Н.И., Потешкина А.Л., Овчинникова А.С., Косогова Т.А., Магеррамова А.В., Маркович Н.А., Филиппова Е.И. Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта гриба Inonotus obliquus. Пат. РФ N 2741714С1; опубл. 28.01.2021 в Бюл. N 4.

31. Wang C., Ming H., Jia W., Su W., Zhan L.-R., Luo D., Yang J.-Y. Analysis of medication regularity and pharmacodynamic characteristics of traditional Chinese medicine treatment in 444 severe cases of COVID-19 // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2020. V. 45. N 13. P. 3007-3012. DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20200427.501

32. Tolah A.M., Altayeb L.M., Alandijany T.A., Dwivedi V.D., El-Kafrawy S.A., Azhar E.I. Computational and In Vitro Experimental Investigations Reveal Anti-Viral Activity of Licorice and Glycyrrhizin against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 // Pharmaceuticals (Basel). 2021. V. 14. N 12. Article number: 1216. DOI: 10.3390/ph14121216

33. Vitalone A., Allkanjari O. Epilobium spp: Pharmacology and Phytochemistry // Phytother Res. 2018. V. 32. N 7. P. 1229-1240. DOI: 10.1002/ptr.6072

34. Lu Y., Jia Y., Xue Z., Li N., Liu J., Chen H. Recent Developments in Inonotus obliquus (Chaga mushroom) Polysaccharides: Isolation, Structural Characteristics, Biological Activities and Application // Polymers (Basel). 2021. V. 13. N 9. Article number: 1441. DOI: 10.3390/polym13091441

35. Wu C., Liu Y., Yang Y., Zhang P., Zhong W., Wang Y., Wang Q., Xu Y., Li M., Li X., Zheng M., Chen L., Li H. Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods // Acta Pharm Sin B. 2020. V. 10. N 5. P. 766-788. DOI: 10.1016/j.apsb.2020.02.008

36. Liu H., Ye F., Sun Q., Liang H., Li C., Li S., Lu R., Huang B., Tan W., Lai L. Scutellaria baicalensis extract and baicalein inhibit replication of SARS-CoV-2 and its 3C-like protease in vitro CoV-2 // J Enzyme Inhib Med Chem. 2021. V. 36. N 1. P. 497-503. DOI: 10.1080/14756366.2021.1873977

37. Song J., Zhang L., Xu Y., Yang D., Zhang L., Yang S., Zhang W., Wang J., Tian S., Yang S., Yuan Т., Liu A., Lv Q., Li F., Liu H., Hou B., Peng X., Lu Y., Du G. The comprehensive study on the therapeutic effects of baicalein for the treatment of COVID-19 in vivo and in vitro // Biochem Pharmacol. 2021. N 183. Article number: 114302. DOI: 10.1016/j.bcp.2020.114302

38. Ni W.-J., Chen X.-X., Wei S.-Y., Lan L.-L., Qiu R.-J., Ling Y.-P., Zhou D.-S., Wu Z.-M., Cao Z.-H., Yu C.-P., Zeng Y. Study on the mechanism of active components of Liupao tea on 3CL pro based on HPLC-DAD fingerprint and molecular docking technique // J Food Biochem. 2021. V. 45. N 5. Article number: e13707. DOI: 10.1111/jfbc.13707

39. Sargin S.A. Potential anti-influenza effective plants used in Turkish folk medicine: A review // J Ethnopharmacol. 2021. V. 265. Article number: 113319. DOI: 10.1016/j.jep.2020.113319

40. Rashed A.A., Rathi D.-N.G., Nasir N.A.H.A., Rahman A.Z.A. Antifungal Properties of Essential Oils and Their Compounds for Application in Skin Fungal Infections: Conventional and Nonconventional Approaches // Molecules. 2021. V. 26. N 4. Article number: 1093. DOI: 10.3390/molecules26041093

41. Truong Q.L., NguyenL.T., Babikian H.Y., Jha R.K., NguyenH.T., To T.L. Natural oil blend formulation as an anti-African swine fever virus agent in in vitro primary porcine alveolar macrophage culture // Vet World. 2021. V. 14. N 3. P. 794-802. DOI: 10.14202/vetworld.2021.794-802

