CC BY
64. Онищенко Г.Г. // Гиг. и сан. 2009. № 1. С. 5. Рапапорт Л.И., Ливый Г.В., Лепихова С.В. // 29—33. Гиг. труда. 1978. № 11. С. 50—51.
Поступила 05.05.09
КРАТКИЕ СООБШЕНПЯ
J
УДК 577.212:611-013.1-057
М.Г. Домшлак, Е.Н. Макарова-Землянская
информационное письмо «о необходимости расширения генетических исследований при оценке влияния химических веществ на половую функцию работников»
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт медицины труда
РАМН, Москва
На основании данных собственных исследований и литературы показана необходимость расширения генетических исследований при оценке влияния химических веществ на половую функцию работников.
Ключевые слова: соматические и половые клетки, генетическая чувствительность, доминантные летальные мутации, генные мутации, метод FISH.
M.G. Domshlak, E.N. Makarova-Zemlianskaya. Information letter «On necessity of wider genetic research in evaluating influence of chemicals on workers' sexual function». The author demonstrates own research data and literature review to justify a necessity of wider genetic research in evaluating influence of chemicals on workers' sexual function.
Key words: somatic and sex cells, genetic sensitivity, dominant lethal mutations, genetic mutations, FISH method.
Неблагоприятные эффекты загрязнения окружающей среды могут проявляться не только у ныне живущих, но и в последующих поколениях вследствие повреждения генетического аппарата клеток — молекулы ДНК, что, в свою очередь приводит к возникновению мутаций в половых и соматических клетках.
Сегодня уже ни у кого не вызывает сомнений, что генные мутации обусловливают возникновение аномальных беременностей, заканчивающихся либо спонтанными абортами при нормальном кариотипе, либо нарушением внутриутробного развития плода.
Наибольшую опасность представляют наследуемые мутации, возникающие в половых клетках, в первую очередь в стволовых клетках, и проходящие через сито митоза и меойза. К этому типу мутаций относятся такие нарушения хромосом, как реципрокные транслокации, вызывающие полустерильность и наследственные заболевания.
Доминантные летальные мутации (ДЛМ), возникающие в мужских половых клетках, включая стволовые сперматогонии, приводят к временной стерильности, внутриутробной гибели (спонтанные аборты) на протяжении всего цикла сперматогенеза.
Цитогенетические исследования материала спонтанных абортов показали, что они обусловлены как хромосомными нарушениями (50 %), так и генными и ДЛМ (50 %).
Кроме того, морфологические дефекты у новорожденных формируются в результате образования мутаций хромосом de novo. Нарушения хромосом могут возникать во время 1) гамето-генеза у любого из родителей, 2) после зачатия: по-видимому, в этот период на разных стадиях внутриутробного развития развивается мозаи-цизм в результате нарушения хромосом. Степень проявления мозаицизма зависит от времени возникновения мутаций хромосом.
В связи с указанным необходимо в экспериментальных условиях изучать действие химических веществ на возможное проявление генетических последствий в половых клетках самцов и самок лабораторных животных.
Интерес к определению генетической чувствительности половых и соматических клеток к неблагоприятным воздействиям возник в связи с выяснением вопроса: можно ли экстраполировать результаты индуцированного мутагенеза в соматических клетках на половые? Положительное решение вопроса позволило бы значительно облегчить проведение как клинических, эпидемиологических, так и экспериментальных исследований.
Вместе с тем проведение сравнительных исследований чувствительности клеток с использованием одного и того же показателя, как частота ХА в лимфоцитах и половых клетках, нельзя было проводить вследствие отсутствия методики определения ХА в половых клетках человека. Только в 80-х гг. прошлого столетия были разработаны тесты по определению ХА в половых клетках [9].
