CC BY
79
позволяет разделять штаммы по подвидам, так как в один и тот же кластер попадают штаммы из разных географических зон [1].
Проведенный нами анализ выявил 51 генотип среди 68 исследованных штаммов F. tularensis и показал наличие в коллекции «ГКПМ-Оболенск» штаммов, идентичных по 25 локусам. Определены локусы, варьирование числа повторов в которых позволяет различать штаммы по небольшим вариациям внутри подвида holarctica.
Таким образом, генотипирование штаммов F. tularensis, изолированных в основном на территории бывшего Советского Союза, методом MLVA по 25 локусам, позволяет: 1) проводить подвидовую идентификацию штаммов; 2) определять внутри подвида особенности штаммов, связанные с их географическим происхождением; 3) выявлять тонкие генетические различия штаммов внутри кластера.
Авторы выражают благодарность М.Е. Платонову за оказанную помощь в компьютерной обработке данных.
Работа выполнена по государственному контракту № 37-Д от 30.05.2012 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 гг.)».
Сведения об авторах:
Мокриевич Александр Николаевич - зав. отделом осо-бо опасных инфекций ФБУН ГНЦПМБ Роспотребнад-зора; 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, Оболенск, e-mail: mokrievich@obolensk.org.
ЛИТЕРАТУРА
1. Водопьянов А.С., Мишанькин Б.Н., Павлович Н.В., Пичурина
Н.Л. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.
2007; 2: 33-40.
2. Павлович Н.В., Мишанькин Б.И. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1992; 11-12: 5-7.
3. BrennerD.J., KreigN.R., Staley J.T., Garrity G.M. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. 2-ed. 2005; 2, B: 199-210.
4. de Carvalho I.L., Escudero R., Garcia-Amil C. et al. Emerg. Infect. Dis. 2007; 13(4): 666-7.
5. Ellis J., Oyston P.S.F., Green M., Titball R.W. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(4): 631-6.
6. GurycovaD. Eur. J. Epidemiol. 1998; 4: 797-802.
7. HuberB., Escudero R., BusseH.J. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010; 60: 1887-96.
8. Johansson A., Farlow J., Larsson P. et al. J. Bacteriol. 2004; 186: 5808-18.
9. Mikalsen J., ColquhounD. J. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009.
10. Sneath P.H.A., Sokal R.R. In.: Numerical taxonomy. San Francisco CA, Freeman; 1973: 53-60.
11. SotoE, Hawke J., FernandezD, Morales J.D. J. Fish Dis. 2009; 32: 713-22.
12. Tarnvik A., Priebe H-S., Grunow R. Scand. J. Infect. Dis. 2004; 36: 350-5.
13. WhippM.J., Davis G.M., Lum G. et al. Microbiol. 2003; 52: 839-42.
Поступила 01.04.13
FRANCISELLA TULARENSIS STRAINS MOLECULAR TYPING USING THE MULTIPLE-LOCUS VARIABLE-NUMBER TANDEM REPEAT ANALYSIS
V. S. Timofeev, T. Y. Kudryavtseva, A. N. Mokrievich, V. M. Pavlov, and I. A. Dyatlov
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russia
Variable-number tandem repeat analysis (VNTR) of 25 loci was used for molecular typing of the Francisella tularensis strains isolated from different regions of Russia and the former Soviet Union. This approach allowed us to subdivide F. tularensis subspecies and determine genotype diversity with regard to the geographical prevalence. All 25 loci were examined for their ability to discriminate subspecies and local geographical group. 42 genotypes among the 58 investigated F. tularensis subsp. holarctica isolates were found using cluster VNTR analysis. Key words: tularemia, Francisella tularensis, genotyping, VNTR, MLVA
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.843.1.083.1:577.21.08
А.В. Лахин, В.З. Тарантул, Л.В. Генинг ИНДУЦИРОВАННЫЙ МАРГАНЦЕМ НЕКОРРЕКТНЫЙ СИНТЕз ДНК КАК
возможная причина манганизма
ФГБУ науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва
