Информативность иммуноферментного анализа в диагностике ВГС-инфекции Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

УДК: 616.36-002.14-07

ИНФОРМАТИВНОСТЬ ИММУНОфЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ДИАГНОСТИКЕ

ВГС-ИНфЕКЦИИ

Матиевская Н. В.(пЫатаИ@та'11.ги)/ Пашковец А. В.(hannapashkavets@gmaiLcom)/ 2Стасюкевич А. К. (hanna_stasiukevich@list.ru), 3Малышко Н. Г. (natagrd@tut.by)

1УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь 2ГУ «Гродненский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья»,

Гродно, Беларусь

3УЗ «Гродненская областная инфекционная клиническая больница», Беларусь

Цель работы: оценить информативность иммуноферментного анализа в диагностике ВГС-инфекции. Изучены показатели оптической плотности (ОП) сывороток крови при определении анти-ВГС методом ИФА 250 пациентов, не получавших противовирусную терапию гепатита С. Всем пациентам было выполнено определение РНК ВГС методом ПЦР. Установлено, что при ОП, равной 2,6 и более, диагностируется репликативная стадия ВГС-инфекции (РНК ВГС+), в то время как при ОП, равной или менее 0,7, исключается наличие репликативной стадия ВГС-инфекции (РНК-). Выводы: показатель ОП суммарных антител к ВГС в сыворотке крови может быть использован как дополнительный критерий диагностики ВГС-инфекции в условиях ограниченных возможностей проведения ПЦР.

Ключевые слова: ВГС; ИФА; антитела к ВГС, диагностика

В настоящее время вирусный гепатит С (ВГС) является актуальной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с его широкой распространенностью среди трудоспособного населения. По мнению экспертов ВОЗ, ежегодно в мире инфицируются ВГС 3-4 млн человек. Общее количество хронически инфицированных ВГС составляет 130-170 млн человек. По прогнозной оценке экспертов CDC, в мире в последующие 5 лет ожидается увеличение количества инфицированных ВГС до 400-450 млн. Ежегодно от связанных с гепатитом С болезней печени умирает примерно 350 000 пациентов [4].

Официальный учет ВГС-инфекции в Республике Беларусь проводится по трем категориям: острый гепатит С (ГС), хронический ГС, «носи-тельство анти-ВГС». В группу острого и хронического ГС относят пациентов с репликативной стадией ВГС-инфекции (РНК ВГС+), в то время как в группу «носительство анти-ВГС» должны относиться пациенты с наличием антител при отсутствии репликативной стадии ГС, подтвержденной отрицательным результатом на РНК ВГС [1, 2].

Репликативная стадия ВГС-инфекции свидетельствует о наличии острой или хронической ВГС-ин-фекции и диагностируется при наличии у пациента положительного результата на РНК ВГС. В то время как отсутствие РНК ВГС у анти-ВГС позитивного пациента говорит либо о спонтанной ремиссии ВГС-инфекции, что встречается в 10-15% случаев при естественном течении заболевания, либо о ремиссии в ответ на противовирусную терапию [2, 4].

Определение анти-ВГС проводится при помощи широко распространенного твердофазного иммуноферментного анализа, результат которого представлен антителами общего класса - anti-HCV total, которые содержат иммуноглобулины М и G. Верификация положительного результата ИФА базируется на показателе оптической плотности (ОП) сыворотки крови. ОП отражает уровень концентрации суммарных антител в одной единице объема. Положительный результат на определение антител к ВГС может свидетельствовать о наличии у пациента как репликативной стадии ВГС, так и пер-систировании антител после перенесенной острой или хронической ВГС-инфекции (ремиссия) [2].