В лаборатории токсикологии НИИ медицины труда РАМН сравнение генетической чувствительности половых и соматических клеток, как правило, проводили на клетках костного мозга и стволовых сперматогониев, поскольку, во-первых, за счет репопуляции последних происходит восстановление сперматогенеза, и следовательно, возникшие в них мутации сохраняются в течение всего репродуктивного периода, и, во-вторых, эти клетки более чувствительны к низ-кодозовому воздействию химических веществ. В качестве показателей определяли частоту ХА и генных мутаций (с-кк) в пигментных клетках гетерозигот первого поколения однолокусной линии мышей WR; ДЛМ и фрагментацию ДНК в половых.
Результаты исследований показали, что генетическая чувствительность половых и соматических клеток зависит от величины дозы (концентрации), структуры — активности и тропности химического соединения (таблица). Так, стволовые сперматогонии в 10 раз чувствительнее к низкодозовому воздействию этиленимина, чем соматические (с-кк): пороговая доза в первом случае — 1/500 Ьт, во втором — 1/50 Ьт [1]. Установлена одинаковая генетическая чувствительность этих клеток к действию бихромата натрия и сульфата никеля — пороговый уровень 1/10ПДК и =1/20 Ьт, соответственно [2, 6]. Ингаляция диметилсульфата и формальдегида [3, 4] не влияла на увеличение частоты ДЛМ в
половых клетках мышей на разных стадиях сперматогенеза, увеличивая частоту ХА в клетках костного мозга и лимфоцитах периферической крови рабочих, а также генных мутаций в соматических клетках гетерозиготных мышей WR первого поколения. Ингаляционное воздействие стирола [7] не вызывало цитогенетический эффект в соматических клетках, увеличивая частоту ДЛМ в половых клетках мышей только в концентрации, превышающей в 48 раз установленную в РФ ПДК.
Данные литературы также показывают различие в генетической чувствительности половых и соматических клеток. Так, сравнение генетической чувствительности сперматозоидов и лейкоцитов к действию ДДТ методом флуоресцентной гибридизации in situ (mFISH) в одиночных клетках выявило, что ядра сперматозоидов в 12,7 раза чувствительнее к щелочной денатурации ядер лейкоцитов [10].
В 80-х гг. прошлого столетия был разработан и предложен новый метод — межвидовой IVF системы гибридизации сперматозоидов человека и ооцитов золотистого хомячка, затем — интерфазной флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Эти методы стали использовать для непосредственного анализа хромосом в сперме человека, что позволило определять нарушения мужской репродуктивности по установлению корреляции между морфологией сперматозоида и его генетическим аппаратом: частотой количественных и структурных нарушений хромосом.
Результаты, полученные с использованием этого метода, подтвердили, что частота аберраций хромосом в нормозоосперме у мужчин, обладающих оплодотворяющей способностью, составляет 5—7 %. В норме сперматозоиды значительно отличаются по частоте специфических классов аномалий хромосом. Эти вариации могут
сравнение генетической чувствительности половых и соматических клеток к действию химических веществ
Вещество Уровень Клетки
половые сомати-
ческие
Этиленимин 1/50 Lim + +wy
1/500 Lim ' ac + - wy
Диметилсульфат 2,9 ПДК - +
> 200 ПДК - + wy
Формальдегид 50 ПДК - +
Бихромат натрия «0,1 ПДК + +
Сульфат никеля 1/10 Lim + +
«1/20 Limac + фрагмен- -
тация ДНК
Стирол > 48 ПДК + -
существовать в течение длительного времени и быть связаны с анеуплоидией в клетках крови. Кроме того, метод FISH позволяет выяснять проявление этих вариаций для идентификации мутагенов, вызывающих генетический эффект в половых клетках.
Исследования последних лет показали наличие прямой корреляции между основными параметрами спермограммы и частотой числовых нарушений хромосом.