Изучено влияние 8 наиболее биологически значимых двухвалентных катионов металлов: Mg2+, Mn2+, Co2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+ и Cu2+ на функционирование всего комплекса ДНК-полимераз в экстрактах клеток мозга мышей. В присутствии некоторых катионов металлов отмечено снижение точности синтеза ДНК и среди них наиболее значимое снижение вызывали ионы Mn2+. Показано также, что этот эффект главным образом обусловлен функционированием ДНК-полимеразы йота (Pol i). Известно, что избыточное поступление марганца в организм из окружающий среды может привести к развитию некоторых нейродегене-ративных заболеваний, таких как манганизм. Молекулярные механизмы, лежащие в основе данных патологий, до сих пор остаются неизвестными. На основании полученных в работе данных выдвинуто предположение, что нейротоксический эффект марганца может быть связан с локальной активацией высокоошибочной Pol i, вызывающей усиление некорректного синтеза ДНК при повышенных концентрациях ионов этого металла. Ключевые слова: некорректный синтез ДНК; марганец; ДНК-полимераза йота
Вследствие загрязнения почвы и воздуха отходами химической, горнодобывающей и металлургической промышленности в продуктах растениеводства и животноводства наблюдается накопление больших количеств металлов, в норме встречающихся редко. Потребление таких продуктов может вызывать накопление в организме человека опасных для здоровья концентраций этих металлов. В большом числе исследований показано, что многие металлы, в норме являющиеся необходимыми микроэлементами, в повышенных концентрациях могут быть токсичными для клеток эукариот.
Одним из важнейших микроэлементов, необходимым в качестве кофактора для нормального функционирования целого ряда ферментов, является марганец [13, 15, 16]. Интоксикация марганцем у человека ассо-
циирована с длительным воздействием повышенных доз самого этого металла или его соединений, присутствующих в атмосфере, воде или пище и проявляется в виде синдрома, известного как манганизм [2, 17]. Главной повреждаемой областью при интоксикации марганцем является центральная нервная система (ЦНС). В зависимости от стадии интоксикация может проявляться различно: от незначительных неврологических изменений, таких как раздражительность, дефицит внимания и резкие изменения в настроении, до симптомов, напоминающих болезнь Паркинсона [22, 25]. Данные эффекты в основном вызваны накоплением марганца в областях мозга globus pallidus и substantia nigra, с последующим повреждением и значительным уменьшением числа нейронов в этих областях [5, 26, 33].
Токсическое действие марганца на организм и в первую очередь на нервные клетки изучено в ряде работ [4], но молекулярные механизмы этого процесса пока не известны. Существует предположение, что ионы Mn могут нарушать нормальное протекание процессов репликации и репарации ДНК [6, 9]. Показано, что многие гомогенные препараты ДНК-полимераз в реакции синтеза ДНК in vitro могут в качестве кофакторов использовать не только Mg2+, но и ряд других двухвалентных катионов [20, 28]. Например, Mn2+, Co2+, Zn2+ и некоторые другие могут выступать в роли кофакторов синтеза ДНК, но при этом происходит снижение точности и процессивности [21, 32]. В данном аспекте изучение влияния различных двухвалентных катионов металлов, и в первую очередь Mn2+, на синтез ДНК в экстрактах клеток вызывает особый интерес. Изучение синтеза ДНК в экстрактах клеток позволяет оценить работу всего сложного комплекса ДНК-синтезирующих ферментов (у человека обнаружено около 20 различных ДНК-полимераз) при сохраняющемся воздействии разнообразных регуля-торных факторов. В связи с тем, что при манганизме происходит нарушение работы ЦНС, для изучения влияния Mn2+ и других двухвалентных катионов металлов на синтез ДНК в качестве модельного объекта были использованы экстракты клеток головного мозга мышей.
