Молекулярное типирование штаммов Francisella tularensis методом мультилокусного анализа вариабельности числа тандемных повторов

Тимофеев В.С.; Кудрявцева Т.Ю.; Мокриевич Александр Николаевич; Павлов В.М.; Дятлов И.А.

В.С. Тимофеев, Т.Ю. Кудрявцева, А.Н. Мокриевич, В.М. Павлов, И.А. Дятлов МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ FRANCISELLA TULARENSIS МЕТОДОМ

мультилокусного анализа вариабельности числа тандемных

ПОВТОРОВ

ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск

Представлены результаты молекулярного типирования штаммов вида Francisella tularensis из разных регионов России и территории бывшего Советского Союза методом мультилокусного анализа вариабельности числа тандемных повторов (МЬУА) по 25 локусам. Сравнительное исследование штаммов из коллекции «ГКПМ-Оболенск» позволило дифференцировать их на подвиды и определить внутривидовые особенности, связанные с географическим местом выделения. Была определена значимость локусов, варьирование числа повторов в которых дает возможность различать подвиды внутри вида F. tularensis и локусов, с помощью которых дифференцировали штаммы внутри голарктического подвида. Среди 58 изученных штаммов голарктического подвида выявлено 42 генотипа.

Ключевые слова: туляремия; Francisella tularensis; гено-типирование, VNTR, МЬУЛ

Туляремия - зоонозная природно-очаговая особо опасная инфекция, возбудитель которой Е tularensis инфицирует более 250 видов животных и может передаваться человеку множеством способов - при прямом контакте с зараженным животным, при приеме внутрь контаминированной воды и пищи, аэрогенным путем, а также через укусы клещей, мух и комаров.

Систематическое положение возбудителя туляремии следующее: Тип ВХ11. Proteobacteria, Класс III. "gammaproteobacteria", Порядок V. ííThюtrichales", Семейство III. Еrancisellaceae, Род I. Еrancisella [3].

К роду Еrancisella относят в настоящее время 2 вида: Е. tularensis и Е. philomiragia. Однако в последнее время появились публикации, в которых изучены заболевания рыб, вызванные новыми видами фран-циселл: Еrancisella hispaniensis, Еrancsiella asiatica и Еrancsiella noatunensis (сем. Еrancisella piscicida). Сравнение последовательности гена 16S РНК возбудителей данных инфекций показывает 97% гомологии с последовательностью гена 16S РНК Еrancsiella tularensis и 98% гомологии с последовательностью гена 16S РНК Еrancsiellaphilomiragia [7, 9, 11].

Внутри вида Е. tularensis различают 4 подвида: Ш-larensis, Ио1агШса, mediasiatica и novicida.

Природные очаги туляремийной инфекции характеризуются своей стойкостью и способностью, при формировании благоприятных условий, накапливать инфекционный материал, тем самым создавая потенциальную угрозу для населения, проживающего в эндемичных районах. С расширением исследований по проблеме туляремии в разных частях земного шара выявляются новые ареалы, где обнаруживается возбудитель туляремии [13]. В странах Европы наряду с общеизвестными штаммами подвида Ио1агсИса найдены новые подвиды Е. tularensis [7] и даже было одно сообщение о выделении штамма Е. tularensis подвида tularensis [6]. До последнего времени свободными от очагов туляремии в странах Старого Света оставались Великобритания, Португалия и Исландия [12], однако в 2007 г. появилось сообщение об обнаружении методом ПЦР ДНК Е. tularensis в клинических

образцах от людей и в клещах, собранных на севере Португалии [4].

На территории бывшего Советского Союза только в 2012 г., по данным ВОЗ, случаи туляремии зарегистрированы в Новороссийске, Хмельницкой области (Украина), Вологодской, Кировской, Нижегородской областях, на территории Латвии, а в Архангельской области был введен режим чрезвычайной ситуации из-за многочисленных случаев выявления этой инфекции. На данных территориях циркулируют штаммы F. tularensis subsp. holarctica, однако индивидуальные различия геномов этих штаммов остаются практически не изученными до сегодняшнего дня.

Одним из широко используемых методов внутривидового субтипирования бактериальных штаммов F. tularensis является метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA -Multilocus VNTR-Analysis) по 25 VNTR (Variable Number Tandem Repeat) локусам, предложенный А. Johansson в 2004 г. Анализ 192 изолятов туляремийного микроба, проведенный с помощью данного метода, показал существование 120 генотипов и позволил различать как подвиды F. tularensis, так и группы и отдельные генотипы внутри подвида. Метод MLVA выявил наличие двух генетически различающихся групп внутри подвида tularensis и пяти генетически отличающихся групп среди изолятов подвида holarctica. Отдельную группу в подвиде holarctica формировали изоляты, выделенные в Японии [8]. В работе А. Johansson были использованы в основном штаммы туляремийного микроба, выделенные на территории Европы и Северной Америки.