Сравнение генетической чувствительности половых и соматических клеток человека в основном выполнено на онкологических больных, подвергавшихся радио- и/или химиотерапии. При этом показана большая генетическая чувствительность половых клеток к действию ионизирующей радиации (40—500 рад), чем соматических. Со временем после окончания радиотерапии частота ХА в лимфоцитах восстанавливалась до контрольного уровня. В стволовых сперматогониях частота ХА оставалась увеличенной на протяжении от 2 до 5 —18 лет после радио- и химиотерапии, превышая уровень ХА в лимфоцитах в 5 раз [8]. Приведенные результаты исследований показывают, что в большинстве случаев различная генетическая чувствительность мужских половых и соматических клеток к действию химических мутагенов не позволяет экстраполировать увеличение частоты индуцированных мутаций в соматических клетках на половые.
Необходимо отметить, что объем проведенных экспериментальных исследований по влиянию химических соединений на ооциты лабораторных животных невелик. В основном, генетический эффект агентов изучен на клеточном уровне.
Анализ приведенных в литературе работ по влиянию неблагоприятных факторов на ооциты мышей, крыс, морских свинок, обезьян и др. показывает различную генетическую чувствительность стадий развития ооцитов к действию химических соединений — циклофосфамида, трипафлавина, никотина.
Из приведенных данных литературы следует, что действие химических веществ увеличивает частоту ДЛМ, повреждений хромосом, локус-ных мутаций, врожденных уродств не только у экспериментальных животных, но нарушает и женскую репродуктивность.
Исследование генетической чувствительно-сти половых клеток самцов и самок к действию химических соединений показало большую чувствительность половых клеток самцов. Например, при действии хлорамбуцила половые клетки самцов генетически чувствительнее зрелых ооци-
тов мышей по таким показателям, как локусные мутации, ДЛМ и нарушения ДНК. Действие блеомицина индуцировало только увеличение нарушений ДНК в зрелых ооцитах [11].
Подобно, по нашим данным, однократное введение сульфата никеля на уровнях от 1/20 до 72 Ьт и бензола на уровнях 0,65; 0,13 и 0,025 ДЛ50 не вызывало увеличения частоты ДЛМ в гетерогенной популяции ооцитов (от преовуля-торной стадии до зрелого ооцита) мышей WR.
Полученные результаты согласуются с данными литературы об отсутствии нарушения ре-продуктивности у мышей и крыс при однократном и хроническом воздействии солей никеля.
В то же время действие сульфата никеля на уровнях 1/10 и 1/20 Ьт индуцировало генетический эффект — увеличение частоты ДЛМ в половых клетках на разных стадиях сперматогенеза мышей WR. Воздействие на уровне ~1/20 Ьлт индуцировало — фрагментацию ДНК. Также действие бензола на уровне 0,65ДЛ50 увеличивало частоту ДЛМ в стволовых спер-матогониях.
Таким образом, действие сульфата никеля и бензола в выбранных условиях проведения эксперимента не вызывают генетический эффект на всех стадиях развития ооцитов.
Полученные результаты согласуются с данными литературы об отсутствии нарушений ре-продуктивности у мышей и крыс при однократном и хроническом воздействии солей никеля. В то же время однократное введение сульфата никеля индуцировало генетический эффект — увеличение частоты ДЛМ в половых клетках на разных стадиях сперматогенеза мышей WR. Воздействие на уровне ~1/20 Ьт вызывало — фрагментацию ДНК.
Различие в генетической чувствительности половых клеток объясняется различием механизма гаметогенеза у самцов и самок, а также числом делений в половых клетках. У женщин число делений половых клеток — величина постоянная, равная 24. Общее число клеточных делений у мужчин на протяжении жизни составляет приблизительно 310 делений. В большинстве случаев ошибка во время репликации ДНК приводит к возникновению крупных мутаций. На основании этого можно предположить, что частота мутаций у мужчин будет существенно выше, чем у женщин [5].
Из приведенных данных литературы и собственных результатов следует, что при воздействии химических факторов на целостный организм мужские половые клетки генетически чувствительнее женских.
