CC BY
7УДК 615. 575. 66924
М.Г.Домшлак1, Е.Н.Макарова-Землянская1*, А.Н.Осипов2, А.Н.Елаков2, Н.Ю.Воробьева2 АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ ОРГАНИЗМА НА ВОЗДЕЙСТВИЕ СУЛЬФАТА НИКЕЛЯ
1ГУ Научно-исследовательский институт медицины труда РАМН, 2Объединенный эколого-технологический и научно-исследовательский центр по обезвреживанию радиоактивных отходов и охране окружающей среды «Радон», Москва
Предварительное однократное введение сульфата никеля в/ж в недействующей дозе 0,5 мг/кг (« 1/20 Limac) на 10-й день беременности и последующее повторное действие в дозах 0,5, 1 и 5 мг/кг (« 1/20—1/2 Limac) на половозрелых самцов и самок мышей первого поколения однолокусной линии WR вызывает адаптивный ответ — снижение частоты доминантных летальных мутаций в поздних сперматоцитах и стволовых сперматогониях мышей первого поколения и генных мутаций wy в соматических клетках мышей второго поколения.
Ключевые слова: сульфат никеля, адаптивный ответ, однолокусная линия мышей WR, доминантные летальные мутации, генные мутации (wy).
Введение. На современном уровне развития науки заслуживает внимания определение адаптации, предложенное Wolf C.R. с соавторами [23]. Адаптация к действию химических агентов окружающей среды — фундаментальная часть эволюционных процессов. Большое число генов в процессе эволюции выработало механизм, направленный на детоксикацию потенциально вредных химических агентов. Эти гены могут действовать на различных уровнях клетки; определять циркуляцию химических или токсических веществ в определенных концентрациях, а также норму поглощения и выделения — внутриклеточной детоксикации ферментов таких, как S-трансфераза, цитохром Р-450-зависимая мо-нооксигеназа и глютатион S-трансфераза. Эти мультигенные семейства протеинов играют центральную роль в детоксикации химических соединений и лекарств [23].
Частный случай адаптации — адаптивный ответ (АО) — одна из реакций клеток на последовательное воздействие вначале малых, а потом больших доз ионизирующей радиации и/или химических соединений [11]. Иными словами АО — «это формирование повышенной устойчивости клеток к высоким дозам мутагенов при предварительном воздействии малых доз...» [7]. Предположено, что действие в малой дозе переводит клетку в состояние «готовности» к репарации, в основном парных разрывов ДНК [11].
Механизм АО до сих пор недостаточно изучен. АО обусловлен активацией процессов репарации повреждений ДНК после облучения в адаптирующей дозе, инактивацией свободных радикалов, влиянием облучения на клеточный
* Фрагмент диссертационной работы
цикл, синтезом защитных белков [19, 22]. В процессе формирования АО участвуют белки р53, p38, различные протеинкиназы [18]. Нужно отметить, что ингибиторы этих протеинкиназ подавляют и АО. Отмечено сходство АО и гормезе-са [20, 21]. По мнению ряда авторов, после адаптирующего облучения усиливается пролиферация клеток в популяции, чем и объясняется АО у растений [8].
В основном, исследования АО проведены in vitro c использованием ионизирующего облучения.
По мнению ряда ученых, в этой проблеме важную роль могут играть тяжелые металлы, индуцирующие повреждения ДНК, не восстанавливающиеся клеткой в процессе канонической репарации [7].
Соединения никеля относятся к классу тяжелых металлов, вызывающих генотоксический, мутагенный и канцерогенный эффекты [4, 12, 13, 14, 17].