Целью данного исследования является генотипи-рование штаммов, выделенных на территории бывшего Советского Союза, методом MLVA по 25 локусам.

Материалы и методы

В работе использованы 68 штаммов, находящихся в Государственной коллекции «ГКПМ-Оболенск», из которых 12 штаммов туляремийного микроба различного географического происхождения были получены из ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, 40 изолятов получены из ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт», 12 штаммов - из ФКУЗ «Иркутский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» и 4 изолята, выделенные в 2011 г. на территории Алтайского края, получены из ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае» и идентифицированы в референс-центре по мониторингу за туляремией ФБУН ГНЦПМБ (табл.1).

Ампулы с лиофилизированными культурами F. tularensis вскрывали, суспендировали и микробные взвеси высевали на чашки Петри с питательной средой для культивирования и выделения туляремийного микроба («FT-агар» ФБУН ГНЦПМБ, Оболенск) с добавлением полимиксина В (100 мкг/мл) и инкубировали в течение 48 ч при температуре (37+1)оС. Из каждой культуры выделяли ДНК с использованием коммерческого набора «Рибо-сорб» («Интерлабсервис», Россия) согласно инструкции производителя. Пенициллиназную (ß-лактамазную) активность для дифференциации среднеазиатских штаммов определяли с помощью крезолового красного [2].