42. Vicidomini C., Roviello V., Roviello G. Molecular Basis of the Therapeutical Potential of Clove (Syzygium aromaticum L.) and Clues to Its Anti-COVID-19 Utility // Molecules. 2021. V. 26. N 7. Article number: 1880. DOI: 10.3390/molecules26071880

43. Tragoolpua Y., Jatisatienr A. Anti-herpes simplex virus activities of Eugenia caryophyllus (Spreng.) // Phytother Res. 2007. V. 21. N 12. P. 1153-1158. DOI: 10.1002/ptr.2226

44. Hussein G., Miyashiro H., Nakamura N., Hattori M., Kakiuchi N., Shimotohno K. Inhibitory effects of Sudanese medicinal plant extracts on hepatitis C virus (HCV) protease // Phytother. Res. 2000. N 14. P. 510-516. DOI: 10.1002/1099-1573(200011)14:7<510::AID-PTR646>3.0.CO;2-B

45. Dai J.-P., Zhao X.-F., Zeng J., Wan Q.-Y., Yang J.-C., Li W.-Z., Chen X.-X., Wang G.-F., Li K.-S. Drug screening for autophagy inhibitors based on the dissociation of Beclin1-Bcl2 complex using BiFC

technique and mechanism of eugenol on anti-influenza A virus activity // PLoS ONE. 2013. N 8. Article number: e61026. DOI: 10.1371/journal.pone.0061026

46. Lane T., Anantpadma M., Freundlich J.S., Davey R.A., Madrid P.B., Ekins S. The natural product eugenol is an inhibitor of the ebola virus in vitro // Pharm. Res. 2019. N 36. P. 1-6. DOI: 10.1007/s11095-019-2629-0

47. Hassan S.T.S, Svajdlenka E., Berchova-Bimova K. Hibiscus sabdariffa L. and Its Bioactive Constituents Exhibit Antiviral Activity against HSV-2 and Anti-enzymatic Properties against Urease by an ESI-MS Based Assay // Molecules. 2017. V. 22. N 5. Article number: 722. DOI: 10.3390/molecules22050722

48. Takeda Y., Okuyama Y., Nakano H., Yaoita Y., Machida K., Ogawa

H., Imai K. Antiviral Activities of Hibiscus sabdariffa L. Tea Extract Against Human Influenza A Virus Rely Largely on Acidic pH but Partially on a Low-pH-Independent Mechanism // Food Environ Virol. 2020. V. 12(1). P. 9-19. DOI: 10.1007/s12560-019-09408-x

49. Aanouz I., Belhassan A., El-Khatabi K., Lakhlifi T., El-Ldrissi M., Bouachrine M. Moroccan Medicinal plants as inhibitors against SARS-CoV-2 main protease: Computational investigations // J Biomol Struct Dyn. 2021. V. 39. N 8. P. 2971-2979. DOI: 10.1080/07391102.2020.1758790

50. Adhikari B., Marasini B.P., Rayamajhee B., Bhattarai B.R., Lamichhane G., Khadayat K., Adhikari A., Khanal S. , Parajuli N. Potential roles of medicinal plants for the treatment of viral diseases focusing on COVID-19: A review // Phytother Res. 2021. V. 35. N 3. P. 1298-1312. DOI: 10.1002/ptr.6893

51. Мазуркова Н.А., Седельникова Н.В., Макаревич Е.В., Филиппова Е.И., Костина Н.Е., Кукушкина Т.А. Противовирусное средство на основе сухого экстракта лишайника Cetraria islandica. Пат. РФ N 2580305; опубл. 10.04.2016 Бюл. N 10.

52. Ishimoto K., Hatanaka N., Otani S., Maeda S., Xu B., Yasugi M., Moore J.E., Suzuki M., Nakagawa S., Yamasaki S. Tea crude extracts effectively inactivate severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 // Lett Appl Microbiol. 2022. V. 74. N 1. P. 2-7. DOI: 10.1111/lam.13591.

