CC BY
17Вестник защиты растений, 3, 2011
57
УДК 632.51(616-022.1)
ИНФИЦИРОВАНИЕ БОДЯКА ПОЛЕВОГО КОНИДИЯМИ И МИЦЕЛИЕМ ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА STAGONOSPORA CIRSII
С.В. Сокорнова, А.В. Хютти, А.О. Берестецкий
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Процесс инфицирования бодяка полевого грибом Stagonospora cirsii изучен с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии. Выявлены различия в динамике роста инфекционных гиф в зависимости от типа инокулюма (конидий или мицелиальных фрагментов). Показано, что проникновение гиф гриба в ткани листьев бодяка происходит только на стыке эпидермальных клеток. Обосновано предположение, что мицелий гриба и его фрагменты могут быть рассмотрены как инфекционный материал для создания микогерби-цида.
Ключевые слова: биогербицид, Stagonospora cirsii, бодяк полевой Cirsium arvense, инфекционный процесс, световая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия.
Возбудитель пятнистости листьев бодяка полевого - гриб Stagonospora cirsii JJ.Davis имеет определенный потенциал для биологической борьбы с этим вредоносным многолетним сорняком из семейства Asteraceae (Берестецкий, 2005). Серьезной проблемой при получении препарата на его основе может стать то обстоятельство, что гриб формирует спо-роношение только на твердых субстратах при облучении культур в диапазоне ближнего ультрафиолета (Berestetskiy et al., 2005). Такая особенность физиологии многих мицелиальных грибов (Беккер, 1988) нередко снижает их привлекательность как продуцентов биопестицидов, поскольку конидии считаются оптималь-
Методика
В работе использован штамм Ытзп С-163 из рабочей коллекции лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР. Гриб хранили при 5°С в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре (КГА). Для получения посевного материала гриб культивировали 2 недели на КГА при 25°С в темноте. Пикнидиальное спороношение гриба получали в 250-мл колбах Эр-ленмейера на стерилизованной перловой крупе (20 г крупы и 12.5 мл воды) при освещении (12 ч в день) двумя лампами ЛЭ-30 и температуре 25°С в течение 10 суток с периодическим встряхиванием.
Мицелий гриба получали двумя способами: при помощи твердофазной и жидкофазной ферментации. Для приготовления твердого субстрата использовали 20 г пшена и 10 мл воды в 250-мл колбах, гриб культивировали 10 суток, как описано выше. После окончания ферментации колонизированный мицелием гриба субстрат высушивали током воздуха 2 суток при комнатной температуре и измельчали в лабораторной мельнице. Жидкая питательная среда (50 мл в 250-мл колбах) состояла из
ным типом инокулюма. Мицелий грибов и его видоизменения (бластоспоры, хла-мидоспоры, микросклероции и другие) также могут быть активным началом биопрепаратов, однако их способность заражать растения и устойчивость к стрессорным факторам требуют экспериментального подтверждения (Берестецкий, Сокорнова, 2009). Целью серии наших исследований являлось определение возможности применения мицелия 5. сШ для разработки микогербицида. В данной работе приведены результаты сравнительного изучения процесса заражения листьев бодяка полевого конидиями и мицелием гриба 5. сШ при помощи световой и электронной сканирующей микроскопии.
исследований
15 г соевой муки, 60 г сахарозы, 1 г дрожжевого автолизата, 1 г KH2PO4, и 0.5 г MgSO4 на 1 л воды. Гриб культивировали в течение 3-х суток на орбитальной качалке (180 об/мин), отделяли от культу-ральной жидкости и измельчали в блендере. Средняя длина конидий составляла около 8 мкм; длина фрагментов мицелия, полученного на пшене, была около 90 мкм; длина фрагментов мицелия, выращенного на сахарозно-соевой среде, составляла около 140 мкм.
Бодяк полевой выращивали из семян до фазы розетки в сосудах с торфом и песком (3:1) при температуре 25°С и искусственном освещении 16 ч в день. Высечки из листьев бодяка полевого диаметром 0.8 см, разложенные на влажной фильтровальной бумаге, опрыскивали водной суспензией, содержащей конидии (5х106 конидий/мл) или фрагменты мицелия 5. Ытзи (50 мг/мл). Обработанные высечки инкубировали в прозрачных пластиковых контейнерах при 24°С. Через 4, 8, 12, 16, 20, 24 и 36 часов инкубации диски анализировали при помощи
электронной сканирующей микроскопии (микроскоп Evo E40, Carl Zeiss, Германия) без предварительной подготовки при 400-1000-кратном увеличении. Для световой микроскопии листовые диски фиксировали в жидкости Карнуа и окрашивали 1% раствором анилинового синего. Полупостоянные препараты в
Результаты
Через 4 ч после инокуляции листовых дисков различными типами инокулюма S. cirsii наблюдалось набухание конидий и незначительное утолщение гиф мицелия. Через 8 часов конидии прорастали преимущественно одной ростковой трубкой (рис. 1), реже двумя; фрагменты мицелия возобновляли свой рост. В дальнейшем наблюдалось продолжение роста и начало ветвления гиф. Через 12 ч после инокуляции выявлялось единично проникновение гиф мицелия, полученного в жидкой среде, в ткани листа. Позднее начиналось проникновение в листья бодяка гиф мицелия, выращенного на пшене (через 16 ч), и гиф, образованных в результате удлинения и ветвления ростковых трубок конидий (через 24 ч). В последующие четыре часа происходило сильное ветвление мицелия и встречаемость гиф, внедряющихся в листовые ткани, значительно увеличивалась (рис. 2). Это совпадало со временем проявления первых симптомов заболевания -многочисленных точечных некротических пятен на листовых высечках.