Таблица 1

Характеристика штаммов F ШЫгет'^, использованных в работе

Вид штамма Штамм Место выделения штамма Год

Штаммы коллекции ГУ НИИЭМ им. Н.ф. Гамалеи

1 F. tularensis subsp. tularensis SCHU S4 США 1941

2 F. tularensis subsp. tularensis B399 A-Cole США 1972

3 F. tularensis subsp. tularensis 8859 США 1958

4 F. tularensis subsp. holarctica 9 Московская область 1948

5 F. tularensis subsp. holarctica 21/400 То же 1949

6 F. tularensis subsp. holarctica 15/10 Алма-Ата 1942

7 F. tularensis subsp. holarctica 503 Московская область 1949

8 F. tularensis subsp. holarctica bv. japónica Miura Япония 1975

9 F. tularensis subsp. holarctica bv. japónica Jasoe " 1974

10 F. tularensis subsp. mediasiatica 117 НИПЧИ Центральной Азии 1960

11 F. tularensis subsp. mediasiatica 120 То же 1968

12 F. tularensis subsp. novicida 112 Юта, США 1955

Штаммы, полученные из НИПЧИ г. Ставрополя

1 F. tularensis subsp. holarctica 503/840 Московская область 1949

2 F. tularensis subsp. holarctica C-4 Грузия 1975

3 F. tularensis subsp. holarctica C-7 Ставропольский край 1948

4 F. tularensis subsp. holarctica C12 То же 1973

5 F. tularensis subsp. holarctica C-13 " " 1959

6 F. tularensis subsp. holarctica 345 Мурманская область 1983

7 F. tularensis subsp. holarctica C-22 Азербайджан 1987

8 F. tularensis subsp. holarctica C-24 Грузия 1981

9 F. tularensis subsp. holarctica C-26 Калмыкия 1986

10 F. tularensis subsp. holarctica C-28 " 1984

11 F. tularensis subsp. holarctica C-30 Ставропольский край 1986

12 F. tularensis subsp. holarctica C-31 То же 1986

13 F. tularensis subsp. holarctica C-34 Краснодарский край 1989

14 F. tularensis subsp. holarctica C-36 То же 1990

15 F. tularensis subsp. holarctica C-38 Дагестан 1990

16 F. tularensis subsp. holarctica С-50 Краснодарский край 2000

17 F. tularensis subsp. holarctica C-51 То же 2000

18 F. tularensis subsp. holarctica C-55 " " 2000

19 F. tularensis subsp. holarctica C-56 " " 2000

20 F. tularensis subsp. holarctica C-58 Дагестан 1990

21 F. tularensis subsp. holarctica C-62 Краснодарский край 2002

22 F. tularensis subsp. holarctica C-64 То же 2002

23 F. tularensis subsp. holarctica C-65 " " 2002

24 F. tularensis subsp. holarctica C-66 Калмыкия 2001

25 F. tularensis subsp. holarctica C-67 " 2001

26 F. tularensis subsp. holarctica C-68 Ставропольский край 2003

27 F. tularensis subsp. holarctica C-69 То же 2003

28 F. tularensis subsp. holarctica C-70 1! II 2003

29 F. tularensis subsp. holarctica C-71 II II 2003

30 F. tularensis subsp. holarctica C-72 II II 2003

31 F. tularensis subsp. holarctica C-76 II II 2003

32 F. tularensis subsp. holarctica C-77 II II 2003

33 F. tularensis subsp. holarctica C-80 Краснодарский край 2003

34 F. tularensis subsp. holarctica C-81 То же 2003

35 F. tularensis subsp. holarctica C-82 " "

36 F. tularensis subsp. holarctica C-84 " "

37 F. tularensis subsp. holarctica C-85 " "

38 F. tularensis subsp. novicida 320 США

39 F tularensis subsp. holarctica bv. japonica J-543/6 НИПЧИ Центральной Азии

40 F. tularensis subsp. holarctica bv. japonica J-55 То же

Штаммы, полученные из НИПЧИ г. Иркутска

1 F. tularensis subsp. holarctica I-282 Читинская область

2 F. tularensis subsp. holarctica I-305 То же

З F. tularensis subsp. holarctica I-329 Республика Бурятия

4 F. tularensis subsp. holarctica I-346 То же

5 F. tularensis subsp. holarctica I-347 " "

6 F. tularensis subsp. holarctica I-349 Читинская область

7 F. tularensis subsp. holarctica I-365 Республика Бурятия

8 F. tularensis subsp. holarctica I-367 Красноярский край

9 F. tularensis subsp. holarctica I-373 Читинская область

10 F. tularensis subsp. holarctica I-382 Республика Бурятия

11 F. tularensis subsp. holarctica I-387 Новосибирская область

12 F. tularensis subsp. holarctica I-388 То же

Изоляты, полученные из Алтайского края

1 F. tularensis subsp. mediasiatica А-554 Алтайский край

2 F. tularensis subsp. mediasiatica А-678 То же

З F. tularensis subsp. mediasiatica А-823 и и

4 F. tularensis subsp. holarctica А-1045 и и

Описание метода и последовательность используемых прай-меров (Ft-M1-Ft-M25) и параметры проведения ПЦР приведены в статье [8]. Амплификацию проводили в термоциклере «Apllied Biosystem 2700» (США). Для электрофореза ДНК в 3% агароз-ном геле при градиенте напряжения 9 В/см в течение 5 ч использовали горизонтальную камеру MultiSUB Screen («Cleaver Scientific») и источник тока Эльф-4 («ДНК-Технология»). Размер ампликонов вычисляли с помощью программы PhotoCaptMw («Vilber Lourmat») по положению полос в геле относительно молекулярных маркеров («Bio-Rad», 170-53810). Размер ампликонов с локусами Ft-M1 и Ft-M25 определяли секвенированием.

Кластерный анализ проводили методом невзвешенного попарного арифметического среднего (UPGMA - Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average), который часто используется для филогенетических построений [10].

Результаты и обсуждение

Типирование штаммов вида F. tularensis методом MLVA по 25 локусам позволило нам идентифицировать 51 генотип среди 68 проанализированных штаммов, находящихся в Государственной коллекции «ГКПМ-Оболенск», что говорит о высокой разрешающей способности данного метода.

Анализ филогенетического дерева (рис. 1) показал, что штаммы каждого подвида формируют группу. Среди проанализированных штаммов основную часть (58 из 68) составляют штаммы подвида holarctica. Особенностью штаммов этого подвида является отсутствие в их геномах повторов локуса Ft-M19. Отдельный кластер объединяет штаммы, принадлежащие к подвиду holarctica биовар japónica (Miura, Ja-soe, J-543/6 и J-55). Штаммы J-543/6 и J-55 идентичны по всем 25 локусам и обладают ß-лактамазной активностью. Штаммы подвида tularensis В-399, Schu S4 и 8859 также сгруппированы в отдельный кластер.