REFERENCES

I. Yu X., Xiao J., Chen S., Yu Y., Ma J., Lin Y., Li R., Lin J., Fu Z., Zhou Q., Chao Q., Chen L., Yang Z, Liu R. Metabolite signatures of diverse Camellia sinensis tea populations. Nat Commun., 2020, vol. 11, no. 1, article number: 5586. DOI: 10.1038/s41467-020-19441-1

2. Mhatre S., Srivastava T., Naik S., Patravale V. Antiviral activity of green tea and black tea polyphenols in prophylaxis and treatment of COVID-19: A review. Phytomedicine, 2021, vol. 85, article number: 153286. DOI: 10.1016/j.phymed.2020.153286

3. Wang L., Song J., Liu A., Xiao B., Li S., Wen Z., Lu Y., Du G. Research Progress of the Antiviral Bioactivities of Natural Flavonoids. Nat Prod Bioprospect., 2020, vol. 10, no. 5, pp. 271-283. DOI: 10.1007/s13659-020-00257-x

4. Zeng L., Watanabe N., Yang Z. Understanding the biosyntheses and stress response mechanisms of aroma compounds in tea (Camellia sinensis) to safely and effectively improve tea aroma. Crit. Rev. FoodSci., 2019, no. 59, pp. 2321-2334. DOI: 10.1080/10408398.2018.1506907

5. Chen S., Li M., Zheng G., Wang T., Lin J., Wang S., Wang X., Chao Q., Cao S., Yang Z., Yu X. Metabolite Profiling of 14 Wuyi Rock Tea Cultivars Using UPLC-QTOF MS and UPLC-QqQ MS Combined with Chemometrics. Molecules, 2018, vol. 23, no. 2, pp. 104. DOI: 10.3390/molecules23020104

6. Zakaryan H., Arabyan E., Oo A., Zandi K. Flavonoids: promising natural compounds against viral infections. Arch Virol., 2017, vol. 162, no. 9, pp. 2539-2551. DOI: 10.1007/s00705-017-3417-y

7. Jo S., Kim S., Shin D.H., Kim M.-S. Inhibition of SARS-CoV 3CL protease by flavonoids. J Enzyme Inhib Med Chem., 2020, vol. 35, no. 1, pp. 145-151. DOI: 10.1080/14756366.2019.1690480

8. Mhatre S., Naik S., Patravale V. A molecular docking study of EGCG and theaflavin digallate with the druggable targets of SARS-CoV-2. Comput Biol Med., 2021, no, 129, article number: 104137. DOI: 10.1016/j.compbiomed.2020.104137

9. Ahn D.-G., Shin H.-J., Kim M.-H., Lee S., Kim H.-S., Myoung J., Kim B.-T., Kim S.-J. Current Status of Epidemiology, Diagnosis, Therapeutics, and Vaccines for Novel Coronavirus Disease 2019

(COVID-19). J Microbiol Biotechnol., 2020, vol. 30, no. 3, pp. 313-324. DOI: 10.4014/jmb.2003.03011

10. Hodgson S.H., Mansatta K., Mallett G., Harris V., Emary K.R.W., Pollard A.J. What defines an efficacious COVID-19 vaccine? A review of the challenges assessing the clinical efficacy of vaccines against SARS-CoV-2. Lancet Infect Dis., 2021, vol. 21, no. 2, article number: e26-e35. DOI: 10.1016/S1473-3099(20)30773-8

11. Abd El-Aziz T.M., Stockand J.D. Recent progress and challenges in drug development against COVID-19 coronavirus (SARS-CoV-2) - an update on the status. Infect Genet Evol., 2020, no. 83, article number: 104327. DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104327

12. Report FDA. Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Revokes Emergency Use Authorization for Chloroquine and Hydroxychloroquine. Available at: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-revokes-emergency-use-authorization-chloroquine-and (accessed 25.03.2021)

13. Report World Health Organization. Available at: https://www.who.int/ru/news/item/04-07-2020-who-discontinues-hydroxychloroquine-and-lopinavir-ritonavir-treatment-arms-for-covid-19 (accessed 25.03.2021)

14. Furuta Y., Komeno T., Nakamura T. Favipiravir (T-705), a broad spectrum inhibitor of viral RNA polymerase. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci., 2017, vol. 93, no. 7, pp. 449-463. DOI: 10.2183/pjab.93.027