Результаты исследований, приведенные в литературе, показывают, что дисульфид никеля (Ni3S2) снижает частоту генных мутаций, индуцированных воздействием безпирена (материал приводится по Е.В.Перминовой и др.) [7]. Защитное действие никеля, определяемое по снижению частоты сестринских хроматидных обменов (СХО), обнаружено и в лимфоцитах человека по отношению к УФ- и рентгеновскому облучению и соединениям хрома (материал приводится по Е.В.Перминовой и др.) [7]. In vitro действие сульфата никеля в концентрации 10-14 М оказывает на лимфоциты человека незначительно выраженную стимуляцию репаративного синтеза ДНК, индуцированного воздействием этого соединения в высокой концентрации
10-7 М. В то же время, предварительное воздействие сульфата никеля в концентрации 10-7 М стимулировало репаративный синтез ДНК, индуцированный действием мутагена — 4-нитро-хинолин-1-оксид в концентрации 10-4 М. Это объясняется, по мнению авторов, «наличием перекрестного адаптивного ответа» — кросс-адаптации в опытах с сульфатом никеля [7].
В связи с указанным в задачу исследований входило определение АО при предварительном воздействии сульфата никеля на 10-дневных эмбрионов мышей самцов и самок однолокус-ной линии WR и повторном воздействии на половозрелых животных обоего пола первого поколения (Fj). В качестве показателей использовали:
- частоту доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в поздних сперматоцитах и стволовых сперматогониях у половозрелых самцов F1,
- частоту генных мутаций (wy) в соматических клетках мышей второго поколения (F2).
Материалы и методы исследования. Работа проведена на мышах самцах и самках одноло-кусной линии WR (генотип: aa + wy). Эти мыши происходят от скрещивания самок линии 129 (R-c X/129), генотип AwAw, cchp/cchp и самца В6, гетерозиготного по гену Wy. Ген Wy — доминантный, обуславливающий «регулярную» белую пятнистость и ослабление уровня пигментации у гетерозигот. Гомозиготы WyWy погибают после рождения от анемии. Мыши WR характеризуется высокой частотой мозаицизма, вызванной мутацией Dominant spotting viable (Wy) в W ло-кусе 5-ой хромосомы [2, 5]. Эта мутация вызывает изменение онкогена c-kit рецепторной ти-розинкиназы. Мутации W локуса — плейотроп-ны и в определенной степени влияют на пигментацию, развитие зародышевых клеток и ге-матопоэз. Ген c-kit участвует в процессах пролиферации и дифференциации нервных, тучных и мужских половых клеток. Этот ген расположен и в 4-ой хромосоме человека, что позволяет корректнее экстраполировать экспериментальные данные [24].
В эксперименте использовано 1269 мышей: для определения частоты ДМЛ — 428, генных мутаций (wy) — 841. Животных содержали на стандартном корме.
Частоту ДЛМ в половых клетках мышей WR определяли на стадиях поздних сперматоцитов и стволовых сперматогониев у самцов F1. Выбор этих стадий обусловлен тем, что: 1) ранее нами было показано, что поздние сперматоци-ты — наиболее генетически чувствительная стадия сперматогенеза к воздействию сульфата никеля в диапазоне доз 0,5—5,0 мг/кг [4]; 2) индуцированное увеличение частоты мутаций в ство-
ловых сперматогониях может сохраняться в течение всего репродуктивного периода.
Частоту ДЛМ определяли, согласно методическим рекомендациям [15] на 18 день беременности по постимплантационной гибели эмбрионов: 1. отношение числа погибших эмбрионов к числу мест имплантаций и 2. индуцированной гибели:
100% х (1 — постимплантационная гибель в опыте/постимплантационная гибель в контроле).
Этот показатель отсекает «естественный фон» — гибель эмбрионов в контрольной группе, что позволяет анализировать частоту ДЛМ, индуцированную действием именно тестируемого мутагена.
Мышам на 10-й день беременности в желудок однократно вводили сульфат никеля в недействующей дозе (ранее установленной по частоте ДЛМ в половых и генным мутациям с-кИ в соматических клетках) — 0,5 мг/кг (~ 1/20 Limac) [4]. Затем на подопытных двухмесячных самцов F1 воздействовали сульфатом никеля в дозах 0,5, 1,0 и 5,0 мг/кг (« 1/20-1/2 Limac).