2007 2007 2007 1955 1965 1973

1971

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1972

1973 1077 1977 1977

1988

1989 1989 1991 2010 2011

2011 2011 2011 2011

Отдельный кластер образуют штаммы 120, 117, А-554, А-678 и А-823, принадлежащие к подвиду mediasiatica. Все проанализированные штаммы среднеазиатского подвида не обладают Р-лактамазной активностью, что является характерной особенностью этого подвида [2]. Штаммы А-554 и А-678 идентичны по всем 25 локусам. MLVA нуклеотидной последовательности генома штамма FSC147 in silico позволил отнести его в общую группу со штаммами 117 и 120,

Таблица 2

Количество повторов в гипервариабельном локусе Ft-МЭ в геномах штаммов подвида holarctica, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока

Номер штамма F. tularensis subsp. holarctica Место выделения штамма Число повторов

1-282 Читинская область 9

1-305 То же 9

1-329 Республика Бурятия 21

1-346 То же 11

1-347 То же 11

1-349 Читинская область 13

1-365 Республика Бурятия 11

1-367 Красноярский край 27

1-373 Читинская область 14

1-382 Республика Бурятия 15

1-387 Новосибирская область 7

1-388 То же 21

Strain Subspecies Location

■ 112 novicida USA, Utah

■ 320 novicida USA

♦ Jasoe holarctica bv. japónica Japan

♦ Miura holarctica bv. japónica Japan

♦ J-543/6 holarctica bv. japónica ND

♦ J-55 holarctica bv. japónica ND

C-81 holarctica Krasnodar Territory

C-82 holarctica Krasnodar Territory

C-84 holarctica Krasnodar Territory

C-85 holarctica Krasnodar Territory

C-71 holarctica Stavropol Territory

C-76 holarctica Stavropol Territory

C-77 holarctica Stavropol Territory

C-55 holarctica Krasnodar Territory

C-58 holarctica Dagestan

C-64 holarctica Krasnodar Territory

C-65 holarctica Krasnodar Territory

C-68 holarctica Stavropol Territory

C-69 holarctica Stavropol Territory

C-31 holarctica Stavropol Territory

C-51 holarctica Krasnodar Territory

C-13 holarctica Stavropol Territory

C-70 holarctica Stavropol Territory

C-12 holarctica Stavropol Territory

C-38 holarctica Dagestan

C-80 holarctica Krasnodar Territory

C-30 holarctica Stavropol Territory

C-72 holarctica Stavropol Territory

C-24 holarctica Georgia

503/840 holarctica Moscow region

C-56 holarctica Krasnodar Territory

C-4 holarctica Georgia

C-7 holarctica Stavropol Territory

345 holarctica Murmansk region

C-36 holarctica Krasnodar Territory

C-34 holarctica Krasnodar Territory

C-26 holarctica Kalmykia

C-28 holarctica Kalmykia

C-22 holarctica Azerbaijan

C-62 holarctica Krasnodar Territory

C-66 holarctica Kalmykia

C-67 holarctica Kalmykia

C-50 holarctica Krasnodar Territory

LVS holarctica USA

503 holarctica Moscow region

9 holarctica Moscow region

21/400 holarctica Moscow region

15 holarctica Live vaccine strain

I-329 holarctica Buryat Republic

I-382 holarctica Buryat Republic

I-282 holarctica Chita region

I-305 holarctica Chita region

A-1045 holarctica Altai Territory

I-367 holarctica Krasnoyarsk Territory

I-373 holarctica Chita region

I-347 holarctica Buryat Republic

I-365 holarctica Buryat Republic

I-346 holarctica Buryat Republic

I-387 holarctica Novosibirsk region

I-388 holarctica Novosibirsk region

I-349 holarctica Chita region

117 mediasiatica Middle Asia

120 mediasiatica Middle Asia

FSC 147 mediasiatica Middle Asia

A-554 mediasiatica Altai Territory

A-678 mediasiatica Altai Territory

A-823 mediasiatica Altai Territory

Рис. 1. Кластеризация штаммов F. tularensis методом UPGMA по 25 локусам.

Положение штаммов LVS и FSC147 определено in silico по анализу нуклеотидных последовательностей геномов этих штаммов, взятых из базы

данных NCBI (NC_007880.1 для LVS и NC_010677.1 для FSC147).