15. Li G., Clercq E.D. Therapeutic options for the 2019 novel coronavirus (2019-nCoV). Nat Rev Drug Discov., 2020, vol. 19, no. 3, pp. 149-150. DOI: 10.1038/d41573-020-00016-0

16. Report. The drug was approved for the treatment of COVID-19 in the hospital settings in Russia on May 29, 2020, after an ongoing open-label randomized clinical trial had recruited 60 subjects on favipiravir. Available at:

https://economictimes.indiatimes.com/industry/healthcare/biotech /pharmaceuticals/russian-drug-to-treat-covid-to-be-delivered-to-hospitals-in-june/articleshow/76131135.cms/2020 (accessed 22.08.2020)

17. Doi Y., Hibino M., Ryota H., Michiko Y., Kasamatsu Y., Hirose M., Mutoh Y., Homma Y., Terada M., Ogawa T. et al. A Prospective, Randomized, Open-Label Trial of Early versus Late Favipiravir Therapy in Hospitalized Patients with COVID-19. Antimicrob Agents Chemother., 2020, vol. 64, no. 12, article number: e01897-20. DOI: 10.1128/AAC.01897-20

18. Joshi S., Parkar J., Ansari A., Vora A., Talwar D., Tiwaskar M., Patil S., Barkate H. Role of favipiravir in the treatment of COVID-19. Int J Infect Dis., 2021, no. 102, pp. 501-508. DOI: 10.1016/j.ijid.2020.10.069

19. Pardo J., Shukla A.M., Chamarthi G., Gupte A. The journey of remdesivir: from Ebola to COVID-19. Drugs Context., 2020, no. 9, article number: 2020-4-14. DOI: 10.7573/dic.2020-4-14

20. Batiha O., Al-Deeb T., Al-Zoubi E., Alsharu E. Impact of COVID-19 and other viruses on reproductive health. Andrologia, 2020, vol. 52, no. 9, article number: e13791. DOI: 10.1111/and.13791

21. Chepurnov A.A., Sharshov K.A., Kazachinskaya E.I., Kononova Yu.V., Kazachkova E.A., Khripko O.P., Yurchenko K.S., Alekseev A.Yu., Voevoda M.I., Shestopalov A.M. Antigenic properties of sARs-CoV-2/human/RUs/nsk-FRCFtM-1/2020 coronavirus isolate from a patient in Novosibirsk. JournalInfectology, 2020, vol. 12, no. 3, pp. 42-50. (In Russian) DOI: 10.22625/2072-6732-2020-12-3-42-50

22. Case J.B., Bailey A.L., Kim A.S., Chen R.E., Diamond M.S. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology, 2020, no. 548, pp. 39-48. DOI: 10.1016/j.virol.2020.05.015

23. Kazachinskaia E.I., Chepurnov A.A., Shcherbakov D.N, Kononova Yu.V., Shanshin D.V., Romanova V.D., Khripko O.P., Saroyan T.A., Gulyaeva M.A., Voevoda M.I., Shestopalov A.M. IgG Study of Blood Sera of Patients with COVID-19. Patogens, 2021, vol. 10, no. 11, article number: 1421. DOI: 10.3390/patogens10111421

24. Fisenko V.P. Rukovodstvo po eksperimental'nomu (doklinicheskomu) izucheniyu novykh farmakologicheskikh veshchestv [Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances]. Moscow, Ministry of Health of the Russian Federation, closed joint-stock company «IIA» Remedium, 2000, 398 p. (In Russian)

25. Hassan S.T.S., Berchova-Bimova K., Sudomova M., Malanik M., Smejkal K., Rengasamy K.R.R. In Vitro Study of Multi-Therapeutic Properties of Thymus bovei Benth. Essential Oil and Its Main

Component for Promoting Their Use in Clinical Practice. J. Clin. Med., 2018, no. 7, article number: 283. DOI: 10.3390/jcm7090283