Для регистрации генных мутаций в соматических клетках самкам вводили соль никеля на 10-11 дни беременности, т. к. в этот период развития эмбрионов, содержащих 150 меланоци-тов, происходит большая часть мутационных событий [16]. Частоту генных мутаций определяли по числу появления черных пятен у гетерозиготных мышей F1 и F2 на 2 и 4 неделях после рождения.
Статистический анализ полученных данных проводили по критерию значения которого удовлетворяет условию Р = Р < для распределения Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Исследование АО по частоте ДМЛ в половых клетках. Как видно из данных табл. 1, предварительное воздействие NiSO4 в дозе 0,5 мг/кг (~ 1/20 Limac) на десятидневные эмбрионы вызвало АО при последующем введении этого вещества в более высоких дозах 0,5-5,0 мг/кг у подопытных половозрелых самцов F1: снижение (р < 0,001) частоты ДЛМ на стадиях поздних сперматоцитов и стволовых сперматогониев до контрольного уровня. Защитный эффект предварительного воздействия в дозе 0,5 мг/кг проявился в снижении частоты ДЛМ по сравнению с индуцированной при однократном введении сульфата никеля в относительно больших дозах 1,0 и 5,0 мг/кг (р < 0,001) в половых клетках на этих же стадиях сперматогенеза.
Исследование АО по частоте генных мутаций с-k.it в соматических клетках. Предвари -тельное воздействие сульфата никеля в дозе 0,5
Таблица 1
АО по частоте ДЛМ в поздних сперматоцитах и стволовых сперматогониях самцов мышей WR при воздействии NiSO4
Доза, мг/кг Стадия сперматогенеза Самцы Беременные самки Фер-тиль- ность, % Места имплантаций Живые эмбрионы Мертвые эмбрионы Постимплантационная гибель
Воздействие
предварительное повтор-ное % (М±т) с учетом контроля,% (М±т)
0,5 5,0 Поздние спермато-циты 15 40 88,9 210 202 8 3,4±1,2 -
0,5 1,0 15 46 100 291 271 10 6,9±1,8 2,3±2,1
0,5 0,5 15 35 77,7 250 240 10 4,0±1,2 -
0,5 15 30 66,6 213 197 16 7,5±1,8 2,2±2,1
контроль 15 37 82,2 316 301 15 4,7±1,2 -
0,5 5,0 Стволовые сперма тогонии 10* 32 80 283 274 9 3,2±1,0 -
0,5 1,0 12* 39 81,2 319 301 18 5,7±1,3 2,0±1,6
0,5 0,5 14** 31 86,1 242 228 14 5,8±1,5 2,1±1,9
0,5 15** 43 95,5 363 347 10 4,5±1,1 1,0±1,5
контроль 15** 35 77,8 309 297 12 3,9±1,1 -
Примечание: * — подсадка: 1а* х ** — подсадка: 1сг* х
мг/кг (~1/20 Limac) на 10-ти дневных эмбрионов вызывало адаптивную реакцию при последующем введении этого вещества в интервале доз 0,5—5,0 мг/кг, половозрелым самкам F1 на 10-й день беременности — снижение частоты генных мутаций с-кк в пигментных клетках мышей F2 (см. табл. 2).
Таким образом, предварительное воздействие сульфата никеля в недействующей дозе (~ 1/20 Limac) на 10-дневные эмбрионы при повторном введении этого вещества в изученном интервале доз вызывает адаптивную реакцию — снижение частоты доминантных летальных и генных мутаций до контрольного уровня.
Защитный эффект предварительного воздействия сульфата никеля в недействующей дозе 0,5 мг/кг (по частоте ДЛМ в мужских половых клетках и генных в соматических клетках мышей F1,) при последующем введении в изученном ин-
тервале доз обусловлен тем, что первое воздействие вещества приходится на 10-й день внутриутробного развития. Известно, что на этой стадии эмбриогенеза происходит развитие органов, включая нервную систему. «Удар» на этой стадии переводит клетки эмбриона в состояние «готовности» к репарации в случае дальнейших неблагоприятных воздействий.