Диагностика методом ПЦР у анти-ВГС позитивных лиц не всегда осуществима в связи с отсутствием возможности выполнения ПЦР на уровне многих районных центров, отказом части пациентом от данного исследования. В связи с этим, а также с учетом длительного часто пожизненного отсутствия клинико-биохимической активности ВГС-инфекции в группу «носителей» могут необоснованно попадать пациенты с репликативной стадией ВГС-инфекции. Подтверждением данного факта являются значимые различия в распределении пациентов с ВГС-инфекцией по категориям учета в РБ и регионах, в частности, в Гродненской области.

Материалы и методы

Изучены показатели оптической плотности (ОП) сывороток крови при определении суммарных ан-ти-ВГС методом ИФА у пациентов, не получавших противовирусную терапию ВГС-инфекции. Среди них было 113 (45,2%) мужчин и 137 (54,8%) женщин, средний возраст мужчин 42,01±14,3 лет, средний возраст женщин - 41,26±16,6. Антитела к ВГС определялись методом твердофазного иммуноферментного анализа (тест-системы «Амплисенс», Вектор-Бест и другими зарегистрированными на территории Республики Беларусь). Выявление РНК ВГС проводилось качественным методом ПЦР («Амплисенс» и другими зарегистрированными на территории Республики Беларусь). Результаты представлены как среднее ± SD. Статистический анализ проводился с использованием пакета «Статистика» 6,0. Для получения диагностически значимых показателей количественных признаков использован метод построения ROC-кривых с расчетом площади под кривой (АиС), чувствительности и специфичности полученных моделей. Представлены данные официального статистического учета ГС в РБ и областях за 2014 - 2015 гг.

Результаты и обсуждение

Заболеваемость ГС в по регионам РБ за 2014 и 2015 гг. представлена на рисунке 1.

Как видно из рисунка 1, в 2015 г. распространенность впервые выявленного хронического ГС (ХГС) в РБ составила 31,5 на 100 тыс. населения, распространенность «носительства анти-ВГС» -15,3, в то время как по регионам РБ распростра-

ненность данной патологии была неравномерной. В Гродненской области распространенность впервые выявленного ХГС составила 16,1 на 100 тыс. населения, «носительства анти-ВГС» - 34,5. Наиболее высокие показатели заболеваемости ХГС имеют место в г. Минске, Витебской и Минской областях, соответственно, в этих регионах наиболее низкие показатели «носительства анти-ВГС».

Таблица 1 - Распределение образцов сывороток в зависимости от уровня оптической плотности и результатов ПЦР

Рисунок 1. - Распространённость впервые установленного хронического ГС и «носительства

анти-ВГС.» на 100 тыс. населения в Республике Беларусь и по регионам (2014-2015 гг.)

В то же время количество «носителей анти-ВГС» в Гродненском регионе как в 2014, так и в 2015 гг. более чем в 2 раза превысило количество пациентов с ХГС. Очевидно, что в группе носителей находятся пациенты с хроническим ГС. Такое положение дел приводит к несвоевременной диагностике и лечению ГС, прогрессированию заболевания, формированию неблагоприятных исходов (цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома) у данных пациентов.

Для оценки информативности ИФА в диагностике репликативной стадии ВГС-инфекции был выполнен сравнительный анализ показателей ОП сыворотки крови при положительных результатах ИФА в зависимости от результата качественной ПЦР на РНК ВГС. По результатам ПЦР РНК ВГС не выявлялась в 75 (30%) образцах плазмы крови. РНК ВГС была выявлена у 175 (70%). Уровень ОП у ВГС РНК-негативных был значительно ниже, чем у ВГС РНК-позитивных пациентов: 0,67±0,54(0,007-2,579) и 2,7±0,65 (0,986 - 3,896), соответственно (p<0,001). Установлена высоко достоверная прямая коррелятивная связь (корреляция Пирсона) между наличием РНК ВГС и уровнем показателя ОП - 0,834 p<0,01.