26. Cheng H.-Y., Lin L.-T., Huang H.-H., Yang C.-M., Lin C.-C. Yin Chen Hao Tang, a Chinese prescription, inhibits both herpes simplex virus type-1 and type-2 infections in vitro. Antiviral Res., 2008, vol. 77, no. 1, pp. 14-9. DOI: 10.1016/j.antiviral.2007.08.012

27. Trujillo-Correa A.I., Quintero-Gil D.C., Diaz-Castillo F., Quiñones W., Robledo S.M., Martinez-Gutierrez M. In vitro and in silico antidengue activity of compounds obtained from Psidium guajava through bioprospecting. BMC Complement Altern Med., 2019, vol. 19, no. 1, article number: 298. DOI: 10.1186/s12906-019-2695-1

28. Nyayanit D.A., Sarkale P., Baradkar S., Patil S., Yadav P.D., Shete-Aich A., Kalele K., Gawande P., Majumdar T., Jain R., Sapkal G. Transcriptome & viral growth analysis of SARS-CoV-2-infected Vero CCL-81 cells. Indian J Med Res., 2020, vol. 152, no. 1 & 2, pp. 70-76. DOI: 10.4103/ijmr.IJMR_2257_20

29. Shahzad F., Anderson D., Najafzadeh M. The Antiviral, Anti-Inflammatory Effects of Natural Medicinal Herbs and Mushrooms and SARS-CoV-2 Infection. Nutrients, 2020, vol. 12, no. 9, article number: 2573. DOI: 10.3390/nu12092573

30. Teplyakova T.V., Pyankov O.V., Skarnovich M.O., Bormotov N.I., Poteshkina A.L., Ovchinnikova A.S., Kosogova T.A., Magerramova A.V., Markovich N.A., Filippova E.I. Ingibitor replikatsii koronavirusa SARS-CoV-2 na osnove vodnogo ekstrakta griba Inonotus obliquus [An inhibitor of SARS-CoV-2 coronavirus replication based on an aqueous extract of the fungus Inonotus obliquus]. Patent of the Russian Federation no. 2741714C1 published in Bulletin of Inventions no. 4 28.01.2021. (In Russian)

31. Wang C., Ming H., Jia W., Su W., Zhan L.-R., Luo D., Yang J.-Y. Analysis of medication regularity and pharmacodynamic characteristics of traditional Chinese medicine treatment in 444 severe cases of COVID-19. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 2020, vol. 45, no. 13, pp. 3007-3012. DOI: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20200427.501

32. Tolah A.M., Altayeb L.M., Alandijany T.A., Dwivedi V.D., El-Kafrawy S.A., Azhar E.I. Computational and In Vitro Experimental Investigations Reveal Anti-Viral Activity of Licorice and Glycyrrhizin against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Pharmaceuticals (Basel), 2021, vol. 14, no. 12, article number: 1216. DOI: 10.3390/ph14121216

33. Vitalone A., Allkanjari O. Epilobium spp: Pharmacology and Phytochemistry. Phytother Res., 2018, vol. 32, no. 7, pp. 1229-1240. DOI: 10.1002/ptr.6072

34. Lu Y., Jia Y., Xue Z., Li N., Liu J., Chen H. Recent Developments in Inonotus obliquus (Chaga mushroom) Polysaccharides: Isolation, Structural Characteristics, Biological Activities and Application. Polymers (Basel), 2021, vol. 13, no. 9, article number: 1441. DOI: 10.3390/polym13091441

35. Wu C., Liu Y., Yang Y., Zhang P., Zhong W., Wang Y., Wang Q, Xu Y., Li M., Li X., Zheng M., Chen L., Li H. Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods. Acta Pharm Sin B., 2020, vol. 10, no. 5, pp. 766-788. DOI: 10.1016/j.apsb.2020.02.008

36. Liu H., Ye F., Sun Q, Liang H., Li C., Li S., Lu R., Huang B., Tan W., Lai L. Scutellaria baicalensis extract and baicalein inhibit replication of SARS-CoV-2 and its 3C-like protease in vitro CoV-2. J Enzyme Inhib Med Chem., 2021, vol. 36, no. 1, pp. 497-503. DOI: 10.1080/14756366.2021.1873977