Материалы и методы
Приготовление экстрактов клеток. Для получения экстрактов клеток мозга мышей брали образцы исследуемых тканей и измельчали их на льду тефлоновым гомогенизатором в присутствии стеклянной крошки в экстрагирующем буфере следующего состава: 10% глицерина, 1% DMSO, 0,5% Tween 20, 2,5 мМ DTT, 1 мМ PMSF в 1-кратно PBS (pH 7,4). Объем буфера брали исходя из расчета 2 мкл буфера на 1 мг гомогенизируемой ткани. Полученный гомогенат центрифугировали при 4 °C в течение 10 мин при 14 000 g и супернатант использовали в качестве ферментного препарата. Концентрацию белка измеряли с помощью реагента Protein Assay («Bio-Rad» США) и доводили до 5 мг белка/мл. Обращение с животными и экспериментальные процедуры с ними были выполнены в соответствии с директивами Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Получение субстрата для проведения ДНК-полимеразной реакции. В качестве субстрата для определения активности ДНК-полимераз использовали два комплементарных дезоксирибоолигонуклеотида: 17-членный праймер 5'-GGAAGAAGAAGTATGTT-3' и 30-членную матрицу 5'-CCTTCGTCATTCTAACATACTTCTTCTTCC-3', которые при гибридизации образуют дуплекс с выступающим 5'-концом. Мечение праймера с 5'-конца проводили с помощью полину-
клеотидкиназы фага Т4 (10 ед.) и 2 МБк [у-32Р], ATP в 70 мМ Tris-HCl-буфере (рН 7,6), содержавшем 10 мМ MgCl2 и 5 мМ DTT при 37°C в течение 30 мин. После этого проводили инактивацию фермента при 70°C в течение 10 мин. Субстрат для ферментативной реакции получали после отжига в 200 мкл 10 пмоль меченого праймера с 15 пмоль матрицы в буфере для ПНК с добавлением NaCl до 100 мМ при 73°C в течение 3 мин и с последующим охлаждением до комнатной температуры.
Реакция элонгации радиоактивно меченного праймера. Реакцию синтеза ДНК проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 нМ субстрата с меченым праймером, 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,5 мМ каждого dNTP и 3 мкл экстракта. Концентрация изучаемых двухвалентных катионов металлов в реакционной смеси варьировала от 0,05 до 5 мМ. Время инкубации реакционной смеси при 37°C составляло 20 мин. Реакцию останавливали, осуществляли электрофоретическое разделение продуктов реакции и получали радиоавтограф, как описано нами ранее [1, 19]. Данные анализировали с помощью программы Image Quant. Во всех случаях количественные параметры определяли по результатам 3-5 независимых экспериментов.
Результаты и обсуждение
Экспериментальная модель, использованная для изучения влияния двухвалентных катионов металлов на ДНК-полимеразную активность.
С целью изучения влияния двухвалентных катионов металлов на синтез ДНК были проведены реакции элонгации радиоактивно меченного праймера c экстрактами клеток мозга мышей линии C57B1 при различных концентрациях изучаемого металла. Все металлы, добавляемые в качестве кофакторов синтеза ДНК, представляли собой соли хлора (MCl2). Образовавшиеся в результате синтеза ДНК продукты элонгации радиоактивно меченного праймера разделяли с помощью электрофореза в денатурирующем ПААГ. Чтобы оценить не только активирующее, но и инги-бирующее воздействие металлов, все реакции синтеза ДНК проводили в присутствии 250 мкМ Mg2+, что приблизительно соответствует физиологической концентрации ионов этого металла в клетке [11, 12]. Такие условия создавали определенный базовый уровень синтеза ДНК. В результате сравнение синтеза ДНК в отсутствие исследуемого металла (присутствует только 250 мкМ Mg2+ - дорожка 1 на всех электрофо-реграммах) с синтезом ДНК в присутствии заданной концентрации исследуемого металла (250 мкМ Mg2+ и X мкМ исследуемого металла) дает адекватное представление обо всех вызванных изучаемым металлом изменениях в процессах синтеза ДНК. В зависимости от оказываемого влияния на ДНК-полимеразную активность все двухвалентные катионы металлов разделены на несколько условных групп.