Динамику роста гиф на поверхности листьев бодяка у различных типов ино-кулюма S. cirsii учитывали в период их активного роста - с 4 до 16 часов после инокуляции. В этот период наблюдали линейную зависимость изменения средней длины гиф от времени инфекционного процесса (рис. 3). Выявлено, что скорость роста гиф из проросших конидий и мицелия, полученного на пшене, была примерно одинакова - около 7 мкм/час (рис. 3) несмотря на значительные различия в исходных размерах пропагул. Скорость роста гиф мицелия, полученного на сахарозно-соевой среде, была примерно в 3 раза выше (21 мкм/час).
Внедрение инфекционных гиф S. cirsii в листовые ткани бодяка проходило на стыке эпидермальных клеток независимо
Вестник защиты растений, 3, 2011 лактофеноле изучали при 400-1000-кратном увеличении на световом микроскопе (MTB 2004, Carl Zeiss, Германия), длину инфекционных гиф измеряли с помощью программы Axio Vision 4.6 (Carl Zeiss, Германия). Динамику роста гиф описывали с помощью регрессионного анализа данных.
исследований
от типа инокулюма и способа его получения. Через устьица или через поверхность кутикулы листа проникновения инфекционных гиф выявлено не было. Специализированных инфекционных структур - аппрессориев на поверхности листьев растения-хозяина не было обнаружено. В то же время вокруг места внедрения патогена иногда наблюдали зоны разрушения клеточной стенки (рис. 3).
Известно, что внедрение фитопато-генных грибов в растительные ткани может проходить через поранения, устьица, кутикулу, а также на стыке эпи-дермальных клеток (Дьяков и др., 2001). Инфицировать растения могут как прорастающие споры, так и мицелий, либо его видоизменения, прорастающие мицелием. Так, мицелий аскомицета Sclerotinia sclerotiorum проникает в листья и стебель рапса через кутикулу с образованием аппрессориев за счет действия липолитических ферментов и механического воздействия (Huang et al., 2008).
Изучение инфекционного процесса при заражении растений мицелием пикниди-альных грибов не проводилось, поскольку он не является обычным типом инокулюма для этой группы фитопатогенных грибов. При заражении листьев бодяка конидиями S. cirsii отмечался длительный (24-36 ч) эпифитный рост инфекционных гиф. Их внедрение в лист наблюдалось на стыке эпидермальных клеток, иногда с одновременным разрушением окружающей кутикулы (рис. 3), что является индикатором использования грибом ли-тических ферментов (Lucas, 1998). На стыках эпидермальных клеток листьев нута проходило внедрение ростковых трубок, образованных прорастающими конидиями Ascochyta rabiei (Hohl et al., 1990). Такой же способ инфицирования листьев пшеницы характерен для Mycosphaerella graminicola. При этом ви-
Вестник защиты растений, 3, 2011 доизменений кутикулы вокруг мест проникновения гиф не отмечалось (Duncan, Howard, 2000). Таким образом, способ внедрения инфекционных гиф S.cirsi в
ткани растения-хозяина характерен и для ряда других фитопатогенных пикни-диальных целомицетов, вызывающих пятнистости различных видов растений.
Рис. 1
Рис. 2
Рис. 3
Рис. 1. Образование ростовых трубок конидиями S.cirsii через 8 часов после инокуляции листьеРЯщЯЯМа Рис. 2. Массовые проникновения инфекционных гиф через 16 часов после инокуляции мицелием, полученным на сахарозно-соевой среде Рис. 3. Зона лизиса на поверхности эпидермальной клетки бодяка полевого в месте внедрения гифы S. cirsii
Более патогенным, чем конидии, оказался мицелий S. Ытви: инфекционные гифы росли быстрее (рис. 4), и первые симптомы поражения проявлялись на 4-8 ч раньше, чем при инокуляции листовых высечек конидиями.
J k 1
у = 21,075x + 35,5 ^^^ R2 = 0,9345^^"'^ A
^---у = 7,4575x + 49 | ^^^^ R* = 0.901 .______ _______g-----
------- у = 6,775x-28,5 ___J R* = n ----- ______— • ►
о ¥ -1-1-
4 8 часы 12 16
• Спор ы ■ Мицелий ТФ А Мицелий ЖФ
Рис. 4. Динамика роста гиф при инокуляции листовой поверхности бодяка полевого пропагулами S. Ы^и
Литература
Беккер З.И. Физиология и биохимия грибов. МГУ, М., 1988, 227 с.