37. Song J., Zhang L., Xu Y., Yang D., Zhang L., Yang S., Zhang W., Wang J., Tian S., Yang S., Yuan T., Liu A., Lv Q, Li F., Liu H., Hou B., Peng X., Lu Y., Du G. The comprehensive study on the therapeutic effects of baicalein for the treatment of COVID-19 in vivo and in vitro. Biochem Pharmacol., 2021, no. 183, article number: 114302. DOI: 10.1016/j.bcp.2020.114302

38. Ni W.-J., Chen X.-X., Wei S.-Y., Lan L.-L., Qiu R.-J., Ling Y.-P., Zhou D.-S., Wu Z.-M., Cao Z.-H., Yu C.-P., Zeng Y. Study on the mechanism of active components of Liupao tea on 3CL pro based on HPLC-DAD fingerprint and molecular docking technique. J Food Biochem., 2021. V. 45. N 5. Article number: e13707. DOI: 10.1111/jfbc.13707

39. Sargin S.A. Potential anti-influenza effective plants used in Turkish folk medicine: A review. J Ethnopharmacol., 2021, vol. 265, article number: 113319. DOI: 10.1016/j.jep.2020.113319

40. Rashed A.A., Rathi D.-N.G., Nasir N.A.H.A., Rahman A.Z.A. Antifungal Properties of Essential Oils and Their Compounds for

Application in Skin Fungal Infections: Conventional and Nonconventional Approaches. Molecules, 2021, vol. 26, no. 4, article number: 1093. DOI: 10.3390/molecules26041093

41. Truong Q.L., Nguyen L.T., Babikian H.Y., Jha R.K., Nguyen H.T., To T.L. Natural oil blend formulation as an anti-African swine fever virus agent in in vitro primary porcine alveolar macrophage culture. Vet World., 2021, vol. 14, no. 3, pp. 794-802. DOI: 10.14202/vetworld.2021.794-802

42. Vicidomini C., Roviello V., Roviello G. Molecular Basis of the Therapeutical Potential of Clove (Syzygium aromaticum L.) and Clues to Its Anti-COVID-19 Utility. Molecules, 2021, vol. 26, no. 7, article number: 1880. DOI: 10.3390/molecules26071880

43. Tragoolpua Y., Jatisatienr A. Anti-herpes simplex virus activities of Eugenia caryophyllus (Spreng.). Phytother Res., 2007, vol. 21, no. 12, pp. 1153-1158. DOI: 10.1002/ptr.2226

44. Hussein G., Miyashiro H., Nakamura N., Hattori M., Kakiuchi N., Shimotohno K. Inhibitory effects of Sudanese medicinal plant extracts on hepatitis C virus (HCV) protease. Phytother. Res., 2000, no. 14, pp. 510-516. DOI: 10.1002/1099-1573(200011)14:7<510::AID-PTR646>3.0.OT;2-B

45. Dai J.-P., Zhao X.-F., Zeng J., Wan Q.-Y., Yang J.-C., Li W.-Z., Chen X.-X., Wang G.-F., Li K.-S. Drug screening for autophagy inhibitors based on the dissociation of Beclin1-Bcl2 complex using BiFC technique and mechanism of eugenol on anti-influenza A virus activity. PLoS ONE, 2013, no. 8, article number: e61026. DOI: 10.1371/journal.pone.0061026

46. Lane T., Anantpadma M., Freundlich J.S., Davey R.A., Madrid P.B., Ekins S. The natural product eugenol is an inhibitor of the ebola virus in vitro. Pharm. Res., 2019, no. 36, pp. 1-6. DOI: 10.1007/s11095-019-2629-0

47. Hassan S.T.S, Svajdlenka E., Berchovâ-Bimovâ K. Hibiscus sabdariffa L. and Its Bioactive Constituents Exhibit Antiviral Activity against HSV-2 and Anti-enzymatic Properties against Urease by an ESI-MS Based Assay. Molecules, 2017, vol. 22, no. 5, article number: 722. DOI: 10.3390/molecules22050722

48. Takeda Y., Okuyama Y., Nakano H., Yaoita Y., Machida K., Ogawa H., Imai K. Antiviral Activities of Hibiscus sabdariffa L. Tea Extract Against Human Influenza A Virus Rely Largely on Acidic pH but Partially on a Low-pH-Independent Mechanism. Food Environ Virol., 2020, vol. 12(1), pp. 9-19. DOI: 10.1007/s12560-019-09408-x