Strain Subspecies Location

♦ Jasoe holarctica bv. japonica Japan

♦ Miura holarctica bv. japonica Japan

♦ J-543/6 holarctica bv. japonica ND

J-55 holarctica bv. japonica ND

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

C-81 holarctica Krasnodar Territory

C-82 holarctica Krasnodar Territory

C-84 holarctica Krasnodar Territory

C-85 holarctica Krasnodar Territory

C-71 holarctica Stavropol Territory

C-76 holarctica Stavropol Territory

C-77 holarctica Stavropol Territory

C-55 holarctica Krasnodar Territory

C-58 holarctica Dagestan

C-64 holarctica Krasnodar Territory

C-65 holarctica Krasnodar Territory

C-68 holarctica Stavropol Territory

C-69 holarctica Stavropol Territory

C-31 holarctica Stavropol Territory

C-51 holarctica Krasnodar Territory

C-13 holarctica Stavropol Territory

C-70 holarctica Stavropol Territory

C-12 holarctica Stavropol Territory

C-38 holarctica Dagestan

C-80 holarctica Krasnodar Territory

C-30 holarctica Stavropol Territory

C-72 holarctica Stavropol Territory

C-24 holarctica Georgia

503/840 holarctica Moscow region

C-56 holarctica Krasnodar Territory

C-4 holarctica Georgia

C-7 holarctica Stavropol Territory

345 holarctica Murmansk region

C-36 holarctica Krasnodar Territory

C-34 holarctica Krasnodar Territory

C-26 holarctica Kalmykia

C-28 holarctica Kalmykia

C-22 holarctica Azerbaijan

C-62 holarctica Krasnodar Territory

C-66 holarctica Kalmykia

C-67 holarctica Kalmykia

C-50 holarctica Krasnodar Territory

LVS holarctica USA

503 holarctica Moscow region

9 holarctica Moscow region

15 holarctica Live vaccine strain

21/400 holarctica Moscow region

I-329 holarctica Buryat Republic

I-382 holarctica Buryat Republic

I-282 holarctica Chita region

I-305 holarctica Chita region

A-1045 holarctica Altai Territory

I-367 holarctica Krasnoyarsk Territory

I-373 holarctica Chita region

I-347 holarctica Buryat Republic

I-365 holarctica Buryat Republic

I-346 holarctica Buryat Republic

I-387 holarctica Novosibirsk region

I-388 holarctica Novosibirsk region

I-349 holarctica Chita region

112 novicida USA, Utah

320 novicida USA

117 mediasiatica Middle Asia

120 mediasiatica Middle Asia

FSC 147 mediasiatica Middle Asia

A-554 mediasiatica Altai Territory

A-678 mediasiatica Altai Territory

A-823 mediasiatica Altai Territory

Рис. 2. Кластеризация штаммов F. tularensis методом UPGMA по 17 локусам.