Берестецкий А.О. Эффективность штаммов различных видов грибов и методов инокуляции для биологической борьбы с бодяком полевым // Материалы II Всероссийского съезда по защите растений. Фитосанитарное оздоравле-ние фитосистем. СПб, 2005, с. 136-138.
Берестецкий А.О., Сокорнова С.В. Получение и хранение биопестицидов на основе микромицетов // Миколо-
Быстрое развитие симптомов после проникновения гриба в ткани растения-хозяина предполагает отсутствие био-трофной фазы и активное вовлечение токсинов в их колонизацию. Образование грибом токсинов было показано нами ранее (Yuzikhin et al., 2007; Evidente et al., 2008).
Возможность использования мицелия как основы микогербицидов уже была показана для таких патогенов, как Pho-ma macrostoma (Bailey, 2009), Sclerotinia sclerotiorum (Bourdot et al., 2006), Spha-celoma poinsettiae (De Lima Nechet et al., 2004), Alternaria cassia (Hintz, 2003). Таким образом, измельченный мицелий S. cirsii может быть рассмотрен как инфекционный материал для создания мико-гербицида в биологической борьбе с бодяком полевым.
гия и фитопатология, 2009, 43, 6, с. 473-489.
Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Ба-гирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. Учебное пособие. М. Общество фитопатологов, 2001, 301 с.
Bailey K.L., Derby J.A. Fungal isolates and biological control compositions for control of weeds US2006/0084574 A1.
Berestetskiy A.O., Kungurtseva O.V., Sokornova S.V. Can mycelial inoculum be an alternative to conidia in the case of Stagonospora cirsii J.J. Davis, a potential biocontrol agent
60
Вестник защиты растений, 3, 2011
of Cirsium arvense? // 13-th EWRS Symposium, Bary, Italy, 2005, p. 225.
Bourdot G., Hurrel G., Saville D., Leathwick D. Impacts of applied Sclerotinia sclerotiorum on the dynamics of a Cirsium arvense population // Weed research, 2006, 46, p. 61-72.
De Lima Nechet K., Barreto R.W., Mizubuti E.S.G. Spha-celoma poinsettiae as a potential biological control agent for wild poinsettia (Euphorbia heterophylla) // Biological Control, 2004, 30, 3, p. 556-565.
Duncan K.E., Howard R.J. Cytological analysis of wheat infection by the leaf blotch pathogen Mycosphaerella graminicola // Mycological research, 2000, 104, 9, p. 1074-1082.
Evidente A., Cimmino A., Berestetskiy A., Andolfi A., Motta A. Stagonolides G-I and Modiolide A, Nonenolides produced by Stagonospora cirsii, a potential mycoherbicide for Cirsium arvense // J. Nat. Prod., 2008, 71, p. 1897-1901.
Hintz W. Sprayable formulation of mycelim-based biological control agent produced by solid fermentation. US2003/0103944 A1.
Hohl B., Pfautsch M., Barz W. Histology of disease development in resistant and susceptible cultivars of chickpea (Cicer arietinum L.) inoculated with spores of Ascochyta ra-biei // J. Phytopath, 1990, 129, p. 31-45.
Huang L., Buchenauer H., Han Q., Zhang X., Kang Z. Ultrastructural and cytochemical studies on the infection process of Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape // Journal of Plant Diseases and Protection, 2008, 115 (1), p. 9-16.
Lucas J.A. Plant pathology and plant pathogens. /Blackwell Publishing. 1998, 274 p.
TeBeest D.O. Biological control of weeds with plant pathogens and microbial pesticides // Advances in Agronomy (Ed. D.L.Sparks). Academic Press, Toronto, 1996, 56, p. 115-137.
Yuzikhin O., Mitina G., Berestetskiy A. Herbicidal potential of stagonolide, a new phytotoxic nonenolide from Stagonospora cirsii // J. Agric. Food Chem., 2007, 55, 19, p. 77077711.
Работа выполнялась по проекту Правительства Санкт-Петербурга №377/09.
INOCULATION OF CANADA THISTLE BY STAGONOSPORA CIRSII S.V.Sokornova, A.V.Khyutti, A.O.Berestetskiy Inoculation of Canada thistle by its pathogen, Stagonospora cirsii was studied with light and scanning electron microscopy. The fungal hyphae produced by conidia or mycelium fragments penetrated leaves at the boundaries of epidermal cells. It was found that the differences in the dynamics of the hyphal growth depend on the inoculum type. The mycelium of the fungus was proved to be the possible infection material for the mycoherbicide development.
Keywords: Bioherbicide, Stagonospora cirsii, Canada thistle, Cirsium arvense, inoculation, leaf penetration, microscopy.
C.B.CoKopHOBa, k.5.h., mymryk@gmail.com A.B.XroTTH, K.5.H., A.O.BepecTeqKHH, K.5.H., aberestetski@yahoo.com