Катионы металлов, активирующие образование всего спектра продуктов синтеза ДНК. Первоначально нами была исследована зависимость синтеза ДНК от концентрации Mg2+ в реакционной среде. Анализ полученных данных показал, что с увеличением концентрации катионов этого металла происходит плавное повышение ДНК-полимеразной активности (рис. 1, а, г). При максимальной концентрации Mg2+ (5 мМ) образовалось приблизительно в 6 раз больше продуктов синтеза, чем при базовой концентрации (т. е. в присутствии 250 мкМ Mg2+). Следует отметить, что увеличение количества всего спектра продуктов синтеза ДНК (от 18- до 30-членного олигонуклеоти-да) происходило равномерно. Это указывает на существование баланса между работой дистрибутивных и процессивных ДНК-полимераз в данных условиях.
_0,25 тМ Мд_
Мд,
тМ 0 0,05 0,2 0,4 0,7 1 2,5 5
_0,25 тМ Мд_
Мд,
тМ 0 0,05 0,2 0,4 0,7 1 2,5
_0,25 тМ Мд_
Мд,
тМ 0 0,05 0,2 0,4 0,7 1 2,5 5
Концентрация металла, тМ — Мд —■— Мп а Со
Рис. 1. Влияние ионов, активирующих образование всего спектра продуктов синтеза ДНК, на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток мозга мыши.
Электрофореграмма продуктов синтеза ДНК в присутствии: а - Mg2+, б - Мп2+, в - Со2+, г - графическое изображение зависимости интенсивности синтеза ДНК от концентрации двухвалентного катиона металла (вычислено на основании электрофореграмм а, б, в, за 100% взята интенсивность
синтеза на базовом уровне в присутствии только 250 мкМ Mg2+ - дорожка 1).
Кроме Mg2+, из всех проверенных катионов металлов способностью активировать образование всего спектра продуктов синтеза ДНК обладали ионы еще двух металлов - Мп2+ и Со2+ (рис. 1, б, в).
Присутствие Мп2+ в реакционной смеси даже в минимальной концентрации приводило к значительному увеличению ДНК-полимеразной активности (см. рис. 1, б, г). Это позволяет сделать вывод, что Мп2+ в низких концентрациях способен активировать синтез ДНК эффективнее, чем Mg2+. Как видно на электро-фореграмме (см. рис. 1б), при концентрациях Мп2+ от 50 до 200 мкМ усиливалось образование всего спектра продуктов синтеза ДНК. Дальнейшее повышение концентрации данного металла усиливало в основном дистрибутивный синтез ДНК, о чем свидетельствует резкое увеличение количества коротких продуктов
синтеза с включением в праймер от 1 до нескольких нуклеотидов. Добавление Со2+ в реакционную среду приводило к активации синтеза ДНК, почти неотличимой от обусловленной Mg2+ активации, с равномерным увеличением всего спектра продуктов синтеза (см. рис. 1 в, г). Данный результат позволяет утверждать, что Со2+ является эффективным активатором синтеза ДНК.
Катионы металлов, активирующие дистрибутивный синтез ДНК. Иную ситуацию наблюдали при проведении реакции элонгации радиоактивно меченного праймера в присутствии Cd2+ и 2п2+. При увеличении концентраций этих металлов до 1 мМ они значительно усиливали образование продуктов синтеза ДНК. Однако данное увеличение ДНК-полимеразной активности обусловлено в основном образованием
0,25 mM Мд
Мд, тМ
_0,25 тМ Мд_
0 0,05 0,2 0,4 0,7 1 2,5 5
-1-г
2 4
Концентрация металла, тМ
Cd
Zn
Рис. 2. Влияние ионов, активирующих дистрибутивный синтез ДНК, на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток мозга мыши.
Электрофореграмма продуктов синтеза ДНК в присутствии: а - Cd2+, б - Zn2+, в - графическое изображение зависимости интенсивности синтеза ДНК от концентрации двухвалентного катиона металла (вычислено на основании
электрофореграмм а и б, за 100% взята интенсивность синтеза на базовом уровне в присутствии только 250 мкМ Mg2+ - дорожка 1).
продуктов с включенными в праймер 1-2 нуклео-тидами (Сё2+) или 1-4 нуклеотидами (2п2+) (рис. 2). В обоих случаях накопление продуктов с включенными 5-13 нуклеотидами почти не происходило. Данные факты свидетельствуют о том, что Сё2+ и 2п2+ способны к активации только дистрибутивного синтеза, не влияя на процессивный синтез, обеспечиваемый на базовом уровне М§2+. Также в обоих случаях большие концентрации этих металлов приводили к ослаблению и полному подавлению синтеза ДНК.