Strain Subspecies Location

112 novicida USA, Utah

320 novicida USA

J-543/6 holarctica bv japónica ND

J-55 holarctica bv japónica ND

C-30 holarctica Stavropol Territory

C-67 holarctica Kalmykia

LVS holarctica USA

15 holarctica Live vaccine strain

21/400 holarctica Moscow region

345 holarctica Murmansk region

503 holarctica Moscow region

503/840 9 holarctica holarctica Moscow region Moscow region

A-1045 holarctica Altai Territory

C-12 holarctica Stavropol Territory

C-13 holarctica Stavropol Territory

C-22 holarctica Azerbaijan

C-24 holarctica Georgia

C-26 holarctica Kalmykia

C-28 holarctica Kalmykia

C-31 holarctica Stavropol Territory

C-34 holarctica Krasnodar Territory

C-36 holarctica Krasnodar Territory

C-38 holarctica Dagestan

C-4 holarctica Georgia

C-50 holarctica Krasnodar Territory

C-51 holarctica Krasnodar Territory

C-55 holarctica Krasnodar Territory

C-56 holarctica Krasnodar Territory

C-58 holarctica Dagestan

C-62 holarctica Krasnodar Territory

C-64 holarctica Krasnodar Territory

C-65 holarctica Krasnodar Territory

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

C-66 holarctica Kalmykia

C-68 holarctica Stavropol Territory

C-69 holarctica Stavropol Territory

C-7 holarctica Stavropol Territory

C-70 holarctica Stavropol Territory

C-71 holarctica Stavropol Territory

C-72 holarctica Stavropol Territory

C-76 holarctica Stavropol Territory

C-77 holarctica Stavropol Territory

C-80 holarctica Krasnodar Territory

C-81 holarctica Krasnodar Territory

C-82 holarctica Krasnodar Territory

C-84 holarctica Krasnodar Territory

C-85 holarctica Krasnodar Territory

I-282 holarctica Chita region

I-305 holarctica Chita region

I-329 holarctica Buryat Republic

I-346 holarctica Buryat Republic

I-347 holarctica Buryat Republic

I-349 holarctica Chita region

I-365 holarctica Buryat Republic

I-367 holarctica Krasnoyarsk Territory

I-373 holarctica Chita region

I-382 holarctica Buryat Republic

I-387 holarctica Novosibirsk region

I-388 holarctica Novosibirsk region

Jasoe holarctica bv japónica Japan

Miura holarctica bv. japónica Japan

117 mediasiatica Middle Asia

120 mediasiatica Middle Asia

FSC 147 mediasiatica Middle Asia

★ A-554 mediasiatica Altai Territory

★ A-678 mediasiatica Altai Territory

★ A-823 mediasiatica Altai Territory

Рис. 3. Кластеризация штаммов F. tularensis методом UPGMA по 6 локусам.

что согласуется с тем, что эти штаммы выделены в одном регионе, хотя и в разное время. Группа штаммов Е tularensis subsp. novicida образует также отдельный кластер.

Информативность и значимость использованных для построения филогенетического дерева 25 локусов не одинаковы. Количество повторов в 8 локусах - Ft-М1, Ft-М9, Ft-М11, Ft-М14, Ft-М15, Ft-М16, Ft-М19, Ft-М23 - неизменно для всех исследованных в данной работе голарктических штаммов, и их использование не дает никакой информации о вариабельности штаммов внутри этого подвида. На избыточность использования 25 локусов указывает тот факт, что ден-дрограмма, построенная по оставшимся 17 локусам, практически идентична таковой, построенной по данным 25 локусов (рис. 2).

Количество повторов в гипервариабельном локу-се Ft-М3 изменяется от штамма к штамму в пределах от 3 до 63, что позволяет с его помощью различать штаммы, выделенные из одного географического района (табл. 2), и, возможно, проследить распространение конкретного штамма во времени и пространстве (см. рис. 1 и 2).

Данные о количестве повторов в локусах Ft-М1, Ft-М9, Ft-М15, Ft-М16, Ft-М19, Ft-М20 в геномах штаммов Е. tularensis позволяют разделить их на подвиды (рис. 3).

Анализ штаммов Е. tularensis subsp. holarctica как по 25, так и по 17 локусам, позволил выявить корреляцию между генетическими группами и регионами выделения штаммов (см. рис. 1 и 2). Эти группы можно условно назвать «московская», «ставропольская» и «иркутская», причем к последней принадлежит и изолят А1045, выделенный в Алтайском крае.

Штаммы «московской» группы отличаются от штаммов из других групп тремя повторами в локусах Ft-M17 и Ft-M18. Штаммы «ставропольской» группы характеризуются двумя повторами в локусе Ft-Ml7. Различия штаммов из «иркутской» группы более значительны и включают по одному повтору Ft-M2, Ft-M8 и Ft-M17, по 2 повтора Ft-M21, по 3 повтора Ft-M6 и Ft-M22, при этом штаммы, выделенные на территории Новосибирской области, образуют отдельную подгруппу, так как в геноме имеют по 5 повторов в локусе Ft-M22.

Сравнение штаммов внутри подвида ^1агсИса выявило также 8 групп штаммов, идентичных по 25 локусам, поэтому вероятно, что они имеют общее происхождение. Эти группы штаммов отличаются друг от друга только по количеству повторов в гипервариабельном локусе Ft-M3. Это изоляты, выделенные в 2003 г. в Ставропольском крае (С- 71, С-76, С-77), содержащие в геноме 15 повторов в локусе Ft-M3; в 2003 и 2007 гг. - в Краснодарском крае (С-81, С-82, С-84, С-85), содержащие в геноме 10 повторов в локусе Ft-М3; выделенные в разные годы в Ставропольском крае (С-13, С-70), содержащие в геноме 14 повторов в Ft-M3 локусе; один и тот же генотип обнаружен в Краснодарском, Ставропольском краях и Дагестане (С-55, С-58, С-64, С-65, С-68, С-69) - 11 повторов в локусе Ft-M3; идентичны штаммы С-31 и С-51, содержащие в геноме 12 повторов в локусе Ft-M3.

Идентичные штаммы (С-26 и С-28), обнаруженные в Калмыкии, отличаются от описанных выше групп по маркерам Ft-M3 и Ft-M6.

Среди «иркутских» штаммов идентичны 2 пары штаммов: 1-282 и 1-305, а также 1-347 и 1-365. Территориальная и генетическая общность «иркутских» штаммов и изолята А-1045, выявленного на территории Алтайского края, позволяет выделить отдельно сибирскую популяцию возбудителя туляремии подвида ЫШгсЫса.