Полученные данные соответствуют ранее проведенным нами исследованиям АО на молекулярном уровне (метод ДНК-комет). АО изучали в лимфоцитах селезенки половозрелых самцов мышей линии WR. Предварительное введение двухмесячным самцам в дозе 0,5 мг/кг, а затем через 5 дней — в дозах 0,5—5,0 мг/кг показало, что:
- через 24 ч после воздействия АО — снижение однонитевых разрывов ДНК до контрольного уровня наблюдалось только при действии
Таблица 2
АО по частоте генных мутаций (wy) в соматических клетках гетерозиготных мышей F2 воздействии NiSO4
Доза, мг/кг Число просмотренных гетерозиготных мышей Р2 Число мозаиков по окраске шерсти Частота генных мутаций,% (М±т)
Воздействие
предварительное повторное
0,5* 204 58 28,4±3,1
0,5 5,0** 68 18 26,5±5,3
0,5 1,0** 64 15 24,6±5,2
0,5 0,5** 59 15 25,4±5,6
0,5** 53 16 30,2±6,3
Контроль 393 89 22,6±2,1
Примечание: * — F1, ** — F2
сульфата никеля в относительно малых дозах (0,5 и 1,0 мг/кг). При воздействии в дозе 5,0 мг/кг, напротив, происходило увеличение одно-нитевых разрывов ДНК в клетках селезенки.
- через 48 ч после предварительного воздействия сульфата никеля в дозе 0,5 мг/кг АО у половозрелых самцов — снижение однонитевых разрывов ДНК до контрольного уровня наступает при последующем введении вещества в изученном интервале доз.
Таким образом, защитный эффект предварительного воздействия сульфата никеля в относительно малой дозе 0,5 мг/кг (~ 1/20 Limac), выявленный, как на молекулярном [3], так и на клеточном уровнях, согласуется с данными литературы in vivo и in vitro [1, 9, 10].
Интересно отметить, что подобные результаты получены при облучении дрозофилы. Так, показано что предварительное воздействие ал-килирующих агентов — метил- и этилметан-сульфонатами (ММС, ЭМС) в относительно низких дозах (0,05—0,1 мМ) на взрослых самцов дрозофилы не влияло или даже усиливало цитотоксический и мутагенный эффекты в половых клетках на всех стадиях сперматогенеза. В то же время, предварительная обработка личинок дрозофил ЭМС вызывала защитный эффект от дальнейшего воздействия алкилятора в высоких дозах — снижало частоту ДМЛ, существенно повышала плодовитость самцов F: и F2. Заключено, что степень проявления АО зависит от развития дрозофилы, подвергнутой «ударному воздействию». Этот вывод основан на том факте, что у личинок максимальная защита. При воздействии на взрослый организм такая защита практически бы отсутствовала. Сделано предположение, что в данном случае АО обусловлен не репарацией, а другими защитными механизмами [10].
Соответствующие результаты получены и при исследовании радиоактивного адаптивного ответа (РАО), проведенном на трех- и пятисуточ-ных самках Drosophila melanogaster по частоте ДЛМ на разных стадиях органогенеза. Самок линии Canton-S предварительно облучали в малой (адаптивной) дозе 0,2 Гр и через 4,5—5 ч в большой дозе 2,2 Гр. Контрольных самок — только в дозе 2,2 Гр. Установлено, что облученные ооци-ты на стадии 14 — 7 клеток в относительно малой дозе (0,2 Гр) становятся устойчивыми к действию у-облучения в дозе, вызывающей генетический эффект — 2 Гр. Частота ДЛМ на этой стадии ооцитов достоверно (р < 0,001) снижалась по сравнению с контрольным уровнем [1].