Для установления точек разделения ОП (сШ-off point) для диагностики и исключения репликативной стадии ВГС-инфекции был проведен ROC-анализ. Установлена точка разделения ОП для исключения репликативной стадии ВГС-инфекции, равная 0,7 (с чувствительностью 97,7% и специфичностью - 92%), площадь поля под кривой ROC-анализа составила 0,981. Наилучшая точка разделения для подтверждения репликативной стадии ВГС-инфекции составила - 2,6 (с чувствительностью 98,3% и специфичностью -93,3%), площадь поля под кривой ROC-анализа -0,987.

Распределение пациентов с учетом полученных показателей ОП представлено в таблице 1.

Показатель ОП РНК-ВГС+ n=175 РНК-ВГС-n=75 р*

Меньше или равно 0,7 0 49 (65,3%) <0,001

Больше 0,7 но меньше 2,6 71 (40,6%) 26 (33,7%) >0,3

2,6 и более 104 (59,4%) 0 <0,001

* - тест

Как видно из представленной таблицы 1, среди РНК-ВГС+ пациентов в 59,4% случаев имела место высокая ОП (>2,6). У пациентов с таким уровнем ОП отсутствовали негативные результаты определения РНК. В то время как среди пациентов с негативными результатами на выявление РНК методом ПЦР в 65,3% случаев ОП была менее 0,7. Среди пациентов с РНК-ВГС+ уровень ОП менее 0,7 не был выявлен ни в одном случае, что подтверждает результаты ROC-анализа.

Группа пациентов с ОП более 0,7, но менее 2,6 была неоднородна по своему составу, так как в ней присутствовали пациенты как с наличием репликативной стадии ВГС (РНК-ВГС+) - 71 (40,6%), так и пациенты с отсутствием репликативной стадии ВГС (РНК-ВГС-) - 26 (33,75%). Представленные данные указывают на низкую информативность показателя ОП в пределах более 0,7, но менее 2,6 для диагностики или исключения репликативной стадии ВГС-инфекции.

Приводим клинические примеры, подтверждающие информативность представленных данных. Пациент Б., 43 г., диагноз: Хронический вирусный гепатит С, умеренной степени активности. Показатель ОП при определении анти-ВГС методом ИФА: 4,859 от 03.11.15. РНК-ВГС выделена от 12.11.2015. Таким образом, у данного пациента была диагностирована репликативная стадия ВГС-инфекции как по показателю ОП (уровень ОП >2,6), так и по результатам ПЦР-диагностики. Пациенту назначена противовирусная терапия ВГС-инфекции.

Пациент В., 38 л. Хронический гепатит С, ремиссия. Показатель ОП при определении анти-ВГС методом ИФА: от 07.12.15 составил 0,271. РНК-ВГС не выделена. У данного пациента была исключена репликативная стадия ВГС-инфекции как по показателю ОП (уровень ОП <0,7), так и по результатам ПЦР-диагностики. Находится под наблюдением.

Пациент Б., 35 л., диагноз: Хронический вирусный гепатит С, минимальной степени активности. Показатель ОП при определении анти-ВГС методом ИФА: 2,201 от 03.09.15 (уровень ОП больше 0,7, но меньше 2,6), что не позволило исключить или диагностировать репликативную стадию ВГС-инфекции методом ИФА. РНК-ВГС выделена от 10.09.2015, выставлен диагноз ХГС. Проведено обследование с целью установления стадии активности и хронизации ВГС-инфекции. Назначена противовирусная терапия ХГС.

Выводы

1. В настоящее время существуют значительные различия в регионах РБ по заболеваемости ХГС и распространённости «носительства ан-ти-ВГС», что указывает на недостаточную диагностику ХГС у лиц с впервые выявленными антите-

80

Journal of the Grodno State Medical University № 3, 2016

лами к ВГС, отнесенных в группу «носительства антител к ВГС» в том числе в Гродненской области.

2. Показатель оптической плотности суммарных антител к ВГС в сыворотке крови информативен как дополнительный критерий верификации и исключения репликативной стадии ВГС-инфекции в условиях ограниченных возможностей проведения ПЦР, что позволит повысить точность диагностики и статистического учета форм ВГС-инфекции.