MLVA нуклеотидной последовательности генома штамма LVS т silico относит его к «ставропольской» группе штаммов, тогда как вакцинный штамм 15 принадлежит к «московской» группе. Данный факт является неожиданным, так как, по данным литературы, LVS является субклоном или штамма 15 (восстановленного), или вакцинного штамма 155 [5]. Возможным объяснением несовпадения генотипов штаммов 15 и LVS может являться то, что LVS был получен из штамма 155, а не из штамма 15. Другим объяснением этого факта могут быть ошибки в нуклеотидной последовательности генома LVS, помещенной в базу данных КСВ1.

Штаммы А-554, А-678 и А-823 относятся к среднеазиатскому подвиду. При этом штаммы А-554 и А-678 являются генетически идентичными по 25 VNTR-локусам, а штамм А-823 отличается от них по количеству повторов в 3 локусах ^-М3, Ft-M7 и Ft-М20), в том числе в гипервариабельном локусе Ft-M3, позволяющем выявлять различия между близкородственными штаммами. Следует отметить, что различия по количеству повторов между штаммами А-554, А-678 и А-823 меньше, чем с двумя другими представленными в коллекции ФБУН ГНЦПМБ штаммами среднеазиатского подвида туляремийного микроба (117 и 120). Данное наблюдение демонстрирует наличие в Алтайском крае генетически обособленной популяции Е. tularensis subsp. mediasiatica, ареал распространения которой территориально перекрывается с западной частью ареала распространения сибирских штаммов голарктической расы туляремийного микроба. Выделение культур туляремийного микроба подвида mediasiatica на территории Российской Федерации может свидетельствовать либо о дрейфе среднеазиатских штаммов в сторону Сибири, либо о слабой изученности очагов туляремии на территории Сибири.

Штаммы 112 и 320 подвида novicida резко отличаются от штаммов других подвидов отсутствием амплификации локусов Ft-M7, Ft-M9 и Ft-M23. В геномах этих штаммов выявлено по 30 повторов в локусе Ft-M20, в то время как у остальных изученных нами штаммов в данном локусе обнаружено от 3 до 12 повторов.

Метод анализа вариабельности числа повторов по 25 локусам ^-М1 - Ft-M25) позволил нам выделить 42 генотипа среди 58 голарктических штаммов туляремийного микроба, выделенных на территории бывшего Советского Союза. В 2004 г. среди 96 изо-лятов подвида ко1агсИса, выделенных на территории Европы и Азии, было также обнаружено 42 генотипа с помощью метода MLVA [8]. В работе А.С. Водопьянова и соавт. с использованием четырех пар прайме-ров на локусы FtА (гипервариабельный локус Ft-M3), FtВ ^-М5), FtС(Ft-M6) и FtD, среди 332 штаммов голарктического подвида было обнаружено 43 генотипа. Однако применение этого набора праймеров не

позволяет разделять штаммы по подвидам, так как в один и тот же кластер попадают штаммы из разных географических зон [1].

Проведенный нами анализ выявил 51 генотип среди 68 исследованных штаммов F. tularensis и показал наличие в коллекции «ГКПМ-Оболенск» штаммов, идентичных по 25 локусам. Определены локусы, варьирование числа повторов в которых позволяет различать штаммы по небольшим вариациям внутри подвида holarctica.

Таким образом, генотипирование штаммов F. tularensis, изолированных в основном на территории бывшего Советского Союза, методом MLVA по 25 локусам, позволяет: 1) проводить подвидовую идентификацию штаммов; 2) определять внутри подвида особенности штаммов, связанные с их географическим происхождением; 3) выявлять тонкие генетические различия штаммов внутри кластера.

Авторы выражают благодарность М.Е. Платонову за оказанную помощь в компьютерной обработке данных.

Работа выполнена по государственному контракту № 37-Д от 30.05.2012 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2014 гг.)».

Сведения об авторах:

Мокриевич Александр Николаевич - зав. отделом осо-бо опасных инфекций ФБУН ГНЦПМБ Роспотребнад-зора; 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, Оболенск, e-mail: [email protected].

ЛИТЕРАТУРА

1. Водопьянов А.С., Мишанькин Б.Н., Павлович Н.В., Пичурина

Н.Л. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.

2007; 2: 33-40.

2. Павлович Н.В., Мишанькин Б.И. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1992; 11-12: 5-7.

3. BrennerD.J., KreigN.R., Staley J.T., Garrity G.M. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. 2-ed. 2005; 2, B: 199-210.