Катионы металлов, не оказывающие существенного влияния на ДНК-полимеразную активность. К этой группе отнесены двухвалентные катионы металлов, присутствие которых в реакционной смеси не приводило к значительным изменениям активности синтеза ДНК. К ним принадлежит №2+, обусловливавший незначительную активацию синтеза ДНК, а также Са2+ и Си2+, приводившие к снижению образования продуктов синтеза ДНК приблизительно в 2-3 раза (рис. 3). Отсутствие существенной активации синтеза ДНК наряду с ингибирующим воздействием указывает на отсутствие ДНК-полимераз, способных эффективно использовать данные катионы металлов в качестве кофакторов. Стоит также отметить, что снижение активности синтеза ДНК приблизительно в 2 раза в присутствии даже минималь-
ной концентрации Ca2+, по-видимому, свидетельствует об относительно специфическом ингибировании процессов синтеза ДНК этим катионом.
Влияние двухвалентных катионов металлов на точность синтеза ДНК. В результате реакции элонгации радиоактивно меченного праймера образуется набор продуктов, различающихся по количеству включенных нуклеотидов. Эти продукты в ходе электрофореза разделяются на отдельные полосы. Наличие на электрофореграммах дополнительных минорных полос указывает на образование продуктов с некорректно включенными нуклеотидами. С помощью программы Image Quant нами были проанализированы все полученные электрофореграммы. Данные представлены в виде таблицы, отображающей влияние двухвалентных катионов металлов на образование продуктов синтеза ДНК с некорректно включенными нуклеотидами (см. таблицу). По результатам анализа из всех проверенных металлов Mn2+ обладал наибольшей способностью снижать точность синтеза ДНК (активировать некорректный синтез ДНК). Кроме того, данный металл вызывал наибольшее снижение точности синтеза при относительно низких концентрациях (200-700 мкМ), в то время как у Mg2+ наибольшее снижение точности синтеза ДНК прояв-
_0,25 m M Mg_
0 0,05 0,2 0,4 0,7 1 2,5 5
0,25 mM Mg
5 6 7 8
0,25 тМ Mg
S 180-
2 4
Концентрация металла, mM
• Ni ■ Ca a Си
Рис. 3. Влияние ионов, не оказывающих существенного влияния на ДНК-полимеразную активность, в экстрактах клеток мозга мыши. Электрофореграмма продуктов синтеза ДНК в присутствии: а - Ni2+, б - Ca2+, в - Cu2+, г - графическое изображение зависимости интенсивности синтеза ДНК от концентрации двухвалентного катиона металла (вычислено на основании электрофореграмм а, б, в, за 100% взята интенсивность синтеза на базовом уровне в присутствии только 250 мкМ Mg2+ - дорожка 1).
ляется лишь при максимальных концентрациях (см. таблицу). Из всех остальных двухвалентных катионов металлов незначительной способностью активи-
Таблица
Влияние двухвалентных катионов металлов на образование продуктов синтеза ДНК с некорректно включенными нуклео-тидами
Ион
Продукты синтеза ДНК с некорректно включенными нуклеотидами, %
Концентрация иона, при которой отмечается наибольшее включение некорректных нуклеотидов, мМ
Mg2+
Mn2+
Co2+
Cd2+
Zn2+
Ni2+
Ca2+
Cu2+
2,5 9 < 1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1
5
0,4 0,7
ровать включение некорректных нуклеотидов обладал только Со2+. Данный металл характеризуется ярко выраженной способностью агрегировать ДНК, что на электрофореграмме проявляется в образовании шме-ров ДНК при 5 мМ Со2+ (см. рис. 1 в).