3. Показатель ОП, равный 2,6 и больше, при определении анти-ВГС методом ИФА позволяет диагностировать репликативную стадию ВГС-инфек-ции (с чувствительностью 98,3% и специфичностью - 93,3%), независимо от наличия или отсутствия у пациента клинико-биохимических признаков гепатита, отнести пациента в группу хронической ВГС-ин-фекции, рекомендовать дальнейшее дообследование с целью установления периода заболевания, стадии

Литература

1. Матиевская, Н.В. Ко-инфекция ВИЧ/ВГС: этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение : монография / Н.В. Матиевская //Гродно : ГрГМУ, 2013.-350c.

2. Егоров, А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров [и др.] // - M.: Издательство высшая школа, 1991. С. 3-4.

3. Houghton, M. The long and winding road leading to the identification of the hepatitis C virus. (англ.) // Journal of hepatology. - 2009. - Vol. 51, no. 5. - P. 939-948.

4. Recommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-related chronic disease. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 1998 Oct 16; 47(RR-19):1-39.

активности и хронизации ВГС-инфекции, решения вопроса о необходимости противовирусной терапии ВГС.

4. Показатель ОП, равный 0,7 и меньше, при определении анти-ВГС методом ИФА позволяет исключить репликативную стадию ВГС-инфекции (с чувствительностью 97,7% и специфичностью - 92%), при отсутствии возможности определения РНК ВГС методом ПЦР, а также при отсутствии соответствующей клинической картины гепатита и отклонений в результатах стандартных биохимических исследований.

5. Показатель ОП в интервале от 0,7 до 2,6 при определении анти-ВГС методом ИФА не позволяет достоверно исключить или подтвердить репликатив-ную стадию ВГС-инфекции, что требует обязательного проведения ПЦР-диагностики, учета клинико-ла-бораторных и инструментальных данных пациентов.

Literatura

1. Matievskaja N.V. Ko-infekcija VICH/VGS: yetiologija, yepidemiologija, patogenez, klinika, diagnostika, lechenie : monografija / N.V. Matievskaja //Grodno : GrGMU, 2013.-350c.

2. Egorov, A.M. Teorija i praktika immunofermentnogo analiza / A.M. Egorov [i dr.] // - M.: Izdatel'stvo vysshaja shkola, 1991. S. 3-4.

3. Houghton M. The long and winding road leading to the identification of the hepatitis C virus. (angl.) // Journal of hepatology. -2009. - Vol. 51, no. 5. - P. 939-948.

4. Recommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-related chronic disease. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep. 1998 Oct 16; 47(RR-19):1-39.

DESCRIPTIVENESS OF ENZYME-LINKED IMMUNOADSORBENT ASSAY IN DIAGNOSIS OF

HCV-INFECTION

Matsiyeuskaya N. K, Pashkovets A. K, 2 Stasyukevich A. K, 3Malyishko N. G.

1Grodno State Medical University, Belarus, Grodno 2Grodno Regional Centre of Hygiene, Epidemiology and Public Health, Grodno, Belarus 3Grodno Regional Clinical Hospital of Infectious Diseases, Grodno, Belarus

Aim of study: to estimate descriptiveness of enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA) in diagnosis of HCV-infection.

Methods. The optical density (OD) of total antibodies to HCV in the blood serum of250 blood serum samples of anti-HCV-positive patients who did not receive antiviral therapy against HCV. All patients were tested on RNA HCV by PCR. Results are presented as mean ± SD.Results. The OD 2,6 and more are associated with replicative stage of HCV-infection (RNA+), OD 0,7 and less is parameter for exclusion of replicative stage of HCV-infection (RNA-).

Conclusions. Parameter of serum OD may be used like additional criteria for diagnosis of HCV-infection especially in setting with limited recourses for PCR

Keywords: HCV; ELISA: Anti-HCV, diagnoses

Поступила: 02.09.2016 Отрецензирована: 06.09.2016