49. Aanouz I., Belhassan A., El-Khatabi K., Lakhlifi T., El-Ldrissi M., Bouachrine M. Moroccan Medicinal plants as inhibitors against SARS-CoV-2 main protease: Computational investigations. J Biomol Struct Dyn., 2021, vol. 39, no. 8, pp. 2971-2979. DOI: 10.1080/07391102.2020.1758790

50. Adhikari B., Marasini B.P., Rayamajhee B., Bhattarai B.R., Lamichhane G., Khadayat K., Adhikari A., Khanal S., Parajuli N. Potential roles of medicinal plants for the treatment of viral diseases focusing on COVID-19: A review. Phytother Res., 2021, vol. 35, no. 3, pp. 1298-1312. DOI: 10.1002/ptr.6893

51. Mazurkova N.A., Sedelnikova N.V., Makarevich E.V., Filippova E.I., Kostina N.E., Kukushkina T.A. Protivovirusnoe sredstvo na osnove sukhogo ekstrakta lishainika Cetraria islandica [Antiviral agent based on dry extract of lichen Cetraria islandica]. Russian Patent no. 2580305 published in Bulletin of Inventions no. 10 of 10.04.2016. (In Russian)

52. Ishimoto K., Hatanaka N., Otani S., Maeda S., Xu B., Yasugi M., Moore J.E., Suzuki M., Nakagawa S., Yamasaki S. Tea crude extracts effectively inactivate severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Lett ApplMicrobiol., 2022, vol. 74, no. 1, pp. 2-7. DOI: 10.1111/lam.13591

КРИТЕРИИ АВТОРСТВА

Елена И. Казачинская внесла идею исследования, оформила литературный обзор, приготовила водные экстракты растительного сырья, провела эксперименты по реакции нейтрализации вируса и обработку результатов. Александр А. Чепурнов и Арсения А. Шелемба культивировали инфекционный SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020. Юлия В. Кононова провела титрование вируса и подготовку аликвот с определенным инфекционным титром. Владимир В. Романюк разработал чайные композиции. Магомед Г. Магомедов корректировал рукопись до подачи в редакцию. Александр М. Шестопалов руководил организационной частью исследования. Все авторы в равной степени участвовали в написании рукописи, и несут ответственность при обнаружении плагиата, самоплагиата или других неэтических проблем.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Elena I. Kazachinskaia presented the idea of the study, designed a literary review, prepared aqueous extracts of plant raw materials, conducted experiments on the virus neutralization reaction and processing the results. Alexander A. Chepurnov and Arseniya A. Shelemba cultivated infectious CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020. Yulia V. Kononova carried out titration of the virus and preparation of aliquots with a specified infectious titer. Vladimir V. Romanyuk developed tea compositions. Magomed G. Magomedov corrected the manuscript prior to submission to the Editor. Alexander M. Shestopalov led the organizational part of the study. All authors participated in the discussion of the results obtained in the format of a scientific discussion. All authors are equally participated in the writing of the manuscript and are responsible for plagiarism, self-plagiarism and other ethical transgressions.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ NO CONFLICT OF INTEREST DECLARATION

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. The authors declare no conflict of interest.

ORCID

Елена И. Казачинская / Elena I. Kazachinskaia https://orcid.org/0000-0002-1856-6147 Александр А. Чепурнов / Аlexander А. Chepurnov https://orcid.org/0000-0002-5966-8633 Юлия В. Кононова / Yulia V. tononova https://orcid.org/0000-0002-3677-3668 Арсения А. Шелемба / Аrseniya А. Shelemba https://orcid.org/0000-0001-7840-1478 Владимир В. Романюк / Vladimir V. Romanyuk https://orcid.org/0000-0002-6860-9168 Магомед Г. Магомедов / Magomed G. Magomedov https://orcid.org/0000-0003-1897-6784 Александр М. Шестопалов / Аlexander М. Shestopalov https://orcid.org/0000-0002-9734-0620