Необходимо еще раз подчеркнуть, что крайне мало работ по изучению генетического действия химических соединений на ооциты лабораторных животных. Следовательно, необходимо продолжить исследования в этом направлении, а также дальнейшую разработку молекулярных методов исследования ооцитов. Кроме того, проводить работы по исследованию митохондриальной (ау-тосомальной) наследственности по материнской линии.
Таким образом, только использование тестов, определяющих генетические нарушения на молекулярном и клеточном уровнях, дает корректную оценку мутагенного эффекта тестируемых соединений. Это объясняется тем, что одни типы нарушений ДНК могут репарироваться, другие элиминироваться. Так, в случае определения генетического эффекта сульфата никеля в половых клетках самцов порог по частоте ДЛМ (~1/20 Lim ), по фрагментации ДНК (~1/10 Lim ).
Й ы в о д ы. Из изложенного следует, что при определении генетической опасности не изученных химических соединений в токсикологических исследованиях необходимо: 1) проводить исследования на низких уровнях воздействия, которым реально подвергается человек, и определять пороговые уровни мутагенного действия, позволяющие регламентировать воздействие химических соединений на производстве и в быту; 2) использовать батарею тестов, определяющих в первую очередь наследуемые мутации в половых и соматических клетках, как на клеточном, так и молекулярном уровнях. При получении положительных результатов следует проводить клинико-гигиенические и эпидемиологические исследования; 3) для оценки генетического риска воздействия химических соединений на человека использовать наиболее перспективный подход — модель «человек /мышь», основанный на оценке спонтанного мутационного процесса у человека и индуцированного этими факторами мутагенеза у мышей.
Это позволит предупреждать возможные вредные последствия влияния промышленных химических веществ на половую функцию лиц, занятых в производстве и снижать генетический груз в последующих поколениях.
Информационное письмо утверждено Пленумом Научного совета Минздравсоцразвития РФ и РАМН № 47 по медико-экологическим проблемам здоровья работающих (27.02.2009).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Домшлак М.Г. // Сб. «Медицина труда на предприятиях г. Москвы». М., 1998. С. 148—150.
2. Домшлак М.Г. Потапенко А.А., Макарова-Землянская Е.Н. // Бюл. научного совета. «Медико-биологические проблемы работающих». 2004. № 4. С.
36—40.
3. Фоменко В.Н., Катосова ЛД., Глущенко В.И., Домшлак М.Г. и др. // Материалы конференции «Токсичность и опасность вредных химических веществ для практического здравоохранения», 1982 (депанировано).
4. Фоменко В.Н., Катосова ЛД., Домшлак М.Г. / / Тезисы докладов «Первый всесоюзный съезд медицинских генетиков». 1983. С. 348—349.
5. Dubrava Y.U. // Human Molecular Genetics. 1999. P. 2.
6. Fomenko V.N., Glushenko.V.I., Domchlak M.G. et. al. // Proceedings of the sixth Finnish-Soviet Joint Symposium on Occupational Health. Helsinki, 1987. P. 26—32.
7. FomenkoV.N., Domchlak M.G., Katosova L.D. et al. / / Proceeding of the Finish-Soviet Joint Symposium Industrial Hygiene and Toxicology. Helsinki, 1984. P. 48—57.
8. Genesca A., Barrious L., Cabalina M.R. et al. // Human Genet. 1990. Vol. 84. P. 353—355.
9. Martin R.H. // Cetogenetic. Ctll Gtntt. 1983. Vol. 35. P. 253—256.
10. Muriel L., Segrelles E., Goyanes V. and Fernandez L. // Molecular Human Reprodaction. 2004. Vol. 10, N 3. P. 1—7.
11. Russell L.B.; Hunsicker P.R.; Shelby M.D. // Mutat. Res. 1996. Vol. 358. P. 25—35.
Поступила 11.03.09