Примечательно, что эффект активации некорректного синтеза ионами марганца достаточно четко проявляется уже при минимальной использованной концентрации этого металла (50 мкМ) (см. рис. 1). Визуально данный некорректный синтез ДНК на электрофоре-граммах особенно четко проявляется в виде второй полосы, идущей чуть медленнее 18-членного продукта. Основная (нижняя) полоса отражает продукт корректного включения А-нуклеотида напротив Т-матрицы. Минорная (верхняя) полоса отражает включение некорректного нуклеотида напротив Т-матрицы, что и обусловливает более медленное движение образовавшегося продукта. Способностью предпочтительнее встраивать некорректный G-нуклеотид напротив Т-матрицы, создавая подобного рода мутацию, харак-
0,25 mM Mg
0,25 тМ Mg
Рис. 4. Влияние концентрации Mg2+ и Mn2+ на ДНК-полимеразную активность в экстрактах клеток мозга мыши 129-й линии, характеризующейся нонсенс-мутацией в гене, кодирующем Pol i.
теризуется одна из самых неточных ДНК-полимераз - ДНК-полимераза йота (Pol i) [18, 29]. Данный фермент способен избирательно встраивать G-нуклеотид напротив Т-матрицы даже в присутствии избытка комплементарного dATP. Это свойство было отмечено как для гомогенных препаратов Pol i [18, 29], так и для фермента в составе ДНК-синтезирующей системы экстрактов клеток [19, 23] с помощью ранее нами полученного аптамера. Кроме того, известно, что ДНК-синтезирующая активность Pol i в присутствии Mn2+ очень сильно увеличивается [1, 10].
ДНК-полимеразная активность в экстрактах клеток мозга 129-й линии мышей. Следующей нашей целью было выяснение, обусловлено ли усиление некорректного синтеза ДНК в присутствии Mn2+ активацией Pol i. Для этого были проведены реакции элонгации радиоактивно меченного праймера с экстрактами клеток мозга 129-й линии мышей [24], характеризующейся нонсенс-мутацией в гене, кодирующем Pol i (рис. 4). Активация синтеза ДНК в присутствии Mg2+ и Mn2+ в экстрактах клеток мозга 129-й линии мышей была абсолютно такой же, как и в экстрактах мышей линии C57Bl без мутации в гене pol i. Единственным отличием было то, что в экстрактах клеток мозга 129-й линии мышей некорректная ДНК-полимеразная активность практически полностью отсутствовала (см. рис. 1 и рис. 4). На основании этих данных можно предположить, что основной точкой приложения Mn2+ в усилении некорректного синтеза ДНК в экстрактах клеток мышей линии C57Bl является повышение некорректной активности Pol i.
Как показало наше исследование, Mn2+ провоцирует наибольшее снижение точности синтеза ДНК в экстрактах клеток даже при относительно низких концентрациях (см. таблицу). Содержание Mn2+ в клетке регулируется сложными процессами, контролирующими поступление в клетку ионов этого металла, его депонирование в клетке и удаление из клетки [2, 27]. Баланс данных процессов обеспечивает необходимый уровень Mn2+ для нормального функционирования всех ферментных систем, в которых он участвует. Однако данная
система поддержания концентрации Mn2+ на определенном уровне, по-видимому, не способна нормально функционировать в условиях хронического воздействия высокими дозами этого металла. В результате Mn2+ потенциально может быть задействован в качестве кофактора в ферментных системах, обычно использующих ионы других металлов, часто находящихся в значительно меньших количествах в клетках [14, 30]. Вместе с тем некоторые гомогенные препараты ДНК-полимераз, среди которых Pol ß, Pol ц, Pol X и Pol i, могут эффективно осуществлять синтез ДНК в присутствии Mn2+ [7, 8, 10, 31]. Однако для всех этих ДНК-полимераз, кроме Pol i, оптимальная концентрация Mn2+ для функционирования составляет 0,1-1 мМ, что значительно выше физиологических значений в клетках [7, 8, 31]. Следует отметить, что Pol i является единственной ДНК-полимеразой, чей оптимум активности (75 мкМ) [10] находится близко к максимальному физиологическому содержанию Mn2+ в клетке (40-50 мкМ) [3, 30].