4. de Carvalho I.L., Escudero R., Garcia-Amil C. et al. Emerg. Infect. Dis. 2007; 13(4): 666-7.

5. Ellis J., Oyston P.S.F., Green M., Titball R.W. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15(4): 631-6.

6. GurycovaD. Eur. J. Epidemiol. 1998; 4: 797-802.

7. HuberB., Escudero R., BusseH.J. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010; 60: 1887-96.

8. Johansson A., Farlow J., Larsson P. et al. J. Bacteriol. 2004; 186: 5808-18.

9. Mikalsen J., ColquhounD. J. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009.

10. Sneath P.H.A., Sokal R.R. In.: Numerical taxonomy. San Francisco CA, Freeman; 1973: 53-60.

11. SotoE, Hawke J., FernandezD, Morales J.D. J. Fish Dis. 2009; 32: 713-22.

12. Tarnvik A., Priebe H-S., Grunow R. Scand. J. Infect. Dis. 2004; 36: 350-5.

13. WhippM.J., Davis G.M., Lum G. et al. Microbiol. 2003; 52: 839-42.

Поступила 01.04.13

FRANCISELLA TULARENSIS STRAINS MOLECULAR TYPING USING THE MULTIPLE-LOCUS VARIABLE-NUMBER TANDEM REPEAT ANALYSIS

V. S. Timofeev, T. Y. Kudryavtseva, A. N. Mokrievich, V. M. Pavlov, and I. A. Dyatlov

State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russia

Variable-number tandem repeat analysis (VNTR) of 25 loci was used for molecular typing of the Francisella tularensis strains isolated from different regions of Russia and the former Soviet Union. This approach allowed us to subdivide F. tularensis subspecies and determine genotype diversity with regard to the geographical prevalence. All 25 loci were examined for their ability to discriminate subspecies and local geographical group. 42 genotypes among the 58 investigated F. tularensis subsp. holarctica isolates were found using cluster VNTR analysis. Key words: tularemia, Francisella tularensis, genotyping, VNTR, MLVA

А.В. Лахин, В.З. Тарантул, Л.В. Генинг ИНДУЦИРОВАННЫЙ МАРГАНЦЕМ НЕКОРРЕКТНЫЙ СИНТЕз ДНК КАК

возможная причина манганизма

ФГБУ науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва

Изучено влияние 8 наиболее биологически значимых двухвалентных катионов металлов: Mg2+, Mn2+, Co2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+ и Cu2+ на функционирование всего комплекса ДНК-полимераз в экстрактах клеток мозга мышей. В присутствии некоторых катионов металлов отмечено снижение точности синтеза ДНК и среди них наиболее значимое снижение вызывали ионы Mn2+. Показано также, что этот эффект главным образом обусловлен функционированием ДНК-полимеразы йота (Pol i). Известно, что избыточное поступление марганца в организм из окружающий среды может привести к развитию некоторых нейродегене-ративных заболеваний, таких как манганизм. Молекулярные механизмы, лежащие в основе данных патологий, до сих пор остаются неизвестными. На основании полученных в работе данных выдвинуто предположение, что нейротоксический эффект марганца может быть связан с локальной активацией высокоошибочной Pol i, вызывающей усиление некорректного синтеза ДНК при повышенных концентрациях ионов этого металла. Ключевые слова: некорректный синтез ДНК; марганец; ДНК-полимераза йота

Вследствие загрязнения почвы и воздуха отходами химической, горнодобывающей и металлургической промышленности в продуктах растениеводства и животноводства наблюдается накопление больших количеств металлов, в норме встречающихся редко. Потребление таких продуктов может вызывать накопление в организме человека опасных для здоровья концентраций этих металлов. В большом числе исследований показано, что многие металлы, в норме являющиеся необходимыми микроэлементами, в повышенных концентрациях могут быть токсичными для клеток эукариот.

Одним из важнейших микроэлементов, необходимым в качестве кофактора для нормального функционирования целого ряда ферментов, является марганец [13, 15, 16]. Интоксикация марганцем у человека ассо-

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Тимофеев В. С., Кудрявцева Т. Ю., Мокриевич Александр Николаевич, Павлов В. М., Дятлов И. А.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Тимофеев В. С., Кудрявцева Т. Ю., Мокриевич Александр Николаевич, Павлов В. М., Дятлов И. А.

Текст научной работы на тему «Молекулярное типирование штаммов Francisella tularensis методом мультилокусного анализа вариабельности числа тандемных повторов»