В исследовании РАО в лимфоцитах периферической крови, стимулированных ФГА, пяти
здоровых доноров показано, что предварительное облучение в дозе 0,05 Гр и через 5 ч повторное воздействие в дозе 1,0 Гр вызвало защитный эффект у двух доноров: частота двуядерных клеток с микроядрами статистически ниже, чем после однократного облучения в дозе 1,0 Гр. Авторы заключили, что РАО возникает как за счет уменьшения числа поврежденных клеток, так и вследствие увеличения в популяции доли неповрежденных двуядерных клеток при постоянном числе поврежденных клеток [9].
На примере меланина показано, что введение естественных радиопротекторов вызывает защитный эффект. Автор рекомендует создавать и использовать новые естественные радиопротекторы для снижения генетических последствий длительного облучения [6]. Важно проведение подобных работ для защиты от мутагенного действия химических соединений. Это необходимо в первую очередь для защиты лиц, подвергающихся профессиональному воздействию мутагенов в течение длительного времени. Необходимо продолжение исследований АО для окончательного выяснения механизма его действия и разработки новых методологических подходов, защищающих людей от воздействия мутагенов.
Заключение. Предварительное воздействие сульфата никеля на уровне ~ 1/20 Limac на 10-дневных эмбрионов мышей WR вызывает адаптивный ответ у мышей F: в половых клетках и F2 в пигментных клетках — снижение частоты ДЛМ и генных мутаций, соответственно, при повторном введении вещества половозрелым мышам в диапазоне доз ~ 1/20—1/2 Limac.
Список литературы
1. Аксютик Т.В. Адаптационный ответ у самок дрозофилы по тесту доминантные летальные мутации // Электронные публикации. Секция «Генетика и генная инженерия» http://bio.psn.ru/conf/ kmu2001/gigi/akcutic.shtml.
2. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.М. и др. // В кн. Лабораторные животные для медико-биологических исследований. — М.: Наука, 1983. — С. 199.
3. Домшлак М.Г., Елаков А.Л., Осипов А.Н. Исследование адаптивного ответа при воздействии на десятидневных эмбрионов половозрелых мышей WR первого поколения // 6-ая Международная конференция «Экология человека и природа». Москва-Плес, 2004. — С. 198.
4. Домшлак М.Г., Елаков А.Л., Осипов А.Н. Генетические эффекты, индуцированные воздействием сульфата никеля, в половых и соматических клетках // Генетика, 2005. — Т. 41. — № 7. — С. 894-901.
5. Малашенко А.М., Суркова Н.И. Новая линия мышей WR — высокочувствительная к цитогене-тическому эффекту тио-ТЭФ//Цитология и генетика, 1979. — Т. 13. — C. 387-391.
6. Моссэ И.Б., Плотникова С.И., Кострова Л.Н. и др. Влияние меланина на мутагенное действие хронического облучения и адаптивный ответ //Hungarian J. Animal Production, 1999. — V. 48. — № 1. — P. 145-149.
7. Перминова Е.В., Синельщикова Т.А., Перми-нова И.Н. и др. Сравнение адаптивного ответа в клетках человека при воздействии у -радиации и сульфата никеля // Радиационная биология. Радиоэкология, 2000. — Т. 40. — С. 173-176.
8. Серебряный А.М., Зоз Н.Н. Радиационный ответ у пшеницы. Феменология и возможный механизм // Радиоэкология, 1994. — Т. 41. — № 5. — С. 589-598.
9. Серебряный А.М., Алещенко А.В., Готлиб В.Я. и др. Клеточный состав популяции лимфоцитов и радиационный адаптивный ответ // Цитология, 2003. — Т. 45. -№ 1. — С. 81-84.
10. Сивина Н.В., Даливеля О.В., Никитченко Н.Р. и др. Влияние малых доз на биологические эффекты алкилирующих агентов в исследованиях на дрозофиле//Цитология и генетика, 2003. — Т. 37. — № 1. — С. 48-55.
11. Спитковский Д.М., Кузьмина И.В., Карпухин А.В. Сверхмалые дозы ионизирующей радиации индуцируют в G0 — лимфоцитах человека смещение прицентромерных локусов интерфазных хромосом // Тез. конференции «Малые дозы ионизирующей радиации». — М., 2004. — С. 136.