Сравнение синтеза ДНК в экстрактах клеток мозга мышей 129-й линии (характеризуется нонсенс-мутацией в гене pol i) и линии C57Bl наглядно показывает ту значительную роль в некорректном синтезе ДНК, которую может обеспечивать Pol i при повышении концентрации марганца в клетке. Полученные в настоящей работе данные позволяют сформулировать гипотезу, согласно которой хроническое воздействие марганца на организм человека может приводить к локальной активации Pol i в клетках тканей, в которых происходит специфическое накопление этого металла. К таким тканям относятся области мозга globus pallidus и substantia nigra. Дестабилизация генома в результате активации Pol i ионами Mn2+ и усиление некорректного синтеза ДНК, вероятно, способны вызвать нарушение нормального функционирования нейронов и последующее снижение их числа в этих областях мозга. Стоит отметить, что синтез ДНК является частью таких механизмов репарации генома, как эксцизионная репарация нуклеотидов (NER), эксцизионная репарация оснований (BER) и репарация с участием гомологичной рекомбинации. Поскольку в любой живой клетке
эти процессы репарации идут интенсивно в ответ на различные повреждающие факторы как экзогенной, так и эндогенной природы, то нарушение их нормального функционирования может привести к негативным последствиям и гибели клетки. В свою очередь уменьшение числа нейронов в Mn-накапливающих областях мозга и выражается в виде симптомов манганизма и некоторых других нейродегенеративных заболеваний.
Работа выполнена при финансовой поддержке РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология») и РФФИ (гранты 13-04-00598, 13-04-00642).
Сведения об авторах: Институт молекулярной генетики РАН Лахин А.В. - мл. науч. сотр., 123182 Москва, пл. Курчатова, 2; e-mail: lahin9@mail. ru;
Тарантул В.З. - проф., зав. отделом вирусной и клеточной молекулярной генетики;
Генинг Л.В. - ст. науч. сотр., зав. сектором развития методов молекулярной генетики.
ЛИТЕРАТУРА
1. Казаков А. А., Гришина Е. Е., Тарантул В. З., Генинг Л. В. Биохимия. 2010; 75: 1031-9.
2. Aschner M., Guilarte T. R., Schneider J. S., Zheng W. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007; 221: 131-47.
3. AshD. E, Schramm V. L. J. Biol. Chem. 1982; 257: 9261-4.
4. Assem F. L., Holmes P., Levy L. S. J. Toxicol. Environ. Health B Crit. Rev. 2011; 14: 537-70.
5. BaggaP., PatelA. B. Neurochem. Int. 2012; 60: 177-85.
6. Beckman R. A., Mildvan A. S., Loeb L. A. Biochemistry. 1985; 24: 5810-17.
7. Blanca G., Shevelev I., Ramadan K. et al. Biochemistry. 2003; 42: 7467-76.
8. Domínguez O., Ruiz J. F., Lain de Lera T. et al. EMBO J. 2000; 19: 1731-42.
9. El-Deiry W. S., Downey K. M., So A. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81: 7378-82.
10. FrankE. G., Woodgate R. J. Biol. Chem. 2007; 282: 24689-96.
11. Gee J. B., Corbett R. J., Perlman J. M., Laptook A. R. Pediatr. Neurol. 2001; 25: 304-8.
12. Goldschmidt V., Didierjean J., Ehresmann B. et al. Nucleic Acids Res. 2006; 34: 42-52.
13. Greger J. L. Neurotoxicology. 1999; 20: 205-12.
14. Iyengar V., Woittiez J. Clin. Chem. 1988; 34: 474-81.
15. Keen C. L., Ensunsa J. L., CleggM. S. Met. Ions Biol. Syst. 2000; 37: 89-121.
16. Keen C. L., Ensunsa J. L., Watson M. H. et al. Neurotoxicology. 1999; 20: 213-223.
17. Kondakis X. G., Makris N., Leotsinidis M. et al. Arch. Environ. Health. 1989; 44: 175-8.
18. Kunkel T. A., Pavlov Y. I., BebenekK. DNA Repair (Amst). 2003; 2: 135-149.
19. Lakhin A. V., Kazakov A.A., Makarova A. V. et al. Nucleic Acid Ther. 2012; 22: 49-57.
20. Lehman I. R., Bessman M. J., Simms E. S., Kornberg A. J. Biol. Chem. 1958; 233: 163-70.
21. Loeb L. A., Kunkel T. A. Annu. Rev. Biochem. 1982; 51: 429-57.
22. Lucchini R. G., Martin C. J., Doney B. C. Neuromolecular. Med. 2009; 11: 311-21.
23. Makarova A. V., Grabow C., Gening L. V. et al. PLoS One. 2011; 6: e16612.
24. McDonald J. P., Frank E. G., Plosky B. S. et al. J. Exp. Med. 2003; 198: 635-43.
25. Pal P. K., Samii A., Calne D. B. Neurotoxicology. 1999; 20: 227-38.
26. Racette B. A., Antenor J. A., McGee-Minnich L. et al. Mov. Disord. 2005; 20: 492-6.
27. Rivera-Mancía S., Ríos C., Montes S. Biometals. 2011; 24: 811-25.
28. Sirover M. A., Loeb L. A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976; 70: 812-17.
29. Tissier A., McDonald J.P., Frank E.G., Woodgate R. Genes Dev. 2000; 14: 1642-50.
30. Versieck J. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1985; 22: 97-184.
31. Wang T. S., EichlerD. C., Korn D. Biochemistry. 1977; 16: 4927-34.
32. Zakour R. A., Kunkel T. A., Loeb L. A. Environ. Health Perspect. 1981; 40: 197-205.
33. Zhao F., Cai T., Liu M. et al. Toxicol. Sci. 2009; 107: 156-64.
Поступила 18.06.13
THE MANGANESE-INDUCED INFIDELITY OF THE DNA SYNTHESIS AS A POSSIBLE CAUSE OF MANGANISM
A. V. Lakhin, V. Z. Tarantul, L. V. Gening
Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
The impact of the 8 most common bivalent metal cations (Mg2+, Mn2+, Co2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+, Cu2+) on the operation of the whole complex of DNA polymerases in mice brain cell extracts was tested. A decrease in the fidelity of the DNA synthesis was observed in the presence of several metals; among them, Mn2+ caused the most significant effect. It was also demonstrated that this effect was mainly due to the DNA polymerase iota (Pol i) activity. It is well known that occupational or environmental exposure to excessive Mn could lead to development of neurodegenerative diseases (e.g., manganism). However, the molecular mechanism underlying these pathologies is still unknown. Our results suggest that the neurotoxic effect of Mn2+ may be associated with local activation of highly error-prone Pol i that increases incorrect DNA synthesis at elevated concentrations of this metal.
Key words: incorrect DNA synthesis; manganese; DNA polymerase iota
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 579.843.1:579.253].083.1:577.21.08
Н.И. Смирнова, Д.А. Агафонов, Е.Ю. Щелканова, С.П. Заднова, А.В. Черкасов, В.В. Кутырев
ГЕНОВАРИАНТЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ ЭЛЬ ТОР: ПОЛУЧЕНИЕ, МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИз
ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлены данные по экспериментальному моделированию возникновения вирулентных геновариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Показано, что полученные геноварианты по фе-но- и генотипическим свойствам не отличались от природных генетически измененных штаммов, возникших в естественной популяции возбудителя. Методами ПЦР и секвенирования установлено, что образованные в процессе конъюгации геноварианты несли в хромосоме участок генома профага CTXClass9 с геном ctxBl холерных вибрионов классического биовара. Показано, что следствием изменения структуры профага стало повышение токсигенности и вирулентности геновариантов по сравнению с типичным штаммом-реципиентом. При протеомном анализе
у геновариантов обнаружено изменение экспрессии 26 белков, выполняющих в клетке различные функции (метаболизм, энергетический обмен, транспорт аминокислот и т.д.). Эти данные указывают на влияние нового участка ДНК в геноме геновари-антов на уровень экспрессии различных генов жизнеобеспечения. Полученные результаты служат подтверждением того, что одним из механизмов формирования геновариантов в естественных популяциях возбудителя является горизонтальный перенос генов.
Ключевые слова: геноварианты возбудителя холеры; профаг СТХф; конъюгация; рекомбинанты; токсигенность; вирулентность, протеом.