12. Andersen O. Effects of coal combustion products and metal compounds on sister chromatid ehchange (SCE) in a macrofage cell line // Environ Health Per-spect., 1983. — V. 47. — P. 239-253.
13. Arrouijal F.Z., Marsin D, Hildebrand H.F. et al. Differences in genotoxic activity of a-Ni3S2 on human lymphocytes from nickel-hypersentized and nick-el-unsensitized donors // Mutagenesis, 1992. — V. 7 (3). — P. 183-187.
14. Denkhaus E., Salnikow K. Nickel essentiality, toxicity, and carcinogenicity // Critical Reviews in On-cology/Hematology, 2002. - V. 42. - P. 35-56.
15. Ehling. U.H., Machemer L., Buselmaier W. et al. Standard protocol for the dominant lethal test on male mice //Arch. Toxicol, 1978. - V. 39. - P. 173-185.
16. Fahrig R. A mammalian spot-test: induction at genetic alterations in pigment cells at mouse embryos with X-rays and chemical mutagens//Molec. and General Genetics, 1975. - V 138. - № 4. - Р. 309-314.
17. Saxholm H.J., Reith A., Brogger A. Oncogenic transformation and cell increased sister chromatid ehchange in human lymphcytes by nickel subsulfide // Cancer Res., 1981. - V. 41. - P. 4136-4139.
18. Shimizu T., Kato T., Tachibana A. et al. Coordinated regulation of radioadaptive response by protein kinase C andp38 mitogen-activatedprotein kinase // Exp. Cell. Res., 1999. - V. 251. - P. 424-432.
19. Stecca C, Gerber G.B. Adaptive response to DNA-damaging agents - a revier of potential mechanisms // Biochem. Pharmacol., 1988. - V. 55. - P. 681-695.
20. Upton A.C. Radiation hormesis: date and interpretation // Crit. Rev. Toxicol., 2002. - V. 31. - P. 681-695.
21. Wang G.J., Cai L. Induction of cell - proliferation hormesis and cell-survival adaptive response in mouse hematopoetic cells by whole-body low-dose radiation //Toxicol. Sci., 2000. - V. 53. - P. 369-376.
22. Wojcic A., Shadley J.D. The current status of the adaptive response to ionizing radiation in mammalian cells // Human and Ecological Risk Assessment, 2000. - № 6. - P. 281-300.
23. Wolf CR., Smith G., Broun K. et al. Adaptive responses to environmental chemicals. // Boiohim So. Symp., 1999. - V. 64. - P. 129-130.
24. Yang-Feng T.L., Ulrich A., Franke A. The oncogen c-kit (KIT) is located on man chromosome 4 and mouse chromosome 5// Cytogen. and Cell Genet., 1987. - V. 46. - Р. 723.
Материал поступил в редакцию 12.09.06.
M.G.Domshlak1, Ye.N.Makarova-Zemlyanskaya1, A.N.Osipov2, A.N.Yelakov2, N.Yu.Vorobyova2 ADAPTIVE RESPONSE OF THE ORGANISM TO THE EXPOSURE TO NICKEL SULFATE
institute of Occupational Health, Russian Academy of Medical Sciences 2United Ecological, Technological and Research Center for Neutralization of Radioactive Wastes and Protection of the
Environment «Radon», Moscow
A preliminary single intragastric administration of nickel sulphate in a no-effective dose of 0.5 mg/kg (~1/20 Limac) on the 10th day of the pregnancy and the consecutive administration of doses of 0.5, 1.0 and 5.0 mg/kg (~1/20 to 1/2 Limac) to the first generation of pubertal males and females of inbred WR mice induce an adaptive response which is a reduction of the rate of dominant lethal mutations in late spermatocides and stem spermatogonia of mice in the first generation and genic mutation wy in somatic cells of mice in the second generation.
